Summary
Doux, faible puissance, biomoléculaire memristors tirer parti même composition, structure et mécanismes de bio-synapses de commutation. Présenté ici un protocole d’assembler et de caractérisation biomoléculaire memristors provient des bicouches lipidiques formés entre les gouttelettes d’eau dans l’huile d’isolation. L’incorporation des résultats de peptides activés par tension alaméthicin memristive conductance ionique à travers la membrane.
Abstract
La capacité de recréer les fonctionnalités synaptiques en éléments de circuits synthétique est essentielle pour neuromorphic informatique systèmes qui cherchent à imiter les compétences cognitives du cerveau avec densité et une efficacité comparable. A ce jour, trois bornes transistors à base de silicium et deux bornes memristors ont été largement utilisé dans les circuits de neuromorphic, en grande partie en raison de leur capacité de co-implantation de mémoire et traitement de l’information. Pourtant, ces dispositifs ne peuvent pas atteindre l’interconnectivité et la complexité du cerveau, parce qu’ils sont avides de pouvoir, ne parviennent pas à imiter principales fonctionnalités synaptiques et souffrent de bruit élevé et haute tensions de commande. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé et caractérisé un memristor biomoléculaire qui imite la composition, structure et caractéristiques de commutation de synapses biologiques. Ici, les auteurs décrivent le processus d’assemblage et caractérisation biomoléculaire memristors consistant en une double couche lipidique 5 nm d’épaisseur formée entre les gouttelettes lipidiques fonctionnalisés dans l’huile et dopé avec des peptides alaméthicin activé par tension. Alors que des protocoles comparables de l’Assemblée ont été utilisés pour étudier les propriétés biophysiques de membranes soutenus par gouttelettes lipidiques et des canaux ioniques de la membrane-bondissent, cet article se concentre sur les principales modifications de la méthode d’interface bicouche goutte essentielle pour atteindre des performances cohérentes memristor. Plus précisément, nous décrivons le processus de préparation de liposome et l’incorporation des peptides alaméthicin dans les membranes de bicouche lipidique et les concentrations appropriées de chaque constituant ainsi que leur impact sur la réponse globale de la memristors. Nous détaillons également le processus de caractérisation des memristors biomoléculaire, y compris la mesure et l’analyse des relations courant-tension de memristive obtenu par voltamétrie cyclique, ainsi que la plasticité à court terme et l’apprentissage en réponse à lavage trains d’impulsions de tension.
Introduction
Il est largement admis que les synapses biologiques sont responsables du rendement élevé et l’énorme parallélisme du cerveau en raison de leur aptitude à acquérir et traiter l’information de façon très adaptables. Cette fonctionnalité coordonnée émerge de multiples, les mécanismes moléculaires complexes qui animent les deux à court et à long terme de la plasticité synaptique1,2,3,4,5. Neuromorphic systèmes informatiques visent à imiter les fonctionnalités synaptiques au niveau proche de la densité, complexité et l’efficacité énergétique du cerveau, qui sont nécessaires pour la prochaine génération des ordinateurs de type cerveau6,7 , 8. Toutefois, reproduisant les caractéristiques synaptiques utilisant des éléments traditionnels de circuit électronique est pratiquement impossible9, plutôt exigeant la conception et la fabrication de nouveaux éléments de matériel qui peut s’adapter aux signaux entrants et n’oubliez pas histoires d’information9. Ces types de matériels d’inspiration synapse sont connus comme mem-éléments9,10,11 (éléments de court pour mémoire), qui, selon Di Ventra et coll.9,11, sont passifs, deux bornes périphériques dont la résistance, capacité ou inductance peut être reconfiguré en réponse à des stimuli externes, et qui se souvient des États antérieurs11. Pour atteindre des niveaux de consommation d’énergie s’approchant de celles du cerveau, ces éléments devraient employer des matériaux et mécanismes de la plasticité synaptique12similaires.
A ce jour, deux bornes memristors13,14,15 ont principalement été construits complémentaire métal-oxyde-semiconducteur (CMOS) technologie, caractérisée par des tensions de commutation de haute et de bruit élevé. Cette technologie ne s’adapte pas bien en raison de la consommation d’énergie élevée et faible densité. Pour pallier ces lacunes, plusieurs memristors organiques et polymères ont été construits récemment. Toutefois, ces appareils présentent sensiblement plus lent commutation dynamique en raison de la diffusion d’ion temps sur un polymère conducteur matrice16,17. Par conséquent, les mécanismes par lesquels les deux dispositifs organiques et axés sur le CMOS memristive imiter synapse-inspiré des fonctionnalités sont hautement phénoménologiques, n'englobant que quelques fonctionnalités synaptiques telles que Spike Timing Dependent plasticité (Pdts) 18, alors que surplombant les autres clés caractéristiques qui jouent un rôle essentiel dans la fabrication du cerveau un ordinateur puissant et efficace, tels que la plasticité présynaptique, à court terme19.
Récemment, nous avons introduit une nouvelle classe de memristive dispositifs12 mettant en vedette les peptides activés par tension incorporés dans les membranes lipidiques biomimétique qui imite la composition biomoléculaire, structure de la membrane et le changement de chaîne déclenchée ion mécanismes de synapses biologique20. Ici, nous décrivons comment assembler et interroger électriquement ces appareils deux bornes, en mettant l’accent sur la façon d’évaluer la plasticité à court terme pour la mise en œuvre en ligne apprentissage demandes12. Assemblage de l’appareil est basé sur la méthode de21 de bicouche (DIB) d’interface des gouttelettes, qui a été largement utilisée ces dernières années pour étudier la biophysique du modèle membranes21 et membrane-bondissent ion canaux22,23, 24et en tant que blocs de construction pour le développement des matériaux sensibles aux stimuli25,26. Nous décrire le processus de montage et interrogatoire de membrane en détail pour ceux qui sont intéressés par les applications neuromorphic mais ont peu d’expérience en biomatériaux ou en biologie de la membrane. Le protocole prévoit également une description complète de la procédure de qualification, qui est aussi importante que le processus d’assemblage, compte tenu des propriétés électriques reconfigurables et dynamiques de l' appareil27. La procédure et représentant les résultats décrite ici sont les bases d’une nouvelle classe de faible coût, faible puissance, mem-ments mous basées sur des interfaces de lipides et d’autres biomolécules pour applications en informatique neuromorphic, structures autonomes et systèmes, et même les interfaces cerveau-ordinateur adaptative.
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Protocol
1. précautions et Instructions générales
- Sélectionnez approprié et intact de mesure/mélange le verrerie (flacons, gobelets, etc.) et autre matériel de laboratoire (spatules, pelles, etc.) pour une utilisation.
- Gérez la verrerie avec précaution pour éviter d’endommager et porter des gants en latex ou nitrile pour éviter de contaminer la verrerie/matériel de laboratoire avec des résidus du bout des doigts et de protéger votre peau.
- Verrerie/labware choisi nettoyer soigneusement avec un détergent et eau en les frottant avec une brosse de bouteille doux jusqu'à ce que propre et tous les résidus sont supprimés.
- Bien rincer avec l’eau du robinet, puis à l’eau désionisée (DI). Place sur Etendoir à l’air sec.
-
Facultatif : Rincer la verrerie/labware nettoyé avec isopropylique (IPA, 99,5 %) et le placer sous vide s’évaporer toutes les IPA résiduelle pour veiller à ce qu’ils sont exempts de tout contaminant (~ 2 h). Retirer du caisson à vide et placer dans l’environnement propre.
Remarque : Utilisez des chiffons non pelucheux pour essuyer la verrerie et matériel de laboratoire. Acheter et utiliser stérile petit verre flacons et tubes de coffre-fort-serrure pour le stockage de préparation et échantillon de matériaux. Pour plus de détails sur le nettoyage de verrerie et d’autres procédures d’utilisation normalisées laboratoire, se référer au28JoVE Science Education de base de données.
2. préparation de la Solution tampon aqueuse
- Porter des gants en latex ou nitrile, choisir un récipient de verre propre et approprié pour préparer 50 mL de tampon aqueux (chlorure de sodium 500 mM (KCl), 10 mM 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS), pH 7,0).
- À l’aide d’un appareil photo numérique, bilan de masse de haute précision et une spatule propre, distribuer 1,86378 g de KCl sur papier de pesée propre et puis ajouter pour le récipient en verre.
Remarque : Les montants de KCl et VADROUILLES devraient varier selon le volume souhaité et désiré concentrations finales. - Peser 0,10463 g de VADROUILLES et ajouter le récipient en verre. Puis, ajoutez 50 mL de l’eau distillée au récipient en verre et vortex soigneusement jusqu'à dissolvent complète de KCl et VADROUILLES.
- Stocker la solution tampon à température ambiante et utiliser au besoin.
NOTE : Bien que les solutions tampons peuvent être conservées pendant des périodes relativement longues de temps, il est recommandé d’utiliser des solutions tampons fraîchement préparés pour des résultats meilleurs et plus cohérentes.
3. préparation des Liposomes
NOTE : Étape 3.1 s’applique uniquement si les phospholipides sont acquis comme les poudres lyophilisées et par conséquent, peuvent être omis si les phospholipides sont achetés dans le chloroforme.
- Dissoudre 5 mg de 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) ou des lipides du cerveau Total lipides extraits (BTLE) dans 1 mL de chloroforme dans une fiole de verre stériles de 5 mL.
- Tout en agitant doucement, s’évaporer le chloroforme sous un léger courant d’azote sec jusqu'à ce qu’un film lipidique reste au fond du flacon.
- Placez le flacon contenant le film lipidique sous vide pendant 10 à 12 h permettre l’élimination complète du chloroforme résiduelle.
- Retirer la cuvette de la chambre à vide et réhydrater le film lipidique en ajoutant 10 mL de solution tampon aqueuse préparée à l’étape 2 pour obtenir une concentration finale de lipides de 2 mg/mL.
- Le gel (-20 °C) et complètement dégeler la suspension de lipides six fois pour faciliter le montage de liposomes multilamellaires.
NOTE : Laissez le mélange décongeler à température ambiante, jamais dans un environnement chauffé. - À l’aide d’une extrudeuse disponible dans le commerce, extruder la solution liposome en forçant la suspension complète de lipides à travers une membrane de piste gravé diamètre 0,1 μm pore. Extruder la suspension 11 fois en succession immédiate afin d’obtenir des liposomes unilamellaires avec un diamètre de c.a. 100 nm, nécessaires à la formation de monocouches de bon lipide. Utilisez moins d’une semaine de préparation et conservez la suspension de liposomes à 4 °C. Pour plus de simplicité, se référer à la solution de liposome qui en résulte comme « A ».
Remarque : Pour l’extrusion de liposomes BTLE, le chercheur est encouragé à l’extrudeuse à 45-50 °C, supérieure à la transition de phase d’échauffement de température des lipides BTLE (~ 37 °C)23,29, pour permettre à extrusion plus facile. Hydraté liposome BTLE suspensions peuvent également être directement préparées (à la place de gel-dégel et extrusion) en plaçant le flacon fermé suspension dans un sonicateur bain à 55 °C pendant environ 15 min.
4. reconstitution des Peptides Alaméthicin
Remarque : Cette procédure décrit le processus de reconstitution des alaméthicin dans les liposomes à une concentration finale de 1 μM. Cette concentration est suffisante pour induire des courants nA niveau semblables à ceux déjà publiés,12. Augmentation de la concentration de peptide va réduire le seuil de commutation et augmenter l’amplitude des courants induits par la tension appliquée29.
- Dissoudre alaméthicin peptides dans l’éthanol à une concentration finale de 2,5 mg/mL, vortexer brièvement pour bien mélanger et stocker la solution mère dans le congélateur (-20 °C).
Remarque : Alaméthicin peptides sont généralement achetés sous forme de poudre. - Dans un tube de coffre fort-serrure de 1,5 mL, mélanger 99 μL de la solution « A » avec 1 μL de solution mère alaméthicin d’obtenir une concentration finale d’alaméthicin de 13 μM dans la suspension de liposomes. Vortex pour bien mélanger. Reportez-vous à la solution de peptide-liposome obtenue comme « B ».
- Mix 117 μL de la solution « A » avec 10 μL de solution B pour obtenir une concentration finale d’alaméthicin de 1 mM, puis vortexer pour bien mélanger. Reportez-vous à la solution obtenue que « C ».
- Stocker les solutions " "B" " et " "C" " à 4 °C et utiliser au besoin.
5. préparation du gel d’Agarose
- À l’aide d’un appareil photo numérique, bilan de masse de haute précision et une spatule propre, ajouter 0,5 g de poudre d’agarose pour un papier de pesée propre.
- Transfert pesait d’agarose dans un bécher de 100 mL verre propre et ajouter 50 mL de l’eau distillée dans l’agarose.
Remarque : Ceci permettra d’obtenir une solution gel d’agarose à 1 % (wt/vol). - Placer un aimant agitation propre à l’intérieur de la carafe en verre et placer le bécher sur une plaque de cuisson en remuant.
- Tout en remuant, porter le mélange à ébullition jusqu'à dissolution complète de gel d’agarose.
- Retirer le Becher de la plaque chauffante pour laisser refroidir le mélange à température ambiante. Conserver à 4 °C et utiliser au besoin.
- Avant d’utiliser à nouveau, faire fondre l’agarose en chauffant avec une plaque chauffante ou four à micro-ondes.
6. fabrication de la cuve
NOTE : La procédure décrite ci-dessous est une des nombreuses façons qu’un réservoir d’huile peut être fabriqué. Le lecteur est invité à concevoir et fabriquer un réservoir issu des matériaux disponibles, usinage des capacités et des besoins spécifiques.
- À l’aide d’une scie à ruban, couper un 12 x 12 x 12 cube acrylique de mm d’une plus grande feuille acrylique épais de 12 mm.
- Broyeurs à un trou de diamètre de 12 mm jusqu'à une profondeur de 8 à 12 mm dans le tube acrylique (Figure 1 a).
7. préparation des électrodes
- À l’aide de ciseaux, coupez deux morceaux (75 mm) de fils argent (125 μm de diamètre).
- En utilisant une flamme nue, plus léger, faire fondre une extrémité de chaque fil d’argent de petites boules sphériques de forme (environ 250 μm de diamètre).
- Trempez les extrémités de la balle dans l’eau de Javel pendant 1-2 h créer une couche d’argent-chlorure d’argent (Ag/AgCl). Une couleur gris foncé indique que le revêtement Ag/AgCl a formé (Figure 2 a).
- Enlever les deux fils de l’eau de Javel, rincer abondamment à l’eau distillée et mettre de côté sur un chiffon propre non pelucheux.
- Trempez les extrémités de la balle en gel d’agarose fondu pour créer une couche mince. Ce revêtement gel contribue à ancrer les gouttelettes aqueuses sur les fils sous huile.
- À l’aide d’un coupe-verre, diviser un long de 10 cm, 1/0,58 mm OD/ID verre borosilicaté capillaire en deux capillaires de 5 cm.
- Insérez l’un des capillaires de verre dans un porte-électrode (Figure 2 b, c) et ensuite alimenter un des fil Ag/AgCl dans le verre capillaire (Figure 2d). Nourrir l’autre fil Ag/AgCl dans le second verre capillaire.
- Montez le deuxième capillaire de verre à un porte-verre une micropipette (Figure 2e, f).
8. mise en place de l’expérience
- Placez une lame de verre 25 x 75 mm, épaisseur 1 mm sur la scène d’un microscope inversé (Figure 1 a).
- Verser quelques gouttes d’huile hexadécane au centre de la lame de verre et placez ensuite le réservoir d’huile directement sur l’huile sur la lame de verre.
NOTE : Ajout d’huile entre le réservoir de diapositive et huile de verre est utilisé pour correspondre à l’indice de réfraction du substrat pour fournir des images plus claires et plus nettes. - Remplir complètement le réservoir d’huile avec de l’huile hexadécane. Assurez-vous que le réservoir est positionné au-dessus de l’objectif.
Remarque : Les autres huiles hydrophobes peuvent être utilisés aussi bien. - Connectez le porte-électrode à la tête d’un amplificateur de courant. Le préamplificateur doit être monté sur un micromanipulateur (Figure 1 a) afin de minimiser la longueur de l’électrode et le bruit électrique.
- Fixer le support d’une micropipette de verre avec le second fil Ag/AgCl sur un autre micromanipulateur (Figure 1 a).
- À l’aide de manipulateurs, position les électrodes telle que l’agarose enduit les extrémités des fils Ag/AgCl sont complètement submergées dans le réservoir d’huile à un même plan vertical.
- Alignez les deux électrodes et séparez-les par quelques millimètres (Figure 1 a, b).
Remarque : Après avoir ajouté les gouttelettes (décrits à l’étape 13), les fils doivent être traduits vers le bas jusqu'à ce que les extrémités des électrodes sont en contact avec le fond de la cuve. Cette étape s’assurera que les fils osciller pas et ainsi, réduira au minimum les fluctuations inutiles dans le courant mesuré.
9. bonne mise à la terre pour réduire le bruit électrique
- Créer une barre de terre en vissant une vis dans la table anti-vibration sur laquelle le microscope est placé (Figure 3 a).
Remarque : En utilisant une table antivibratoire est nécessaire pour minimiser les vibrations émises par l’entourage, qui pourraient causer des fluctuations indésirables courant mesuré. - À l’aide d’un fil conducteur, raccorder la vis à une mise à la terre (Figure 3 a) et puis connectez la platine du microscope au bus de terrain.
- Placer une cage de Faraday sur le montage expérimental pour réduire le bruit et puis le connecter électriquement à la barrette de masse (Figure 3 b).
Remarque : Il est toujours recommandé d’éviter les boucles de terre inutiles, car ils peuvent conduire à une augmentation des niveaux de bruit de mesure.
10. rétroaction contrôlée par chauffage
- Machine d’aluminium chauffage shell dont le réservoir d’huile peut s’adapter confortablement à29.
- Veillez à laisser une ouverture au bas de la coque pour pouvoir voir par le biais de l’interpréteur de commandes via le microscope inversé.
- Placer un élément de chauffage souple de polyimide résistif de 30 x 30 mm sous la coque en aluminium.
- Placez une plaquette isolante de polydiméthylsiloxane (PDMS) sous l’appareil de chauffage pour réduire les pertes de chaleur dans la direction vers le bas et protéger la platine du microscope.
- Insérez un thermocouple dans la phase huileuse. Après en s’assurant que le thermocouple ne touche pas un fil Ag/AgCl, raccorder les fils de thermocouple pour une carte d’acquisition de données thermocouple et enregistrer la température à l’aide d’un logiciel de programmation personnalisé.
NOTE : Écrire une On-Off, proportionnel intégral (PI) température rétrocontrôle pour activer le chauffage et le refroidissement passif de la température de l’huile à une valeur désirée. Des codes peuvent être fournies aux lecteurs sur demande.
11. mise en place le logiciel et le matériel
- Préparer le logiciel d’acquisition de données par la mise sous tension ou les ordinateurs, microscope, générateur de fonctions, amplificateur de courant et systèmes d’acquisition de données de faible niveau de bruit.
Remarque : Bien que tout équipement de télédétection actuel peut-être être utilisé, les instructions suivantes sont spécifiquement pour celui répertorié dans la Table des matières. Les chercheurs qui souhaitent construire leur propre amplificateur de courant peuvent faire référence à Shlyonsky et al.,30. - Sur le panneau avant de la pince de patch amplificateur de courant, définissez l’affichage du panneau avant et de la source-mesure Mode cadrans à VHOLD/préférée et V-bride, respectivement.
- Sur le panneau avant, définissez le filtre passe-bas Filtre de Bessel à 1 kHz, Gain de sortie à 0,5.
NOTE : Choisir un gain de sortie faible permet enregistrer de grandes amplitudes de courant plus élevées, tandis que d’augmenter la distance de mesure de sacrifices de gain pour réduire le bruit de mesure. - Définir la Configuration à germes entiers β = 1. Cette valeur peut être plus tard commutée à 0,1 pour permettre l’enregistrement des grands courants d’amplitude.
- Tous les autres cadrans de contrôle la valeur zéro ou dans une position neutre.
- Initialiser le logiciel en double-cliquant sur l’icône du bureau.
- Cliquez sur Configuration de | Numériseur pour ouvrir la boîte de dialogue de numériseur et puis cliquez sur le bouton modifier .
- Dans la boîte de dialogue Changement numériseur , sélectionner le numériseur approprié dans la liste Type de numériseur .
- Cliquez sur le bouton Scan pour détecter le digitaliseur.
- Cliquez sur OK pour quitter la boîte de dialogue Changement numériseur et puis cliquez sur OK pour quitter la boîte de dialogue de numériseur .
- Cliquez sur Configure | Laboratoire.
- Dans l’onglet de Signaux d’entrée du Laboratoire, régler le facteur d’échelle à 0,0005 V/pa.
Remarque : Cette valeur doit être mis à jour si les valeurs de gain ou de β sont modifiées.
12. pipette Offset
Remarque : La procédure décrite ci-dessous s’applique seulement à amplificateur de courant mentionné dans la Table des matières.
- À l’aide d’une micropipette, déposer 200 nL de la solution aqueuse de lipides « A » sur les extrémités de chaque fil Ag/AgCl sous huile.
- Mettre les gouttes en contact et appuyez sur le bouton ZAP sur la façade de l’amplificateur de fusionner en un seul volume, s’étendant sur les deux électrodes de gouttelettes. Cela devrait entraîner une réponse de court-circuit.
- Sélecteur de mode de jeu source-mesure sur piste.
- Remplacez le cadran d’affichage panneau frontal VTRACK.
- Tournez l' EXTRÊMITÉ OFFSET composer (dans le sens horaire ou antihoraire) jusqu’au compteur affiche 0 mV et est stable.
- Retourner le mode source-demesure V - clamp et la façade affiche dial à V/i detenirtenir.
13. la formation de la bicouche lipidique
- Libérer les gouttelettes qui ont été précédemment déposés en déplaçant les électrodes verticalement hors de la phase huileuse. Ce qui provoque les gouttelettes tomber des électrodes dans l’huile. Re-plonger et placer les électrodes dans l’huile.
- Utiliser une micropipette de dépôt 200 nL de solution lipidique « A » sur chacun des fils.
- Attendre 3-5 min permettant l’assemblage monocouche lipides spontanée se produit à chaque interface eau/huile.
NOTE : dans les formes de la monocouche lipidiques, les baisses de tension superficielle interface lipide/eau/huile, qui peuvent causer les gouttelettes à s’affaisser si l’huile environnante est suffisamment moins dense21. - Abaisser les électrodes (et gouttelettes) jusqu’aux extrémités de deux électrodes à peine touchent le fond de la cuve (Figure 1 b) et puis les déplacer horizontalement pour mettre les gouttelettes en contact.
Remarque : La bicouche lipidique va spontanément mince en excluant l’excès d’huile entre les gouttelettes de contact. Ce processus se produit en général, moins de 1 min.
14. electrical Characterization of le Memristor biomoléculaire
- Formation de bicouche lipidique
- Pour enregistrer la formation de bicouche lipidique, qui correspond à une augmentation de la capacité électrique entre les gouttelettes, appliquer un 10 Hz, tension de forme d’onde triangulaire mV 10 à l’aide d’un générateur de fonctions (Figure 4) branché sur l’entrée externe de la pince de patch amplificateur.
Remarque : En raison de la nature capacitive de la membrane lipidique, la réponse en cours qui en résulte doit être une forme d’onde carrée (Figure 4). Au cours de la formation de la bicouche lipidique, 11,6 d’étape, le chercheur devrait voir une augmentation de l’amplitude du courant crête à crête et également observer un changement visuel entre gouttelettes connectés (Figure 4).
- Pour enregistrer la formation de bicouche lipidique, qui correspond à une augmentation de la capacité électrique entre les gouttelettes, appliquer un 10 Hz, tension de forme d’onde triangulaire mV 10 à l’aide d’un générateur de fonctions (Figure 4) branché sur l’entrée externe de la pince de patch amplificateur.
- Mesures de courant-tension
Remarque : Le memristor biomoléculaire est modélisé comme une résistance et un condensateur en parallèle12,21. Par conséquent, la réponse actuelle de l’appareil peut contenir des composants résistifs et capacitifs selon la fréquence de la tension appliquée. Pour étudier la nature memristive de l’appareil et d’obtenir la relation de courant-tension hystérèse pincé12, il peut être nécessaire de soustraire un courant capacitif du courant total. Le protocole ci-dessous décrit cette procédure.- À l’aide d’un générateur de fonctions, d’appliquer une forme d’onde de tension (triangulaire ou sinusoïdale) à une membrane lipidique alaméthicin libres Assemblée avec des gouttelettes de solution « A ».
- Enregistrer la réponse induite en cours à travers de multiples fréquences.
Remarque : Les courants capacitifs sont réduits au minimum à des fréquences inférieures à 10 mHz. - Enregistrer la taille de la bicouche lipidique interfaciale en soit en mesurant le diamètre de la membrane lipidique sur ordinateur, ou en enregistrant l’amplitude crête-à-crête du courant résultant de la 10 Hz, onde triangulaire de 10 mV. L’amplitude du courant est proportionnelle à la capacité de la membrane, qui est proportionnelle à la surface de la membrane.
- Enlever les gouttelettes qui ne contiennent aucune alaméthicin.
- Ajouter nouveau gouttelettes aqueux à l’aide de la solution « C » et forment une double couche lipidique.
- Utilisez les micromanipulateurs pour régler le contact entre gouttelettes telle que la bicouche a une superficie similaire (diamètre ou onde carrée amplitude actuelle) que celui formé plus tôt.
- Répétez les étapes 14.2.1 et 14.2.2.
- Soustrayez actuel enregistré dans étape 14.2.2 de current notée à l’étape 14.2.7.
- Tracer le courant induit par rapport à la tension appliquée pour chaque fréquence et la forme d’onde pour obtenir la réponse de memristive « hystérésis pincé ».
- Expériences d’impulsion
- À l’aide d’un logiciel de programmation personnalisé et une source de tension analogique, génèrent des impulsions de tension avec des amplitudes spécifiques de hautes et basses, ponctuellement et temps d’arrêt.
NOTE : Ceci n’est pas nécessaire si les impulsions de tension peuvent être générées à l’aide d’un générateur de fonctions commerciales. - Enregistrer le courant en réponse aux impulsions appliquées.
- En raison de la nature capacitive du memristor, pointes capacitives seront enregistrées. Enlever les pointes en appliquant un filtre passe-bas avec bande passante appropriée.
- À l’aide d’un logiciel de programmation personnalisé et une source de tension analogique, génèrent des impulsions de tension avec des amplitudes spécifiques de hautes et basses, ponctuellement et temps d’arrêt.
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Representative Results
La figure 1 affiche le montage expérimental utilisé pour assembler et caractériser le memristor biomoléculaire. Abaisser les extrémités libres des électrodes au fond de la cuve, comme illustré à la Figure 1 b, a été jugé utile pour minimiser les vibrations des électrodes et des gouttelettes qui peuvent entraîner des variations mesurée zone courant et bicouche, surtout dans les cas où le mazout de chauffage peut générer flot dans l’huile. La figure 2 illustre la procédure et le résultat du montage des fils Ag/AgCl, capillaires de classe et des détenteurs de l’électrode et une micropipette. Le programme d’installation est logé dans une cage de Faraday correctement mise à la terre (Figure 3) pour minimiser les interférences électromagnétiques.
Il est impératif pour former une écurie, isolation bicouche lipidique pour cette étude. Dans ce protocole, une monocouche de lipides assemble à l’interface huile/eau des gouttelettes aqueuses immergés dans l’huile. Lors du contact entre les gouttelettes, excès de sébum est exclue et les monocouches de lipides adverse mince d’une bicouche lipidique épais de 5 nm. La technique la plus courante utilisée en électrophysiologie bicouche est voltage clamp, où la tension à travers la bicouche est contrôlée et le courant induit est mesuré. Figure 4 a dépeint le courant capacitif d’onde carrée induit par un 10 mV, 10 Hz tension pendant la formation de la bicouche. Alors que l’amplitude augmente le début bicouche amincissement et expansion radiale ultérieure de la membrane éclaircie, la forme d’onde reste carrée. À l’aide de l’amplitude de l’équilibre d’onde carrée actuelle, la zone nominale de la bicouche lipidique peut être calculée en utilisant une valeur prédéterminée de la capacité membranaire spécifique pour une bicouche de DPhPC21. En outre, la zone de la bicouche peut être visuellement évaluée par mesure du diamètre double couche d’une image prise avec le microscope Figure 4 b. Pour les calculs de zone de bicouche lipidique précise, le lecteur peut se référer à Taylor, Al.21. Le domaine de la bicouche lipidique peut être réglé en changeant les positions relatives des gouttelettes21,31.
À la demande d’un biais de tension à une double couche lipidique exempt d’alaméthicin, la réponse actuelle variera selon la fréquence de la tension d’entrée. Dans les basses fréquences (< 10 à 50 mHz), où la résistance de la bicouche domine l’impédance complexe, la réponse actuelle ohmique est négligeable car la résistance nominale de membrane est généralement supérieure à 10 GΩ. Plus la fréquence d’entrée augmente, capacité de la membrane contribue davantage à l’impédance du système, ce qui entraîne la réponse non-nulle en cours affichée dans l’intrigue du courant par rapport à la tension dans la Figure 5 a. Quand la même entrée de forme d’onde de tension (150 mV) est appliqué à une réaction biomoléculaire constitué d’une membrane lipidique alaméthicin dopé, et lorsque l’amplitude de la tension dépasse un seuil critique d’insertion (~ 100 mV pour une membrane DPhPC à température ambiante), peptides alaméthicin demeurant à la surface de la bicouche lipidique insérez dans la membrane et agrègent à pores conductrices de forme. La formation de seuil-dépendant des canaux ioniques se traduit par une réponse actuelle macroscopique non linéaire, avec une augmentation exponentielle de courants à une tension plus élevée que le seuil d’insertion (Figure 5 b). Alors que les peptides alaméthicin sont connus pour la forme rectifier des canaux ioniques uniquement à des tensions suffisamment positives, la nature symétrique des ces réponses actuelles aux deux polarités est due à l’insertion et l’agrégation des populations distinctes de peptides, chacun de en face des côtés de la membrane. Selon la fréquence de la tension appliquée, la réponse actuelle induite peut également contenir des contributions versées par le courant capacitif. Par conséquent, le courant capacitif dans la Figure 5 a doit être soustraite du total actuel affiché en Figure 5 b pour obtenir seulement la memristive pincé hystérésis courant-tension réponse, affichée dans la Figure 5 c, d.
La figure 6 affiche la réponse dynamique de commutation d’un memristor biomoléculaire induite par un train d’impulsions de tension (130 mV (haute), 20 mV (basses), 100 ms (ON), 20 ms (OFF)). La tension d’arrêt est choisie pour être 20 mV à différencier le retour de l’appareil dans un état isolant comme canaux alaméthicin quitter la bicouche plutôt de courant simplement fuite zéro-tension d’entrée. L’augmentation cumulative dans l’état actuel au cours des impulsions de tension successives représente jumelé-pulsé facilitation, une plasticité que memristors biomoléculaire volatils sont capables d’exposer12.
Figure 1 : Montage expérimental et des composants principaux. (a) la station de travail standard d’assemblage et de caractériser le memristor biomoléculaire comprend un microscope inversé, 3 axes micromanipulateurs, un appareil photo numérique, une table d’isolement de vibration, un porte-électrode, un porte-verre micropipette, un amplificateur de courant, un générateur de fonction et un réservoir d’huile. Le programme d’installation est monté sur la scène du microscope, comme décrit dans les étapes 11 à 13. (b) une photo agrandie de l’installation montrant les extrémités des fils Ag/AgCl touchant le fond de la cuve. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédure de préparation d’électrode. Photographies montrant : (a) l’argent fils tremper dans l’eau de Javel ; (b), un porte-électrode ; (c) un capillaire de verre long 5 cm connecté au porte-électrode ; (d) une Ag/AgCl électrode alimenté à travers le verre capillaire ; (e), un porte-verre micropipette ; et (f) l’entièrement assemblé électrodes et titulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédure de mise à la terre. Photographies montrant : (a) une vis filetée dans la surface de table d’isolement de vibration pour créer une barre de terre lorsqu’il est connecté à la terre ; et (b) un Faraday lab-fait cage portant sur l’installation de réservoir et électrode d’huile pour protéger la mesure des perturbations électromagnétiques. Scène de la cage et le microscope sont liés au sol de bus via câbles I et II. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Mesures de courant en temps réel montrent une croissance d’éclaircie et surfacique initiale bicouche. (un) courant mesuré (haut) durant la formation spontanée de bicouche entre lipides enduit gouttelettes en réponse à une tension de forme d’onde triangulaire. L’amplitude du courant mesuré est directement proportionnelle à la capacité de l’interface et, par conséquent, la zone de la bicouche. La zone de l’interface peut varier en modifiant la distance entre les deux électrodes de gouttelettes porteuses. (b) une image acquise à travers le microscope inversé montre une vue de dessous et les dimensions d’un memristor typique à base de membranes biomoléculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Relation courant-tension et hystérésis pincé. (a) le courant-tension réponses d’une double couche lipidique de DPhPC libres alaméthicin. Une membrane lipidique seule est hautement isolant (~ 10 GΩ), ce qui explique la faible réponse actuelle ohmique à 0,017 Hz, une fréquence dont l’impédance est dominé par la résistance de la membrane. Aux fréquences plus élevées, capacitance de membrane contribue plus largement à l’impédance totale de l’interface, ce qui entraîne un courant capacitif induit non nulle. (b) les relations courant-tension dynamiques fonction de la fréquence d’une bicouche lipidique forment entre deux gouttelettes contenant des peptides alaméthicin (obtenus avec une vague d’entrée triangulaire). (c) la memristive, pincé hystérétique réponse actuelle de l’appareil s’obtient en soustrayant le courant capacitif affiché dans du courant total affiché dans b. (d) zoom-in pour mettre en évidence les différences entre le total et les courants memristive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Réponse de la memristors biomoléculaire à impulsions de tension rectangulaire et plasticité. L’appareil réagit aux impulsions de tension ultérieure avec une augmentation de la conductance au cours de l’heure, malgré la restauration par intermittence un état isolant pendant chaque temps d’arrêt. L’augmentation de courant d’impulsion à impulsion montre que la conductance instantanée de l’appareil est fonction de la stimulation actuelle et stimulations préalables, analogues à la plasticité à court terme en bio-synapses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article présente un protocole pour l’assemblage et de caractérisation biomoléculaire memristors issu des ions biomembranes synthétique dopé au canal formé entre deux gouttes d’eau dans l’huile. Le dispositif doux-matter, deux bornes est conçu et étudié pour : 1) surmonter les contraintes qui sont associés à la technologie à l’état solide, tels que bruit élevé, forte consommation d’énergie et haute tensions, de commande 2) mieux imitent la composition, la structure mécanismes de synapses biologiques et 3 de commutation) explorer les mécanismes et les caractéristiques de plasticité de la bio-synapse qui ne sont pas exposées par des dispositifs à semi-conducteurs.
La gouttelette interface bicouche technique21, qui représente la pierre angulaire de la technologie actuellement12, est une approche simple et modulaire pour assemblage membrane qui a été largement utilisé pour étudier la membrane biophysique21, protéines22, ion canaux29et autres biomolécules32. Il offre des avantages spécifiques de contrôle et d’interroger des membranes modèles précisément et représente un bloc de construction pour les matériaux sensibles aux stimuli et autonome26. Plusieurs méthodes ont été développées pour assembler des bicouches interface gouttelette, y compris de la pendaison de la glisser méthode21 qui a été adapté comme méthode principale d’élaborer et de caractériser le memristor biomoléculaire. Même si cette technique d’assemblage membrane a été utilisée dans des études précédentes, nous présentons ici un protocole complet qui permet aux chercheurs de recréer et étudier des bicouches d’interface des gouttelettes de le memristive dans leurs propres laboratoires. Le protocole est écrit spécifiquement de façon à permettre aux chercheurs dans des domaines non-membrane biologie, comme la communauté neuromorphic, à comprendre et à recréer ces procédures.
Dans sa forme la plus simple, le protocole que nous avons décrit ci-après pour évaluer les fonctionnalités de memristive d’une biomembrane peut être reproduit avec équipement de laboratoire de base comme un générateur de fonctions, un microscope et un système de mesure actuel. Le dispositif assemblé est électriquement équivalent à une résistance (environ 10 GΩ) et un condensateur en parallèle. En présence de peptides, tels qu’alaméthicin, qui sont capables de former des pores de voltage-dépendants dans la membrane, la résistance de la membrane diminue sensiblement, et courant résistif peut être détectée en réponse à l’entrée des signaux de tension (continu ou alternatif). Cependant, la résistance de la membrane large et dépendant de la fréquence impédance électrique de l’appareil signifient que : 1) courants induits sont petites (pA-nA) et sujet aux interférences électromagnétiques ; et 2) il faut induire avec précision et de mesurer les propriétés de désiré memristive distinctes de réponses de membrane capacitive, respectivement. En réponse à une tension alternative et selon la fréquence du signal, le courant enregistré contiendra des éléments capacitifs et résistifs. Pour atteindre l’hystérésis pincé, qui est une signature de dispositif de memristive, on doit suivre le protocole décrit à l’étape 14. Les câbles de suspension sont sensibles aux vibrations, ce qui peuvent entraîner des réponses artéfactuelles telles oscillations attribuées par erreur à la dynamique réelle de l’appareil. Positionnement des fils au fond de la cuve améliore ce comportement.
Le memristor biomoléculaire avec sa structure actuelle et la conception émule la plasticité synaptique à court terme qui se produit dans la terminaison présynaptique. Il imite aussi certains des mécanismes qui causent la facilitation pulsée appariée présynaptique dans le cerveau en raison de l’accumulation et l’épuisement des vésicules de neurotransmetteurs dans le neurone présynaptique. Cette méthodologie pour assembler imite synaptique permet l’étude et la validation des processus de biomimétiques responsables de nombreux types de plasticité à court terme et l’optimisation de la modularité et l’évolutivité n’est pas possible avec les autres technologies33. Fonctionnalité imprévue peut-être être découvertes en soit en modifiant la composition de la membrane, les types de canaux ioniques qui sont incorporées dans la membrane et même le nombre de gouttelettes connectés et interfaciales membranes constituant chaque deux bornes appareil. À titre d’exemple, nous avons récemment démontré les capacités d’apprentissage en ligne du memristor biomoléculaire en interfaçant il avec un neurone à l’état solide34.
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Disclosures
Ce manuscrit a été écrit par UT-Battelle, LLC, sous le contrat no. DE-AC0500OR22725 avec l’US Department of Energy. Le gouvernement des Etats-Unis maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement des États-Unis conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondial pour publier ou reproduire le formulaire publié de ce manuscrit, ou permettre aux autres de le faire, pour les besoins du gouvernement des États-Unis.
Acknowledgments
Aide financière a été accordée par la National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Recherche pour G.J.T., C.D.S., D.A., et C.P.C. partiellement financé par le laboratoire de recherche réalisé et développement programme du Oak Ridge National Laboratory, géré par UT-Battelle, LLC, pour le U.S. Department of Energy. Une partie de cette recherche a été menée au centre pour les Sciences des matériaux Nanophase, qui est un bureau d’installations de la Science utilisateurs DOE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
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