Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Montering og karakterisering av Biomolecular Memristors bestående av Ion kanal-dopet Lipid membraner

Published: March 9, 2019 doi: 10.3791/58998
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 5, 5, 5, 6, 7, 2, 2,3,7
1Joint Institute for Biological Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 3Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee, 4Department of Biosystems and Agriculture Engineering, University of Kentucky, 5Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Tennessee, 6Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 7Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Myk, lavt strømforbruk, utnytte biomolecular memristors lignende komposisjon, struktur og bytte mekanismer av bio-synapser. Presenteres her er en protokoll for å montere og karakterisere biomolecular memristors innhentet fra isolerende lipid bilayers dannet mellom vanndråper i olje. Inkorporering av spenning-aktivert alamethicin peptider resulterer i memristive ioniske konduktans over membranen.

Abstract

Muligheten til å gjenskape synaptic funksjoner i syntetisk Kretselementer er viktig for neuromorphic databehandling systemer som forsøker å etterligne kognitive krefter hjernen med sammenlignbare effektivitet og tetthet. Hittil har silikonbaserte tre-terminal transistorer og to-terminal memristors vært mye brukt i neuromorphic kretser, i stor grad evne til å sammen finne informasjonsbehandling og minne. Men disse enhetene ikke kan oppnå tilkoblinger og kompleksiteten av hjernen fordi de er makt-sulten, ikke etterligne synaptic nøkkelfunksjonalitet, og lider av høy støy og bytte høye spenninger. For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet og preget en biomolecular memristor som etterligner komposisjon, strukturen og bytte kjennetegner biologiske synapser. Her vi beskriver prosessen med å samle og karakterisere biomolecular memristors bestående av en 5 nm-tykk lipid bilayer dannet mellom lipid-functionalized vanndråper i olje og dopet med spenning-aktivert alamethicin peptider. Mens lignende montering protokoller har blitt brukt til å undersøke Biofysiske egenskaper slippverktøy-støttet lipid membraner og membran-bundet ionekanaler, fokuserer denne artikkelen på viktige modifikasjoner av dråpe bilayer grensesnittmetoden avgjørende for oppnå konsekvent memristor ytelse. Spesielt beskrive vi liposome forberedelsesprosessen og inkorporering av alamethicin peptider i lipid bilayer membraner og riktig konsentrasjonen av hver bestanddel samt deres innvirkning på den generelle responsen av memristors. Vi også detalj karakterisering prosessen med biomolecular memristors, herunder måling og analyse av memristive strøm-spenning relasjoner Hentet via syklisk voltammetry, i tillegg til kortsiktige plastisitet og læring svar trinnvis spenning puls tog.

Introduction

Det er anerkjent at biologiske synapser er ansvarlig for høy effektivitet og enorme parallellisme av hjernen evne til å lære og behandle informasjon på svært tilpasningsdyktige måter. Denne koordinerte funksjonaliteten kommer fra flere komplekse molekylære mekanismer stasjonen både kortsiktige og langsiktige synaptiske plastisitet1,2,3,4,5. Neuromorphic datasystemer som mål å etterligne synaptic funksjonaliteten på nivåer nærmer tetthet, kompleksitet og energieffektivitet av hjernen, som er nødvendig for neste generasjon av hjernen som datamaskiner6,7 , 8. imidlertid gjengivelse synaptic funksjoner ved hjelp av tradisjonelle elektronisk Kretselementer er praktisk talt umulig9, i stedet krever design og fabrikasjon av ny maskinvare elementer som kan tilpasse seg de innkommende signalene og huske informasjon historier9. Disse typer synapse-inspirerte maskinvare er kjent som mem-elementer9,10,11 (forkortelse for minne elementer), som ifølge Di Ventra et al.9,11, er passiv, to-terminal enheter som motstand, kapasitans eller Induktans kan konfigureres som respons på eksterne stimuli, og som kan huske tidligere stater11. For å oppnå energi forbruksnivåene nærmer i hjernen, skal disse elementene bruke lignende materialer og mekanismer for synaptiske plastisitet12.

Hittil har har to-terminal memristors13,14,15 hovedsakelig blitt bygget med complementary metal oxide semiconductor (CMOS) teknologi, preget av høy-svitsjing spenninger og høy støy. Denne teknologien gjør målestokken ikke godt på grunn av høyt strømforbruk og lav tetthet. For å løse disse begrensningene, har flere organisk og polymere memristors blitt bygget. Men viser disse enhetene betydelig tregere bytte dynamics på grunn av tidkrevende ion spredning gjennom en ledende polymer matrise16,17. Resultatet er mekanismer som begge CMOS-basert og organiske memristive enhetene etterligne synapse-inspirerte funksjonaliteten svært fenomenal, omfatter bare noen synaptic funksjonaliteten som Spike Timing avhengige plastisitet (STDP) 18, mens med utsikt over andre viktige funksjoner som også spille viktige roller i å lage hjernen en kraftig og effektiv datamaskin, for eksempel pre synaptic, kortsiktige plastisitet19.

Nylig introdusert vi en ny klasse av memristive enheter12 med spenning-aktivert peptider i biomimetic lipid membraner som etterligner biomolecular komposisjon, membran strukturen og ion utløst kanalskift mekanismer for biologiske synapser20.  Her beskriver vi kursen og elektrisk forhøre disse to-terminal enheter, med spesielt fokus på hvordan man skal vurdere kortsiktige plastisitet for implementering i online learning programmer12. Enheten forsamlingen er basert på dråpe bilayer (DIB)21 grensesnittmetoden, som har vært brukt mye i de senere år for å studere biofysikk modell membraner21 og membran-bundet ion kanaler22,23, 24, og som byggesteiner for utvikling av stimuli-responsive materialer25,26. Vi beskriver membran montering og avhør prosessen i detalj for interesserte i neuromorphic programmer, men har begrenset erfaring i biologisk materiale eller membran biologi. Protokollen inneholder også en fullstendig beskrivelse av karakterisering prosedyren, som er like viktig som monteringen, gitt dynamisk og rekonfigurerbare elektriske egenskaper for enheten27. Prosedyre og representant resultatene beskrevet her er grunnlaget for en ny klasse av rimelig, lavt strømforbruk, myk mem-elementer basert på lipid grensesnitt og andre biomolecules for programmer i neuromorphic computing, autonome strukturer og systemer, og selv adaptive hjerne-computer grenseflate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generelle instruksjoner og forholdsregler

  1. Velg passende, uskadet måle/blande glass (flasker, kanner, etc.) og andre labware (spatler, kuler, etc.) for bruk.
  2. Håndtere glass nøye for å unngå skade, og bære latex eller nitril hansker å unngå forurensende glass/labware med rester av hånden og beskytte huden din.
  3. Ren valgte glass/labware grundig med såpevann og vann ved scrubbing med myk flaskebørste før rene og alle rester er fjernet.
  4. Skyll grundig med vann fra springen og deretter med deionisert (DI) vann. Sted på hjell til luft tørke.
  5. Tilleggsutstyr: Skyll den renset glass/labware med isopropyl (IPA, 99,5%) og plasser under vakuum å fordampe alle gjenværende IPA for å sikre de gratis eventuelle forurensninger (~ 2 h). Fjern fra vakuum kammer og plasser i rent miljø.
    Merk: Bruk lofri kluter for å tørke glass og labware. Kjøp og bruk sterilt små hetteglass og safe-lock rør for materialer forberedelse og prøve lagring. For ytterligere informasjon om glass rengjøring og andre laboratorium standard operasjonsprosedyrer, se JoVE vitenskap utdanning Database28.

2. forberedelse i vandig Buffer løsning

  1. Iført latex eller nitril hansker, Velg en passende og ren glassbeholder å forberede 50 mL av vandig buffer (500 mM natriumklorid (KCl), 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER), pH 7.0).
  2. Bruker en digital, høy presisjon masse balanse og en ren slikkepott, dispensere 1.86378 g KCl til ren veiing papir og deretter legge til beholderen glass.
    Merk: Mengden KCl og MOPS bør variere avhengig av ønsket volum og ønsket endelige konsentrasjoner.
  3. Veie 0.10463 g MOPPER og legge til beholderen glass. Deretter legge 50 mL DI vann til glassbeholder og vortex grundig før KCl og MOPS er fullstendig oppløst.
  4. Lagre buffer løsning ved romtemperatur og bruke når nødvendig.
    Merk: Mens buffer løsninger kan lagres for relativt lang tid, det anbefales å bruke nylagde buffer løsninger for bedre og mer konsistente resultater.

3. forberedelse av liposomer

Merk: Trinn 3.1 gjelder bare hvis fosfolipider er ervervet som lyofilisert pulver, og derfor kan hoppet hvis fosfolipider kjøpes i kloroform.

  1. Oppløse 5 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) eller hjernen totale Lipid ekstrakter (BTLE) lipider i 1 mL av kloroform i en 5 mL steril hetteglass.
  2. Mens forsiktig virvlende, fordampe kloroform under en svak strøm av tørr nitrogen til en lipid film gjenstår på bunnen av ampullen.
  3. Plass ampullen inneholder lipid filmen under vakuum for 10-12 h å tillate fullstendig fjerning av rester kloroform.
  4. Fjern ampullen fra vakuum kammeret og rehydrate lipid filmen ved å legge 10 mL av vandig buffer løsning utarbeidet i trinn 2 å oppnå en siste lipid konsentrasjon av 2 mg/mL.
  5. Fryse (-20 °C) og helt tine lipid suspensjon seks ganger for å lette multilamellar liposome montering.
    Merk: La blandingen tine i romtemperatur, aldri i et oppvarmet miljø.
  6. Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig extruder extrude liposome løsningen ved å tvinge komplett lipid suspensjon gjennom en 0,1 μm pore diameter spor-etset membran. Extrude suspensjon 11 ganger i umiddelbar rekkefølge å få unilamellar liposomer med diameter på ca 100 nm nødvendig for riktig lipid monolayer formasjon. Lagre liposome suspensjon på 4 °C og bruk innen 1 uke forberedelser. For enkelhet, referere til den resulterende liposome løsningen som "A".
    Merk: For byggesystemer i BTLE liposomer, forskeren er oppfordret til å varme opp extruder til 45-50 °C, høyere enn fase overgangen temperaturen på BTLE lipider (~ 37 °C)23,29, aktivere enklere ekstrudering. Hydrert BTLE liposome suspensjoner kan også direkte tilberedes (i stedet for fryse-tine og ekstrudering) ved å plassere lukket suspensjon ampullen inn i et bad sonicator ved 55 °C i ~ 15 min.

4. rekonstituering av Alamethicin peptider

Merk: Denne prosedyren beskriver prosessen med alamethicin rekonstituering i liposomer til en siste konsentrasjon på 1 μM. Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å indusere nA nivå strømninger som ligner de tidligere publiserte12. Øker peptid konsentrasjonen vil redusere skifte terskelen og øke amplituder av strømninger av anvendt spenning29.

  1. Oppløse alamethicin peptider i etanol en siste konsentrasjon av 2,5 mg/mL, vortex kort til blandingen, og lagre lager løsningen i fryseren (-20 °C).
    Merk: Alamethicin peptider vanligvis kjøpes i pulverform.
  2. I en 1,5 mL safe-lock tube, bland 99 μL løsning "A" med 1 μL alamethicin lager løsning å oppnå en siste alamethicin konsentrasjon av 13 μM i liposome suspensjon.  Vortex å bland godt. Referer til den resulterende peptid-liposome løsningen som "B".
  3. Mix 117 μL løsning "A" med 10 μL av løsning B å oppnå en siste alamethicin konsentrasjon av 1 mM, og deretter vortex å bland godt. Referer til den resulterende løsningen som "C".
  4. Lagre løsninger "B" og "C" på 4 °C og bruk etter behov.

5. forberedelse av Agarose gel

  1. Bruker en digital, legge høy presisjon masse balanse og en ren slikkepott, 0,5 g agarose pulver til en ren veiing papir.
  2. Veide agarose til et 100-mL rent glass beaker og legge til 50 mL DI vann i agarose.
    Merk: Dette vil gi en 1% (wt/vol) agarose gel løsning.
  3. Plasser en ren gripende magnet inne glass begeret og plasser begeret på en gripende kokeplate.
  4. Under omrøring, ta blandingen til en byll før agarose er fullstendig oppløst.
  5. Fjern begeret fra kokeplate å la blanding avkjøles til romtemperatur. Butikken på 4 °C og når nødvendig.
  6. Før du bruker igjen, nytt smelte agarose av oppvarming med en varm plate eller mikrobølgeovn.

6. fabrikasjon av oljereservoar

Merk: Prosedyren beskrevet nedenfor er bare en av mange måter at en oljereservoar kan fremstille. Leseren er oppmuntret å design og dikte et reservoar basert på tilgjengelige materialer, maskinering evner og behov.

  1. Bruke en bandet så kuttet en 12 x 12 x 12 mm akryl kube fra en større 12 mm tykk akryl ark.
  2. Mill 12 mm diameter hull til en dybde på 8-12 mm i akryl tube (figur 1a).

7. forberedelse av elektroder

  1. Bruk saks, kutte to stykker (75 mm) av sølvtråder (125 μm diameter).
  2. Bruker en åpen flamme lettere, smelte ene enden av hver sølv wire til skjemaet små sfæriske kuler (ca. 250 μm i diameter).
  3. Fordype ballen ender i blekemiddel for 1-2 h å opprette en sølv sølv-klorid (Ag/AgCl) belegg. En mørk grå farge angir at Ag/AgCl belegg dannet (figur 2a).
  4. Fjerne begge ledninger fra blekemiddel, skyll grundig med DI vann og Legg til side på en ren lofri tørke.
  5. Dukkert ballen ender i smeltet agarose gel å skape et tynt lag. Denne gel belegg hjelper til å forankre de vandige dråpene på ledninger under olje.
  6. Bruker en glass cutter, dele en 10 cm lang, 1/0.58 OD ID mm Borosilikatglass kapillær i to 5 cm kapillærer.
  7. Setter inn et av glass kapillærene i en elektrodeholderen (figur 2b, c), og deretter mate en av Ag/AgCl ledningen inn i glasset kapillær (figur 2d). Mate andre Ag/AgCl ledningen inn i andre glasset kapillær.
  8. Montere av andre glass kapillær et glass brønnene innehaveren (figur 2e, f).

8. setter opp eksperimentet

  1. Plass en 1 mm tykk, 25 x 75 mm objektglass på scenen av en invertert mikroskopet (figur 1a).
  2. Støte noen dråper hexadecane olje på midten av glass lysbilde, og deretter plassere oljereservoar direkte på olje på av objektglass.
    Merk: Tilføyer olje mellom glass lysbilde og olje reservoaret brukes til å samsvare brytningsindeks av underlaget å gi klarere og skarpere bilder.
  3. Fylle oljereservoar med hexadecane olje. Kontroller reservoaret er plassert over linsen.
    Merk: Andre hydrofobe oljer kan brukes også.
  4. Koble elektrodeholderen til headstage av en gjeldende forsterker. Headstage må monteres på en micromanipulator (figur 1a) å minimere elektrode lengde og elektrisk støy.
  5. Montere glass brønnene holderen med andre Ag/AgCl ledningen til en annen micromanipulator (figur 1a).
  6. Bruke manipulators, posisjon elektrodene slik at agarose belagt tips av Ag/AgCl ledninger er helt nedsenket i oljereservoar på en lignende vertikale planet.
  7. Justere de to elektrodene og Skill dem med noen få millimeter (figur 1a, b).
    Merk: Etter tilføyer dråper (beskrevet i trinn 13), ledningene må bringes ned til elektroden tips berører bunnen av oljereservoar. Dette trinnet sikrer at ledningene ikke svinge, og dermed vil redusere unødvendige svingninger i målt gjeldende.

9. skikkelig jording for å redusere elektrisk støy

  1. Opprette en bakken buss ved threading en skrue i anti-vibrasjon tabellen der mikroskopet er plassert (figur 3a).
    NOTE Bruker en anti-vibrasjon tabell er nødvendig for å redusere vibrasjoner fra de omliggende, som kan forårsake uønskede svingninger i målt gjeldende.
  2. Bruker en ledende wire, koble skruen til en jording (figur 3a), og koble deretter mikroskop scenen til bakken buss.
  3. Plass en buret over det eksperimentelle oppsettet for å redusere støy og elektrisk koble den til bakken buss (figur 3b).
    Merk: Det er alltid anbefalt å unngå unødvendige jordings sløyfer, som de kan føre til en økning i måling støynivå.

10. tilbakemelding-kontrollert oppvarming

  1. Maskinen en aluminium oppvarming skall som oljereservoar kan godt passe29.
  2. Pass på å være en åpning på bunnen av skallet å kunne se gjennom skallet via invertert mikroskopet.
  3. Plass 30 x 30 mm resistiv polyimid (pi) fleksible varmekabel under aluminium skall.
  4. Plass et isolerende polydimethylsiloxane (PDMS)-wafer under ovnen å redusere varmetap i nedadgående retning og beskytte mikroskop scenen.
  5. Sett inn en thermocouple i olje fasen. Når sørge thermocouple ikke touch enten Ag/AgCl wire, koble thermocouple ledningene thermocouple data oppkjøpet styret og registrere temperatur bruke egendefinert programmering programvare.
    Merk: Skrive en On-Off, proporsjonal integrert (PI) tilbakemelding temperaturkontroll for å aktivere oppvarming og passiv kjøling av oljetemperaturen til en ønsket verdi. Kodene kan gis til lesere på forespørsel.

11. sette opp programvare og utstyr

  1. Forberede den oppkjøp programvaren ved å slå på datamaskin(er), mikroskop, funksjonsgenerator, gjeldende forsterker og lav støy oppkjøpet datasystemer.
    Merk: Mens gjeldende sensing utstyr kan brukes, instruksjonene nedenfor er spesielt for det som er oppgitt i Tabellen for materiale. Forskere som ønsker å bygge sine egne gjeldende forsterker kan referere til Shlyonsky et al.30.
  2. På frontpanelet av oppdateringen klemmen gjeldende forsterker, sette skjermen foran og kilde-måling modus ringer VHOLD/IHOLD og V-KLEMME, henholdsvis.
  3. På frontpanelet, angi lavpassfilter Bessel Filter 1 kHz og Utgang få til 0,5.
    Merk: Velge en lav produksjon gevinst gjør opptak større høyere gjeldende amplituder, mens økende gevinst offer måling området for redusere måling støy.
  4. Angir konfigurasjonen til hele cellen β = 1. Denne verdien kan være senere byttet til 0,1 å tillate registrering av større amplitude strømninger.
  5. Angi alle andre kontroll ringer til null eller i en nøytral posisjon.
  6. Starte programmet ved å dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  7. Klikk konfigurasjon | Digitaliseringsenhet åpne digitaliseringsenhet dialogboksen, og klikk deretter endre .
  8. I dialogboksen Endre digitaliseringsenhet Velg riktig digitaliseringsenhet fra listen Digitaliseringsenhet .
  9. Klikk knappen Skann for å oppdage digitaliseringsenhet.
  10. Klikk OK for å lukke dialogboksen Endre digitaliseringsenhet , og klikk deretter OK for å lukke dialogboksen digitaliseringsenhet .
  11. Klikk Configur | Lab-benken.
  12. I kategorien Inndata signaler på Lab-benkenangi skaleringsfaktoren til 0.0005 V/pA.
    Merk: Denne verdien må oppdateres hvis gevinst eller β verdiene endres.

12. pipette forskyvning

Merk: Fremgangsmåten nedenfor gjelder bare for gjeldende forsterker nevnt i Tabellen for materiale.

  1. Ved hjelp av brønnene, innskudd 200 nL vandig lipid løsningen "A" på endene av hver Ag/AgCl ledningen under olje.
  2. Bringe dråpene i kontakten og trykk ZAP -knappen på frontpanelet på forsterkeren til koaliserer dråpene til et volum spenner over begge elektrodene. Dette skal indusere en kortslutning svar.
  3. Angi kilde-måling modusbryteren til spor.
  4. Endre frontpanel Vis urskiven v spor.
  5. Slå PIPETTER OFFSET ringer (med klokken eller mot klokken) til meter leser 0 mV og er stabil.
  6. Hjem kilde-måling modusbryteren til V-KLEMME frontpanelet viser ekstern Vholder/Iholder.

13. dannelsen av Lipid-Bilayer

  1. Slipp dråpene som var tidligere avsatt ved å flytte elektrodene loddrett av olje fasen. Dette fører til dråper falle fra elektrodene i oljen. Nytt dukke og plasser elektrodene i olje.
  2. Bruke brønnene for innskudd 200 nL lipid løsning "A" på hver av ledninger.
  3. Vente på 3-5 minutter å gi spontan lipid monolayer montering å skje på hvert vann/olje-grensesnitt.
    Merk: som lipid monolayer former, vann/lipid/olje grensesnitt overflatespenning reduseres, noe som kan føre til dråper synke hvis omkringliggende olje er tilstrekkelig mindre tett21.
  4. Lavere elektroder (og dråper) til endene av begge elektrodene berøre knapt bunnen av oljereservoar (figur 1b), og deretter flytte dem horisontalt å bringe dråpene i kontakt.
    Merk: Lipid bilayer vil spontant tynn ved å ekskludere overflødig olje fra mellom kontakte dråpene. Denne prosessen oppstår vanligvis innen 1 min.

14. elektrisk karakteristikk av Biomolecular Memristor

  1. Lipid Bilayer formasjon
    1. For å registrere lipid bilayer formasjon, som tilsvarer en økning i elektriske kapasitans mellom vanndråper, bruke en 10 Hz, 10 mV trekantet bølgeform spenningen ved hjelp av en funksjonsgenerator (Figur 4) koblet til eksterne inngangen av oppdateringen klemmen forsterker.
      Merk: På grunn av kapasitive natur lipid membran, det gjeldende svaret bør være en firkantet bølgeform (Figur 4). Under lipid bilayer dannelsen, trinn 11,6, bør forskeren se en vekst i topp-til-topp gjeldende amplituden og også observere en visuell endring mellom tilkoblede dråper (Figur 4).
  2. Nåværende-spenning målinger
    Merk: Biomolecular memristor er modellert som en motstand og en kondensator i parallell12,21. Gjeldende svar på enheten kan derfor inneholde både holde igjen og akselrasjonsevner komponenter avhengig av hyppigheten av anvendt spenning. Å studere memristive natur enheten, og å få klemt hysteretic strøm-spenning relasjon12, kan det være nødvendig å trekke kapasitiv gjeldende fra total gjeldende. Protokollen nedenfor beskriver denne prosedyren.
    1. En funksjonsgenerator, bruk en spenning bølgeform (triangulære eller sinusformet) på en alamethicin-fri lipid membran samlet med dråper løsning "A".
    2. Registrere indusert gjeldende svar over flere frekvenser.
      Merk: Kapasitiv strøm minimeres på frekvenser under 10 mHz.
    3. Registrere størrelsen på interfacial lipid bilayer enten måle diameteren på lipid membran på datamaskinen eller registrere topp-til-topp gjeldende amplituden fra 10 Hz, 10 mV trekantet bølge. Gjeldende amplituden er proporsjonal med membran kapasitans, som er proporsjonal med området av membranen.
    4. Fjerne dråpene som inneholder ingen alamethicin.
    5. Legg til nye vandig dråper med løsningen "C" og danne en lipid bilayer.
    6. Bruk micromanipulators for å justere kontakt mellom dråper slik at bilayer har et tilsvarende område (diameter eller square-bølge gjeldende amplituden) som dannet tidligere.
    7. Gjenta 14.2.1 og 14.2.2.
    8. Trekk gjeldende i trinn 14.2.2 fra gjeldende registrert i trinn 14.2.7.
    9. Tegne indusert gjeldende versus anvendt spenning for hver frekvens og bølgeform du skaffer memristive "klemt hysteresis".
  3. Puls eksperimenter
    1. Bruker en egendefinert programmering programvare og analoge spenningskilde, Generer spenning pulser med bestemte høy og lav amplituder, tid, og på tid.
      Merk: Dette er ikke nødvendig hvis spenning-pulser kan genereres ved hjelp av en kommersiell funksjonsgenerator.
    2. Registrer gjeldende svar på anvendt pulser.
    3. På grunn av kapasitiv natur memristor registreres kapasitiv pigger. Fjerne toppene ved å bruke en low pass-filteret med passende passband.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser eksperimentelle oppsettet brukes til å montere og karakterisere biomolecular memristor. Senke de ledige endene på elektrodene til bunnen av oljereservoar, ble som vist i figur 1b, funnet nyttig for å redusere vibrasjoner elektroder og dråper som kan resultere i variasjoner i målte strøm og bilayer området, spesielt i tilfeller der varme oljen kan generere konvektive flyt i olje. Figur 2 viser prosedyren og resultatet i sammenstillingen av Ag/AgCl ledninger klasse kapillærene og elektroden og brønnene holdere. Oppsettet ligger innenfor et jordet Faraday bur (Figur 3) å redusere elektromagnetisk interferens.

Det er viktig å danne en stabil, isolerende lipid bilayer for denne studere. I denne protokollen samler en lipid monolayer på olje/vann grensesnittene i vandig dråpene nedsenket i oljen. Ved kontakt mellom dråper, overflødig olje er utelukket, og de motsatte lipid monolayers tynn til en 5-nm tykk lipid bilayer. Den vanligste metoden brukes i bilayer elektrofysiologi er spenning-klemme, hvor spenningen over bilayer kontrolleres og indusert gjeldende måles.  Figur 4a skildrer kapasitiv square-bølge gjeldende indusert av en 10 mV, 10 Hz spenning under bilayer formasjon. Mens amplituden øker på start bilayer tynning og påfølgende radial utvidelse av tynnet membranen, fortsatt bølgeform kvadrat. Bruker stabil amplituden til firkantbølge gjeldende, kan nominell området lipid bilayer beregnes ved hjelp av en forhåndsdefinert verdi av bestemte membran kapasitans for DPhPC bilayer21.  Også kan bilayer området visuelt vurderes ved måling av bilayer diameter fra et bilde tatt med mikroskopet figur 4b. For nøyaktig lipid bilayer området beregninger henvises leseren til Taylor, et al.21. Området av lipid-bilayer kan justeres ved å endre de relative plasseringene til dråper21,31.

Ved bruk av en spenning bias til en alamethicin-fri lipid bilayer, vil gjeldende svar variere avhengig av hyppigheten av spenningen. På lave frekvenser (< 10-50 mHz), hvor motstanden av bilayer dominerer den kompleks impedansen, ohmsk gjeldende svaret er ubetydelig fordi nominell membran motstanden er vanligvis større enn 10 GΩ. Som inndata frekvensen bidrar membran kapasitans mer til impedans på systemet, som resulterer i null gjeldende svaret vises i plottet av gjeldende versus spenning i figur 5a. Når den samme input spenning bølgeform (150 mV) brukes biomolecular svar som består av en alamethicin-dopet lipid membran, og når spenning amplitude overgår en kritisk innsetting terskel (~ 100 mV for en DPhPC membran ved romtemperatur), alamethicin peptider bosatt på overflaten av lipid-bilayer inn i membranen og samle til skjemaet ledende porene. Terskel-avhengige dannelsen av ionekanaler resulterer i en lineær makroskopisk gjeldende respons, med eksponentielt økende strøm ved spenninger høyere enn innsetting terskelen (figur 5b). Mens alamethicin peptider er kjent form rette opp ionekanaler bare med tilstrekkelig positiv spenninger, skyldes symmetrisk natur disse gjeldende svar på begge polariteter innsetting og samling av separate bestander av peptider, hver fra motsatt side av membranen. Avhengig av hvor ofte anvendt spenning, kan indusert gjeldende svaret også inneholde bidrag fra kapasitiv gjeldende. Derfor må kapasitiv strømmen i figur 5a trekkes fra det totale gjeldende vises i figur 5b for å få bare memristive klemt hysteresis strøm-spenning svaret, vises i figur 5 c, d.

Figur 6 viser dynamisk veksling responsen på en biomolecular memristor indusert av en spenning puls tog (130 mV (høy), 20 mV (lav), 100 ms (på), 20 ms (OFF)). AV spenningen er valgt på 20 mV å skille retur av enheten til en isolerende tilstand som alamethicin kanaler forlate bilayer fra gjeldende bare forsvinne på null-volt inngang. Den kumulative økningen i ON-state dagens under påfølgende spenning pulser representerer sammen-pulsed tilrettelegging, en plastisitet at flyktige biomolecular memristors er i stand til å stille12.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell oppsett og hoveddeler. (en) standard arbeidsstasjonen for montering og karakterisere biomolecular memristor inneholder en invertert mikroskop, 3-akse micromanipulators, et digitalt kamera, en vibrasjon isolasjon tabell, en elektrodeholderen, et glass brønnene holder, en gjeldende forsterker, en funksjonsgenerator og en oljereservoar. Oppsettet er montert på scenen av mikroskopet som beskrevet i trinn 11-13. (b) et zoomet inn bilde av oppsettet viser tips av Ag/AgCl ledninger berøre bunnen på oljereservoar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Elektrode forberedelse prosedyren. Fotografier viser: (en) sølv ledninger soaking i blekemiddel; (b) en elektrodeholderen; (c) en 5 cm lange glass kapillær koblet til elektrodeholderen; (d) en Ag/AgCl elektrode matet gjennom glass kapillær; (e) et glass brønnene holder; og (f) i ferdigmonterte elektroder og holdere.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Jording prosedyren. Fotografier viser: (en) en skrue gjenger i vibrasjon isolasjon tabellen overflaten til bakken buss når koblet til jorden bakken; og (b) en lab-laget Faraday bur dekker olje reservoaret og elektroden oppsettet å skjerme målenheten fra elektromagnetisk interferens. Både buret og mikroskopet scenen er knyttet til bakken buss via kabler I og II. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Sanntid gjeldende målinger viser første bilayer tynt og areal vekst. (en) gjeldende målt (øverst) under spontan bilayer formasjon mellom lipid-belagt dråper som svar på en trekantet bølgeform spenning. Omfanget av den målte strømmen er direkte proporsjonal med kapasitans av grensesnittet og dermed området i bilayer. Området på grensesnittet kan endres ved å endre avstanden mellom de to slippverktøy rentebærende elektrodene. (b) et bilde ervervet gjennom Invertert mikroskop viser en nedenfra og dimensjonene til en typisk membranbasert biomolecular memristor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Strøm-spenning forhold og klemt hysteresis. (en) den nåværende-spenningen svar av en alamethicin-gratis DPhPC lipid bilayer. En lipid-bare membran er svært isolerende (~ 10 GΩ), som forklarer lav ohmsk gjeldende svar på 0.017 Hz, en frekvens der impedansen domineres av membran motstand. Ved høyere frekvenser bidrar membran kapasitans mer betydelig til den totale impedansen på grensesnittet, noe som resulterer i en ikke-null indusert kapasitiv gjeldende. (b) dynamisk nåværende-spenning relasjonene versus frekvensen av en lipid bilayer dannet mellom to dråpestørrelse inneholder alamethicin peptider (innhentet med en trekantet inngang bølge). (c) i memristive, klemt hysteretic gjeldende svar på enheten hentes ved å trekke kapasitiv gjeldende vises i en fra total gjeldende vises i b. (d) Zooming inn å fremheve forskjellene mellom totalt og memristive strøm.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Svar av biomolecular memristors rektangulære spenning pulser og plastisitet. Enheten svarer på etterfølgende spenning pulser med en økning i konduktans under tid, til tross for midlertidig gjenopprette en isolerende tilstand under hver av tid. Økningen i gjeldende fra puls puls viser at den øyeblikkelig konduktans enheten er en funksjon av både nåværende stimulans og tidligere stimuli, slik som kortsiktig plastisitet i bio-synapser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokumentet presenterer en protokoll for montering og karakterisere biomolecular memristors basert på ion kanal-dopet syntetiske cellemembraner dannet mellom to vanndråper i olje. Soft-saken, to-terminal enheten er designet og studerte til: 1) overvinne begrensninger som er forbundet med SSD-teknologi, slik som høy støy, høyt energiforbruk og høy bytte spenninger, 2) nærmere etterligner komposisjon, struktur bytte mekanismer for biologiske synapser og 3) utforske mekanismer og funksjonene i bio-synapse plastisitet som ikke er utstilt av solid-state enheter.

Slippverktøy grensesnittet bilayer teknikk21, som representerer byggeblokken av nåværende teknologi12, er en enkel, modulære tilnærming for membran samlingen som er mye brukt til å studere membran biofysikk21, proteiner22, ion kanaler29og andre biomolecules32. Det tilbyr spesielle fordeler for nøyaktig kontroll og avhøre modell membraner, og representerer en byggestein for stimuli-responsiv og autonome26. Flere metoder har blitt utviklet å montere slippverktøy grensesnittet bilayers, inkludert hengende slippe21 metode som ble som den viktigste metoden å utvikle og karakterisere biomolecular memristor. Selv om denne membranen montering teknikken ble brukt i tidligere studier, presenterer her vi en grundig protokoll som tillater forskere å gjenskape og studere memristive slippverktøy grensesnittet bilayers i egne laboratorier. Protokollen er spesielt skrevet på en måte som tillater forskere i-materialet biologi felt, for eksempel neuromorphic samfunnet, å forstå og gjenskape disse prosedyrene.

I sin enkleste form er kan protokollen vi har beskrevet her for å vurdere memristive-funksjonalitet for en biomembrane replikeres med grunnleggende laboratorieutstyr som en funksjonsgenerator, et mikroskop og en gjeldende måling system. Montert enheten er elektrisk tilsvarer en motstand (~ 10 GΩ) og en kondensator kablet parallelt. I nærvær av peptider, som alamethicin, som er i stand til å danne spenning-avhengige porene i membranen, membran motstanden betydelig drops og resistiv gjeldende kan oppdages svar på inngangssignaler spenning (DC eller AC). Men den store membranen motstand og frekvens-avhengige elektrisk impedans på enheten mener at: 1) indusert strøm er liten (pA-nA), og utsatt for elektromagnetisk interferens; og 2) må utvises nøyaktig indusere og måle egenskapene ønsket memristive separat fra kapasitiv membran svar, henholdsvis. Svar på AC spenning, og avhengig av hyppigheten av signalet inneholder innspilt gjeldende både kapasitiv og resistiv komponenter. For å oppnå den klemt hysteresis, som er en signatur memristive enhet, må man følge protokollen som beskrevet i trinn 14. Hengende ledningene er mottakelige for vibrasjoner, som kan resultere i artefactual svar som svingninger feilaktig tilskrevet faktiske dynamikken i enheten. Posisjonering ledningene nederst oljereservoar ameliorates dette.

Biomolecular memristor med sin nåværende struktur og design emulerer kortsiktige synaptiske plastisitet som oppstår i presynaptic terminalen. Det etterligner også noen av mekanismer som forårsaker presynaptic sammenkoblet pulserende tilrettelegging i hjernen som følge av akkumulering og uttømming av nevrotransmitter blemmer i presynaptic Nevron. Denne metoden for montering synaptic imiterer aktiverer studie og validering av biomimetic prosesser ansvarlig for mange typer kortsiktige plastisitet og optimalisering av fleksibilitet og skalerbarhet ikke mulig med andre teknologier33. Uforutsette funksjonalitet kan oppdages ved enten å endre membran sammensetningen, kanaltypene ion som er innlemmet i membranen, og selv antall tilkoblede dråper og interfacial membraner utgjør hver to-terminal enhet. Eksempelvis har vi nylig vist online læring egenskapene til biomolecular memristor av grensesnitt det med en SSD Nevron34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC, under Kontraktnr. DE-AC0500OR22725 med US Department of Energy. USAs regjering beholder og utgiveren, godtar artikkelen for publikasjonen, erkjenner at myndighetene i USA beholder en ikke-eksklusiv, innbetalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere publisert form av dette manuskriptet, eller tillate andre å gjøre det, for å myndighetene i USA.

Acknowledgments

Økonomisk støtte ble levert av den National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Forskning for G.J.T., C.D.S., A.B., og C.P.C. ble delvis sponset av Laboratory regissert forskning og utvikling programmet av Oak Ridge National Laboratory, administrert av UT-Battelle, LLC, for US Department of Energy. En del av denne forskningen ble utført ved Center for Nanophase materialer fag, som er en DOE kontoret av vitenskap bruker anlegget.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P/850356C Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) 
Agarose  Sigma-Aldrich A9539
Agarose (0.5g Agarose Tablets) Benchmark A2501 You can either use the powder form or the tablets 
Alamethicin  AG Scientific A-1286
Analytical balance  Mettler Toledo ME204TE/00
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Brain Total Lipid Extracts (Porcine) Avanti Polar Lipids 131101
DigiData 1440A system Molecular Devices -
Extruder Set With Holder/Heating Block  Avanti Polar Lipids 610000 This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block
Freezer (-20 °C) VWR International SCUCBI0420AD
Glassware VWR International -
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Nitrogen (N2) Gas Airgas UN1066
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film Parafilm PM999
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Precleaned Microscope Sildes  Fisher Scientific  22-267-013
Refrigirator (4 °C) VWR International SCUCFS-0504G
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Stirring Hot Plate Thermo Scientific  SP131325
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  2. Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
  3. Benfenati, F. Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory. Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 78 (1Suppl), 58-66 (2007).
  4. Marx, G., Gilon, C. The molecular basis of memory. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 633-642 (2012).
  5. Izquierdo, I., Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiology of learning and memory. 68 (3), 285-316 (1997).
  6. Merolla, P. A. A million spiking-neuron integrated circuit with a scalable communication network and interface. Science. 345 (6197), 668-673 (2014).
  7. Benjamin, B. V. Neurogrid: A mixed-analog-digital multichip system for large-scale neural simulations. Proceedings of the IEEE. 102 (5), 699-716 (2014).
  8. Furber, S. Large-scale neuromorphic computing systems. Journal of neural engineering. 13 (5), 051001 (2016).
  9. Di Ventra, M., Pershin, Y. V. The parallel approach. Nature Physics. 9 (4), 200-202 (2013).
  10. Chua, L. Memristor-the missing circuit element. IEEE Transactions on circuit theory. 18 (5), 507-519 (1971).
  11. Di Ventra, M., Pershin, Y. V., Chua, L. O. Circuit elements with memory: memristors, memcapacitors, and meminductors. Proceedings of the IEEE. 97 (10), 1717-1724 (2009).
  12. Najem, J. S. Memristive Ion Channel-Doped Biomembranes as Synaptic Mimics. ACS Nano. , (2018).
  13. Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S. The missing memristor found. Nature. 453 (7191), 80-83 (2008).
  14. Prezioso, M. Training and operation of an integrated neuromorphic network based on metal-oxide memristors. Nature. 521 (75550), 61-64 (2015).
  15. Prodromakis, T., Toumazou, C., Chua, L. Two centuries of memristors. Nature Materials. 11 (6), 478 (2012).
  16. Berzina, T. Optimization of an organic memristor as an adaptive memory element. Journal of Applied Physics. 105 (12), 124515 (2009).
  17. van de Burgt, Y., Melianas, A., Keene, S. T., Malliaras, G., Salleo, A. Organic electronics for neuromorphic computing. Nature Electronics. 1, (2018).
  18. Dan, Y., Poo, M. M. Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception. Physiological reviews. 86 (3), 1033-1048 (2006).
  19. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Reviews of Physiology. 64 (1), 355-405 (2002).
  20. Shepherd, J. D., Huganir, R. L. The cell biology of synaptic plasticity: AMPA receptor trafficking. Annual Review of Cell Developmental Biology. 23, 613-643 (2007).
  21. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  22. Najem, J. S. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  23. Taylor, G. J. Capacitive Detection of Low-Enthalpy, Higher-Order Phase Transitions in Synthetic and Natural Composition Lipid Membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  24. Taylor, G. Electrophysiological interrogation of asymmetric droplet interface bilayers reveals surface-bound alamethicin induces lipid flip-flop. Biochimica et biophysica acta (BBA)-Biomembranes. , (2018).
  25. Sarles, S. A., Garrison, K. L., Young, T. T., Leo, D. J. Formation and Encapsulation of Biomolecular Arrays for Developing Arrays of Membrane-Based Artificial Hair Cell Sensors. Proceedings of the Asme Conference on Smart Materials, Adaptive Structures and Intelligent Systems (Smasis 2011), Vol 2. , 663-671 (2011).
  26. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. Smart Materials & Structures. 20 (9), (2011).
  27. Sarles, S. A. Physical encapsulation of interface bilayers. , Virginia Tech. (2010).
  28. JoVE Science Education Datatbase. Organic Chemistry II. Cleaning Glassware. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  29. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using Escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2014).
  30. Shlyonsky, V., Dupuis, F., Gall, D. The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. Plos One. 9 (9), e108097 (2014).
  31. Najem, J. S. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  32. Bayley, H. Droplet interface bilayers. Molecular Biosystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  33. Nguyen, M., Srijanto, B., Retterer, S., Collier, C. P., Sarles, S. A. Hydrodynamic trapping for rapid assembly and in situ electrical characterization of droplet interface bilayer arrays. Lab on a Chip. 16, 3576-3588 (2016).
  34. A Soft-Matter Biomolecular Memristor Synapse for Neuromorphic Systems. Weiss, R., Najem, J. S., Hasan, M. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Collier, C. P., Sarles, S. A., Rose, G. S. IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference (BioCAS), 1984 Mar 30-31, Cleveland, Ohio, , (2018).

Tags

Bioteknologi problemet 145 mikroelektronikk bioteknologi (generelt) kunstig intelligens Engineering Engineering (generelt) elektronikk og elektroteknikk biovitenskap biovitenskap (generelt) matematisk og computer sciences Kybernetikk kunstig intelligens og robotikk Biomolecular memristor alamethicin memristor ion kanal biomembrane neuromorphic computing lipid bilayer synapse synaptic etterligne
Montering og karakterisering av Biomolecular Memristors bestående av Ion kanal-dopet Lipid membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najem, J. S., Taylor, G. J.,… More

Najem, J. S., Taylor, G. J., Armendarez, N., Weiss, R. J., Hasan, M. S., Rose, G. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Sarles, S. A., Collier, C. P. Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (145), e58998, doi:10.3791/58998 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter