Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Samling og karakterisering af Biomolekylær Memristors bestående af Ion-kanal-doped Lipid membraner

Published: March 9, 2019 doi: 10.3791/58998
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 5, 5, 5, 6, 7, 2, 2,3,7
1Joint Institute for Biological Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 3Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee, 4Department of Biosystems and Agriculture Engineering, University of Kentucky, 5Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Tennessee, 6Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 7Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Blød, energibesparende, Biomolekylær memristors udnytte lignende sammensætning, struktur, og skifte mekanismer af bio-synapser. Præsenteres her er en protokol til at samle og karakterisere Biomolekylær memristors fremstillet af isolerende lipid dobbeltlag dannet mellem vanddråber i olien. Indarbejdelse af spænding-aktiveret alamethicin peptider resultater i memristive ionisk ledningsevne på tværs af membranen.

Abstract

Evnen til at genskabe synaptic funktionaliteter i syntetisk kredsløbselementer er afgørende for neuromorphic edb-systemer, der forsøger at efterligne de kognitive beføjelser af hjernen med sammenlignelige effektivitet og tæthed. Til dato, har silicium-baserede tre-terminal transistorer og to-terminal memristors været meget anvendt i neuromorphic kredsløb, i stor del på grund af deres evne til at samarbejde finde informationsbehandling og hukommelse. Men disse enheder ikke kan opnå sammenkobling og kompleksiteten af hjernen, fordi de er magtbegærlige, undlader at efterligne centrale synaptic funktionaliteter, og lider af høj støj og høj skifte spændinger. For at overvinde disse begrænsninger, har vi udviklet og karakteriseret en Biomolekylær memristor, der efterligner sammensætning, struktur og skifte Karakteristik af biologisk synapser. Her, vi beskriver processen med at samle og kendetegner Biomolekylær memristors bestående af en 5 nm tykke lipid tolagede dannet mellem lipid-functionalized vanddråber i olien og dopet med spænding-aktiveret alamethicin peptider. Mens lignende forsamling protokoller har været brugt til at undersøge biofysiske egenskaber af droplet-støttede lipid membraner og membran-bundet Ionkanaler, fokuserer denne artikel på centrale ændringer af droplet interface tolagede metoden afgørende for at opnå ensartet memristor ydeevne. Specifikt, beskriver vi Liposom forberedelsesprocessen og indarbejdelse af alamethicin peptider i lipid tolagede membraner, og de relevante koncentrationer af hver bestanddel samt deres indvirkning på den samlede respons af memristors. Vi også detalje karakterisering proces af Biomolekylær memristors, herunder måling og analyse af memristive nuværende spænding relationer opnået via cykliske voltammetry samt kortsigtede plasticitet og læring som svar på trinvis spænding puls tog.

Introduction

Det er almindeligt anerkendt, at biologisk synapser er ansvarlig for høj effektivitet og enorme parallelitet af hjernen på grund af deres evne til at lære og bearbejde information i yderst adaptiv måder. Denne koordinerede funktionalitet fremgår af flere meget komplekse molekylære mekanismer der drev både kortsigtede og langsigtede synaptisk plasticitet1,2,3,4,5. Neuromorphic computersystemer har til formål at efterligne synaptic funktionaliteter på niveauer nærmer tæthed, kompleksitet og energieffektivitet i hjernen, som er nødvendige for den næste generation af hjerne-lignende computere6,7 , 8. dog reproducere synaptic funktioner ved hjælp af traditionelle elektroniske kredsløbselementer er stort set umuligt9, i stedet kræver design og fabrikation af ny hardware elementer, der kan tilpasse sig til indkommende signaler og huske oplysninger historie9. Disse typer af synapse-inspirerede hardware er kendt som mem-elements9,10,11 (forkortelse for hukommelse elementer), som ifølge Di Ventra et al.9,11, er passive, to-terminal enheder hvis modstand, kapacitans eller induktans kan omkonfigureres som svar på eksterne stimuli, og som kan huske tidligere stater11. For at opnå energi forbrug nærmer sig dem i hjernen, bør disse elementer ansætte lignende materiale og mekanismer for synaptisk plasticitet12.

Til dato, har to-terminal memristors13,14,15 overvejende været bygget ved hjælp af supplerende metal oxide semiconductor (CMOS) teknologi, karakteriseret ved høj-switching spændinger og høj støj. Denne teknologi skalerer ikke godt på grund af højt strømforbrug og lav befolkningstæthed. For at løse disse begrænsninger, har flere organisk og polymeriske memristors været for nylig bygget. Men disse enheder udviser betydeligt langsommere skifte dynamics på grund af tidskrævende ion diffusion gennem en ledende polymer matrix16,17. Som et resultat, er de mekanismer, hvorved begge CMOS-baseret og organiske memristive enheder emulere synapse-inspirerede funktionaliteter meget fænomenologisk, omfatter kun et par synaptic funktionaliteter såsom Spike Timing afhængige plasticitet (STDP) 18, mens med udsigt over andre vigtige funktioner, der også spiller en afgørende rolle i at hjernen en kraftfuld og effektiv computer, såsom pre synaptic, kortsigtede plasticitet19.

For nylig har indført vi en ny klasse af memristive enheder12 byder på spænding-aktiveret peptider indarbejdet i biomimetiske lipid membraner der efterligner Biomolekylær sammensætning, membran struktur og ion kanal udløst skifte mekanismer af biologisk synapser20.  Her, vi beskriver, hvordan du samler og elektrisk afhøre disse to-terminal enheder, med særlig fokus på hvordan man kan evaluere kortsigtede plasticitet for gennemførelsen i online læring programmer12. Enhed forsamling er baseret på dråbe interface tolagede (DIB)21 metode, som har været udbredt i de seneste år til at studere Biofysik model membraner21 og membran-bundet ion kanaler22,23, 24, og som byggesten for udvikling af stimuli-responsive materialer25,26. Vi beskriver membran forsamling og forhør processen i detaljer for dem interesseret i neuromorphic applikationer, men har begrænset erfaring i biomaterialer eller membran biologi. Protokollen indeholder også en fuld beskrivelse af proceduren, karakterisering, der er så vigtig forsamling-processen, i betragtning af enheden27dynamisk og omkonfigurerbare elektriske egenskaber. Procedure og repræsentant resultaterne beskrevet her er grundlaget for en ny klasse af lavprisselskaber, low-power, blød mem-elementer baseret på lipid grænseflader og andre biomolekyler til applikationer i neuromorphic computing, autonome strukturer og systemer, og endda adaptive hjerne-computer grænseflade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generelle anvisninger og forholdsregler

  1. Vælg egnet, ubeskadiget måling/blanding glasvarer (kolber, bægre, osv.) og andre labware (spatler, skeer, etc.) til brug.
  2. Håndtere glasvarer omhyggeligt for at undgå at beskadige, og bære latex eller nitril handsker til at undgå at forurene glasvarer/labware med rester fra fingerspidserne og til at beskytte din hud.
  3. Ren valgte glasvarer/labware grundigt med rengøringsmiddel og vand ved at skrubbe med en blød flaske børste indtil ren og alle rester er fjernet.
  4. Skyl grundigt med postevand og derefter med deioniseret vand (DI) vand. Sted på tørrestativ til luft tørre.
  5. Valgfri: Skyl den rengjorte glas/labware med isopropylalkohol (IPA, 99,5%) og sted under vakuum til at fordampe alle resterende IPA for at sikre de er fri for kontaminanter (~ 2 h). Fjern fra vakuumkammer og placere i rent miljø.
    Bemærk: Brug fnugfri klude til aftørring glasvarer og labware. Køb og brug sterile små hætteglas og sikker-lock rør for forberedelse og prøve opbevaring af materialer. For yderligere detaljer om glasvarer rengøring og øvrige standardforskrifterne for laboratoriet, henvises til JoVE videnskab uddannelse Database28.

2. forberedelse af vandige stødpudeopløsning

  1. Iført latex eller nitril handsker, skal du vælge en passende og ren glasbeholder at forberede 50 mL vandig buffer (500 mM natriumchlorid (KCl), 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER), pH 7,0).
  2. Ved hjælp af en digital, høj præcision massebalance og en ren spatel, dispensere 1.86378 g af KCl på ren vejer papir og derefter føje til glasindsatsen.
    Bemærk: Mængderne af KCl og MOPS bør variere afhængigt af den ønskede lydstyrke og ønskede endelige koncentrationer.
  3. 0.10463 g af MOPPER og tilføje til glasbeholder. Derefter tilsættes 50 mL Deioniseret vand til glasbeholder og vortex grundigt indtil KCl og MOPPER er helt opløst.
  4. Gemme bufferopløsning ved stuetemperatur og bruge efter behov.
    Bemærk: Mens buffer løsninger kan gemmes i relativt lang tid, er det anbefales at bruge frisklavede buffer løsninger for bedre og mere konsistente resultater.

3. forberedelse af Liposomer

Bemærk: Trin 3.1 gælder kun hvis fosfolipider er erhvervet som frysetørret pulver, og derfor må være hoppet hvis Fosfolipiderne er købt i chloroform.

  1. 5 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) eller hjernen samlede Lipid ekstrakter (BTLE) lipider i 1 mL chloroform i en 5 mL sterilt glas hætteglas opløses.
  2. Mens forsigtigt hvirvlende, fordampe chloroform under en svag luftstrøm fra tør nitrogen indtil en lipid film tilbage i bunden af hætteglasset.
  3. Placer hætteglasset indeholdende lipid filmen under vakuum til 10-12 h til fuldstændig fjernelse af resterende chloroform.
  4. Fjern hætteglasset fra den vakuumkammer og Rehydrér lipid filmen ved at tilsætte 10 mL stødpudeopløsning vandig parat i trin 2 til at opnå en endelig lipid koncentration 2 mg/ml.
  5. Fryse (-20 °C) og helt tø lipid suspension seks gange til at lette multilamellar Liposom forsamling.
    Bemærk: Lad blandingen tø op ved stuetemperatur, aldrig i et opvarmet miljø.
  6. Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig ekstruder, ekstrudering Liposom løsning ved at tvinge komplet lipid suspension gennem en 0,1 μm pore diameter track-ætset membran. Presse suspension 11 gange i umiddelbar træk at få unilamellar Liposomer med diametre af c.a. 100 nm behov for ordentlig lipid éncellelag dannelse. Opbevares Liposom suspension ved 4 °C og anvendes inden for 1 uge af forberedelse. For enkelhed, henvise til den resulterende Liposom løsning som "A".
    Bemærk: For ekstrudering af BTLE Liposomer, forskeren er opfordret til at varme op ekstruder til 45-50 °C, højere end fase overgangen temperatur af BTLE lipider (~ 37 °C)23,29, aktivere lettere ekstrudering. Hydreret BTLE Liposom suspensioner også kan være direkte forberedt (i stedet for fryse-tø og ekstrudering) ved at placere lukkede suspension hætteglasset ind i et badekar sonikator ved 55 °C for ~ 15 min.

4. rekonstituering af Alamethicin peptider

Bemærk: Denne procedure beskriver processen for alamethicin rekonstituering i Liposomer til en endelig koncentration på 1 μM. Denne koncentration er tilstrækkelig til at fremkalde nA-niveau strøm svarende til de tidligere udgivet12. Øger peptid koncentrationen vil reducere den skifte tærskel og øge amplituder af strømninger induceret af anvendt spænding29.

  1. Opløs alamethicin peptider i ethanol til en endelig koncentration på 2,5 mg/mL, vortex kortvarigt at blande godt, og gemme stamopløsningen i fryser (-20 °C).
    Bemærk: Alamethicin peptider er normalt købes i pulverform.
  2. En 1,5 mL sikker-lock tube, bland 99 μL af løsning "A" med 1 μL alamethicin stamopløsning at opnå en endelig alamethicin koncentration af 13 μM i Liposom suspension.  Vortex at blande godt. Henvise til den resulterende peptid-Liposom løsning som "B".
  3. Mix 117 μl opløsning "A" med 10 μL af løsning B at opnå en endelig alamethicin koncentration på 1 mM, og derefter vortex at blande godt. Henvise til den resulterende løsning som "C".
  4. Gemme løsninger " "B "" og "C"" på 4 °C og brug efter behov.

5. forberedelse af agarosegel

  1. Ved hjælp af en digital, høj præcision massebalance og en ren spatel, tilsættes 0,5 g Agarosen pulver til en ren vejer papir.
  2. Overførsel vejes Agarosen til en 100 mL ren glas bægerglas og tilsættes 50 mL Deioniseret vand til agarosegelelektroforese.
    Bemærk: Dette vil give en 1% (wt/vol) Agarosen gelopløsning.
  3. Læg en ren omrøring magnet inde glas bægerglas og Bægerglasset anbringes på en omrøring varmeplade.
  4. Bring blandingen i kog under omrøring, indtil Agarosen er fuldstændigt opløst.
  5. Fjerne bægerglasset fra varmeplade til Lad blandingen afkøle til stuetemperatur. Opbevares ved 4 °C og bruge efter behov.
  6. Før du bruger igen, igen smelte Agarosen ved opvarmning med en varmeplade eller mikroovn.

6. fabrikation af olieglasset

Bemærk: Nedenstående fremgangsmåde er blot en af mange måder at en olieglasset kan være opdigtet. Læseren opfordres til at designe og fabrikere et reservoir, baseret på tilgængelige materialer, bearbejdning kapaciteter, og specifikke behov.

  1. Brug en båndsav, skåret en 12 x 12 x 12 mm akryl kuben fra en større 12 mm tykke akryl plader.
  2. Mill en 12 mm diameter hul til en dybde af 8-12 mm i akryl røret (figur 1a).

7. fremstilling af elektroder

  1. Ved hjælp af saks, skåret to stykker (75 mm) af sølv ledninger (125 μm-diameter).
  2. Bruger en åben-flame lighter, smelte ene ende af hver sølvtråd at form små sfæriske kugler (ca. 250 μm i diameter).
  3. Fordyb kugleender i blegemiddel for 1-2 h til at skabe en sølv sølv-chlorid (Ag/AgCl) belægning. En mørk grå farve indikerer, at Ag/AgCl belægning har dannet (figur 2a).
  4. Fjerne begge ledninger fra blegemiddel, skyl grundigt med Deioniseret vand og læg til side på en ren fnugfri serviet.
  5. Dyp bolden ender i smeltet agarosegel til at oprette et tyndt lag. Denne gel belægning hjælper til at forankre de vandige dråber på ledninger under olie.
  6. Bruger et glas cutter, opdele en 10 cm lang, 1/0,58 OD ID mm borsilikatglas kapillær i to 5 cm kapillærer.
  7. Indsæt en af glas kapillærer i en elektrode indehaveren (figur 2b, c), og derefter feed en af Ag/AgCl wire i glasset kapillær (figur 2d). Fodre de andre Ag/AgCl wire i det andet glas kapillær.
  8. Montere den anden glas kapillær til et glas mikropipette indehaveren (figur 2e, f).

8. opsætning af eksperimentet

  1. Placer en 1 mm tyk, 25 x 75 mm glas dias på scenen i en inverteret mikroskop (figur 1a).
  2. Undvære et par dråber af hexadecane olie på midten af glas dias, og derefter placere olieglasset direkte på olien på glas dias.
    Bemærk: Tilføje olie mellem glas dias og olie reservoir bruges til at matche brydningsindekset af substrat til give klarere og skarpere billeder.
  3. Helt udfylde olieglasset med hexadecane olie. Kontroller, at reservoiret er placeret over den objektive linse.
    Bemærk: Andre hydrofobe olier kan bruges som godt.
  4. Tilsluttes headstage af en nuværende forstærker elektrode indehaveren. Headstage skal være monteret på en micromanipulator (figur 1a) for at minimere elektrode længde og elektrisk støj.
  5. Mount glas mikropipette holder med den anden Ag/AgCl wire på en anden micromanipulator (figur 1a).
  6. Ved hjælp af manipulatorer, stilling elektroderne således, at Agarosen belagt spidserne af Ag/AgCl ledninger er fuldt neddykket i olieglasset på en lignende lodret plan.
  7. Juster de to elektroder og adskille dem med et par millimeter (figur 1a, b).
    Bemærk: Efter at tilføje dråber (beskrevet i trin 13), ledningerne skal bringes helt ned indtil elektrode tips rører bunden af olieglasset. Dette trin sikrer, at ledningerne ikke svinge, og således vil minimere unødige udsving i den målte aktuelle.

9. ordentlig jordforbindelse for at reducere elektrisk støj

  1. Oprette en jorden bus ved threading en skrue i tabellen Vibrationsdæmpende hvorpå mikroskop er placeret (figur 3a).
    Bemærk: Ved hjælp af et Vibrationsdæmpende tabel er påkrævet for at minimere vibrationer fra de omkringliggende, som kan forårsage uønskede udsving i målte aktuelle.
  2. Ved hjælp af en ledende wire, tilslutte skruen en jorden jorden (figur 3a), og derefter tilslutte stadiet mikroskop til jorden bus.
  3. Placer et Faraday bur over den eksperimentelle setup til at reducere støj og derefter elektrisk forbinde det til jorden bus (figur 3b).
    Bemærk: Det er altid anbefales at undgå unødvendige jordsløjfer, da de kan føre til en stigning i måling støjniveau.

10. feedback-kontrolleret opvarmning

  1. Maskine en aluminium varme shell hvor olieglasset stramt passer29.
  2. Sørg for at efterlade en åbning i bunden af shell skal kunne se gennem shell via den omvendte mikroskop.
  3. Placer en 30 x 30 mm resistive polyimid fleksibel radiator under aluminium shell.
  4. Placer en isolerende Polydimethylsiloxan (PDMS) wafer under varmer at reducere varmetabet i nedadgående retning og beskytte mikroskop fase.
  5. Indsæt et termoelement i fasen for olie. Efter at sikre termoelement ikke røre begge Ag/AgCl wire, Tilslut termoelement ledningerne til et termoelement data erhvervelse board og optage temperatur ved hjælp af brugerdefinerede programmeringssoftware.
    Bemærk: Skrive en On-Off, proportional integreret (PI) feedback temperaturkontrol for at muliggøre opvarmning og passiv køling af olie temperatur til en ønskede værdi. Koderne kan leveres til læserne efter anmodning.

11. opsætning af Software og udstyr

  1. Forberede data erhvervelse software af kraftoverførsel på computere, mikroskop, funktionsgenerator, nuværende forstærker og støjsvage data erhvervelse systemer.
    Bemærk: Mens alle aktuelle sensing udstyr kan anvendes, følgende instruktioner er specifikt for den ene, der er anført i Tabel af materialer. Forskere, der ønsker at opbygge deres egne aktuelle forstærker kan henvise til Shlyonsky et al.30.
  2. På frontpanelet af patch klemme nuværende forstærker, sæt frontpanelets display og kilde-måling Mode ringer til VHOLD/IHOLD og V-CLAMP, henholdsvis.
  3. Frontpanelet, angive Lowpass Bessel-Filter til 1 kHz og Output få til 0,5.
    Bemærk: At vælge en lav produktion gevinst giver mulighed for optagelse af større højere nuværende amplituder, der henviser til, at øge gain ofre måleområdet for reducere måling støj.
  4. Indstille konfiguration til hele CELLEN β = 1. Denne værdi kan være senere skiftede til 0,1 tillade optagelse af større amplitude strømninger.
  5. Angiv alle andre kontrol ringer til nul eller i en neutral position.
  6. Initialisere programmet ved at dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  7. Klik på konfiguration af | Digitizer åbne dialogen Digitizer , og klik derefter på knappen Skift .
  8. Vælg den passende digitizer listen Digitizer Type i dialogen Ændring Digitizer .
  9. Klik på Skan for at opdage digitizer.
  10. Klik på OK for at afslutte dialogen Ændring Digitizer , og klik derefter på OK for at afslutte dialogen Digitizer .
  11. Klik på Configur | Lab bænk.
  12. Under fanen Input signaler i Lab bænkindstillet skaleringsfaktoren til 0.0005 V/pA.
    Bemærk: Denne værdi skal opdateres, hvis gevinst eller β værdierne ændres.

12. pipette forskydning

Bemærk: Nedenstående fremgangsmåde gælder kun for nuværende forstærker nævnt i Tabel af materialer.

  1. Ved hjælp af en mikropipette depositum 200 nL af vandige lipid løsning "A" på enderne af hver Ag/AgCl ledning under olie.
  2. Bringe dråber i kontakt og tryk på knappen ZAP på frontpanelet af forstærker til coalesce dråber i et volumen spænder begge elektroder. Dette bør fremkalde en kortslutning svar.
  3. Angiv kilde-måling funktionsvælgeren til spor.
  4. Ændre frontpanelets display dial- Vspor.
  5. Drej den PIPETTER OFFSET ringe (med uret eller mod uret) indtil måleren læser 0 mV og er stabil.
  6. Returnere funktionsvælgeren kilde-måling til V-CLAMP og frontpanelet vise dial til VHOLD/IHOLD.

13. dannelsen af Lipid tolagede

  1. Frigive de dråber, der tidligere blev deponeret ved at flytte elektroder lodret fra olie-fase. Dette forårsager dråber falder ned fra elektroderne ind i olie. Re nedsænkes og Placer elektroderne i olie.
  2. Bruge mikropipette til indbetaling 200 nL af lipid løsning "A" på hver af ledningerne.
  3. Vente 3-5 min at give mulighed for spontan lipid éncellelag forsamling at forekomme på hver vand/olie grænseflade.
    Bemærk: som lipid éncellelag former, lipid-vand-olie interface overfladespænding falder, hvilket kan forårsage droplets til at synke hvis det omkringliggende olie er tilstrækkelig mindre tætte21.
  4. Lavere elektroder (og dråber) indtil enderne begge elektroderne røre knap bunden af olieglasset (figur 1b), og derefter flytte dem vandret at bringe dråber i kontakt.
    Bemærk: Lipid tolagede vil spontant tynde ved at udelukke overskydende olie fra mellem kontakte dråber. Denne proces forekommer typisk, inden for 1 min.

14. elektriske karakterisering af Biomolekylær Memristor

  1. Lipid tolagede dannelse
    1. Hvis du vil optage lipid tolagede dannelse, som svarer til en stigning i elektriske kapacitans mellem dråber, anvende en 10 Hz, 10 mV trekantede bølgeform spænding ved hjælp af en funktionsgenerator (figur 4) tilsluttet det eksterne input af patch klemme forstærker.
      Bemærk: På grund af lipid membranen kapacitiv karakter den resulterende aktuelle svar skal være en firkantet bølgeform (figur 4). Under lipid tolagede dannelse, trin 11,6, bør forskeren se en vækst i top til top aktuelle amplitude og også observere en visuel ændring mellem forbundne dråber (figur 4).
  2. Aktuel spænding målinger
    Bemærk: Biomolekylær memristor er modelleret som en modstand og en kondensator i sideløbende12,21. Derfor, den aktuelle svar af enheden kan indeholde både holde igen og kapaciteter komponenter afhængig af hyppigheden af den anvendte spænding. At studere memristive karakteren af enheden, og at få klemt hysteretic nuværende spænding forholdet12, kan det være nødvendigt at fratrække kapacitive strøm fra den samlede nuværende. Protokollen nedenfor beskriver denne procedure.
    1. Med en funktionsgenerator, anvende en spænding bølgeform (trekantet eller sinusformet) til en alamethicin-fri lipid membranen samlet med dråber af løsning "A".
    2. Optage den inducerede aktuelle svar på tværs af flere frekvenser.
      Bemærk: Kapacitiv strømme er minimeret ved frekvenser under 10 mHz.
    3. Registrere størrelsen af interfacial lipid tolagede af enten måle diameteren af lipid membranen på computeren, eller ved at optage den top-til-top aktuelle amplitude som følge af 10 Hz, 10 mV trekantet bølge. Den nuværende amplitude er proportional med membran kapacitans, som igen er proportional med området af membranen.
    4. Fjern de dråber, der indeholder ingen alamethicin.
    5. Tilføje nye vandig droplets bruger løsning "C" og danne en lipid tolagede.
    6. Brug micromanipulators til at justere kontakt mellem dråber, sådan at tolagede har et lignende område (diameter eller square-bølge nuværende amplitude) som den ene dannede tidligere.
    7. Gentag trin 14.2.1 og 14.2.2.
    8. Subtrahere aktuelle registrerede i trin 14.2.2 fra nuværende registreres i trin 14.2.7.
    9. Afbilde den inducerede strøm versus anvendt spænding for hver frekvens og bølgeform at opnå "klemt hysterese" memristive svar.
  3. Puls eksperimenter
    1. Ved hjælp af en brugerdefineret programmeringssoftware og analog spændingskilde, generere spænding pulser med særlig høj og lav amplituder, til tiden og slukning.
      Bemærk: Dette er ikke nødvendigt hvis spænding pulser kan genereres ved hjælp af en kommerciel funktionsgenerator.
    2. Optage aktuelle svar på anvendes pulser.
    3. På grund af memristor kapacitiv karakter optages kapacitiv pigge. Fjerne spikes ved at anvende et low-pass filter med passende passband.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser den eksperimentelle indstillinger bruges til at samle og karakterisere Biomolekylær memristor. Sænke de frie ender af elektroder til bunden af olieglasset, blev som vist i figur 1b, fundet nyttigt at minimere vibrationer af elektroder og dråber, der kan resultere i variationer i målt strøm og tolagede område, navnlig i tilfælde hvor varme olien kan generere konvektive flow i olie. Figur 2 viser proceduren og resultatet af montage Ag/AgCl-ledninger, klasse kapillærer og elektrode og mikropipette indehavere. Opsætningen er opstaldet i en korrekt jordet Faraday bur (figur 3) for at minimere elektromagnetisk interferens.

Det er bydende nødvendigt at danne en stabil, isolerende lipid tolagede for denne undersøgelse. I denne protokol samler et lipid éncellelag på olie/vand-grænseflader af vandige dråber nedsænket i olie. Ved kontakt mellem dråber, overskydende olie er udelukket, og de indsigende lipid encellelag tynde til en 5-nm tykke lipid tolagede. Den mest almindelige teknik, der anvendes i tolagede Elektrofysiologi er spænding-clamp, hvor spændingen over tolagede er kontrolleret og den inducerede strøm måles.  Figur 4a skildrer den kapacitive square-bølge aktuelle induceret af en 10 mV, 10 Hz spænding under tolagede dannelse. Mens amplitude øger ved start tolagede udtynding og efterfølgende radial udvidelse af tyndet membranen, forbliver bølgeform firkantet. Brug af firkantet bølge nuværende steady-state amplitude, kan den nominelle område af lipid tolagede beregnes ved hjælp af en foruddefineret værdi af specifikke membran kapacitans for en DPhPC tolagede21.  Også, kan området tolagede vurderes visuelt ved måling af tolagede diameter fra et billede taget med mikroskop figur 4b. For nøjagtig lipid tolagede område beregninger, bør læseren henvises til Taylor, et al.21. Området af lipid tolagede kan reguleres ved at ændre de relative position af droplets21,31.

Efter anmodning af en bias i spænding til en alamethicin-fri lipid tolagede, vil den aktuelle svar variere baseret på hyppigheden af input-spændingen. Ved lave frekvenser (< 10-50 mHz), hvor modstanden i tolagede dominerer den komplekse impedans, den ohmske aktuelle svar er ubetydelig, fordi den nominelle membran modstand er typisk større end 10 GΩ. Som input hyppigheden stiger, bidrager membran kapacitans mere til impedans af systemet, hvilket resulterer i nul aktuelle svar vises i plot af nuværende kontra spænding i figur 5a. Når den samme input spænding bølgeform (150 mV) påføres et biomolekyles svar bestod af en alamethicin-doped lipid membranen, og når spænding amplituden overgår en kritisk indføring tærskel (~ 100 mV til en DPhPC membran ved stuetemperatur), alamethicin peptider bosat på overfladen af lipid tolagede indsætte i membranen og aggregere til form ledende porer. Tærskel-afhængige dannelsen af Ionkanaler resulterer i en ikke-lineær makroskopisk aktuelle svar, med eksponentielt stigende strømninger på spændinger højere end tærsklen indsættelse (figur 5b). Mens alamethicin peptider er kendt for at danne rektifikation Ionkanaler kun på tilstrækkeligt positive spændinger, er den symmetriske karakter af disse aktuelle svar på begge poler på grund af indsættelse og sammenlægning af adskilte populationer af peptider, hver fra modsatte sider af membranen. Afhængig af frekvensen af den anvendte spænding, kan den inducerede aktuelle svar også indeholder bidrag fra den kapacitive strøm. Derfor, den kapacitive strøm i figur 5a skal trækkes fra den samlede nuværende vises i figur 5b for at få kun de memristive klemt hysterese nuværende spænding svar, vises i figur 5 c, d.

Figur 6 viser en Biomolekylær memristor induceret en spænding puls toget dynamisk skifte reaktion (130 mV (høj), 20 mV (lav), 100 ms (på), 20 ms (OFF)). OFF spænding er valgt til at være 20 mV at differentiere enheden vender tilbage til en isolerende stat som alamethicin kanaler forlader tolagede snarere fra nuværende simpelthen forsvinde på nul-spænding input. Den kumulative stigning i ON-tilstand aktuelle under successive spænding pulser repræsenterer parret-pulserende lettelse, en plasticitet, at flygtige Biomolekylær memristors er i stand til at udstille12.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning og hoveddele. (en) den standard arbejdsstation til montering og kendetegner Biomolekylær memristor omfatter en inverteret mikroskop, 3-aksede micromanipulators, et digitalt kamera, en vibration isolation tabel, en elektrode indehaveren, et glas mikropipette indehaveren, en nuværende forstærker, en funktionsgenerator og en olie-reservoir. Opsætningen er samlet på scenen i mikroskopet som beskrevet i trin 11-13. (b) en zoomet i fotografi af opsætningen viser tips af Ag/AgCl ledningerne rører bunden af olieglasset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Elektrode forberedelse procedure. Fotografier, der viser: (et) sølv ledninger iblødsætning i blegemiddel; (b) en elektrode indehaveren; (c) en 5 cm lange glas kapillær tilsluttet elektrode indehaveren; (d) en Ag/AgCl-elektrode føres gennem glasset kapillær; (e) en glas mikropipette indehaveren; og (f) den færdigsamlede elektroder og indehavere.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Jordforbindelse procedure. Fotografier, der viser: (en) en skrue gevind i vibrationer isolation tabel overflade til at oprette en jorden bus når forbundet til jorden jorden; og (b) en lab-made Faraday bur dækker olie reservoir og elektrode setup at skærme måling fra elektromagnetisk interferens. Både bur og mikroskop fase er bundet til jorden bus via kabler I og II. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Real-time aktuelle målinger viser indledende tolagede tyndere og areal vækst. (en) den aktuelle målte (top) under spontan tolagede dannelse mellem lipid-belagt dråber i svar til en trekantet bølgeform spænding. Omfanget af den målte aktuelle er direkte proportional med kapacitans af grænsefladen og dermed området af tolagede. Området af grænsefladen kan varieres ved at ændre afstanden mellem de to droplet-bærende elektroder. (b) et billede erhvervet gennem inverted mikroskop viser en underside og dimensioner af en typisk membranbaseret Biomolekylær memristor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Nuværende spænding forhold og klemte hysterese. (en) den aktuelle spænding svar af en alamethicin-gratis DPhPC lipid tolagede. Et lipid-only membran meget isolerende (~ 10 GΩ), hvilket forklarer de lave ohmske aktuelle svar på 0,017 Hz, en frekvens, hvor impedans er domineret af membran modstand. Ved højere frekvenser bidrager membran kapacitans mere væsentligt til den samlede impedans af interface, hvilket resulterer i en ikke-nul induceret kapacitive strøm. (b) de dynamiske nuværende spænding relationer versus hyppigheden af en lipid tolagede dannet mellem to dråber indeholdende alamethicin peptider (fremstillet med en trekantet indgang bølge). (c) memristive, klemt hysteretic aktuelle svar af enheden er opnået ved at fratrække den kapacitive strøm, vises i en fra den samlede nuværende vises i b. (d) Zoom-i at fremhæve forskelle mellem samlet og memristive strømninger.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Svar af Biomolekylær memristors rektangulære spænding pulser og plasticitet. Enheden svarer til efterfølgende spænding pulser med en stigning i ledningsevne under ON-time trods periodisk genoprette en isolerende stat under hver OFF tid. Stigning i aktuelle fra puls til pulse viser, at den øjeblikkelige ledningsevne af enheden er en funktion af både de nuværende stimulus og forudgående stimuli, svarer til at kortsigtede plasticitet i bio-synapser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette paper præsenterer en protokol for montage og kendetegner Biomolekylær memristors baseret på ion-kanal-doped syntetiske Biomembraner dannet mellem to dråber af vand i olie. Soft-sagen, to-terminal enhed er designet og studerede til: 1) overvinde begrænsninger, der er forbundet med solid-state teknologi, såsom høj støj, højt energiforbrug og høj skifte spændinger, 2) mere nøje efterligne sammensætning, struktur skifte mekanismer af biologisk synapser og 3) undersøge de mekanismer og funktioner af bio-synapse plasticitet, der ikke er udstillet af solid-state enheder.

Den dråbe interface tolagede teknik21, som repræsenterer byggesten i den nuværende teknologi12, er en enkel, modulære tilgang til membran montering, der har været flittigt brugt til at studere membran Biofysik21, proteiner22, ion-kanaler29og andre biomolekyler32. Det giver specifikke fordele for netop kontrollerende og forhører model membraner, og repræsenterer en byggesten for stimuli-responderende og autonome materialer26. Flere metoder er blevet udviklet til at samle droplet interface dobbeltlag, herunder hængende drop21 metode, som blev tilpasset som den vigtigste metode til at udvikle og karakterisere Biomolekylær memristor. Selvom denne membran montage teknik blev brugt i tidligere undersøgelser, præsenterer her vi en grundig protokol, der giver forskere til at genskabe og studere memristive droplet interface dobbeltlag i deres egne laboratorier. Protokollen er specifikt skrevet på en måde at give forskere i ikke-membran biologi felter, som neuromorphic-Fællesskabet til at forstå og genskabe disse procedurer.

I sin enkleste form kan den protokol, vi har beskrevet heri for at vurdere memristive funktionalitet i en biomembrane genskabes med grundlæggende laboratorieudstyr såsom en funktionsgenerator, et mikroskop og nuværende målesystemer. Den samlede enhed er elektrisk svarende til en modstand (~ 10 GΩ) og en kondensator, wired parallelt. I nærværelse af peptider, såsom alamethicin, der er i stand til at danne spænding-afhængige porer i membranen, membran modstand betydeligt dråber og resistive nuværende kan påvises som reaktion på input spænding signaler (DC eller AC). Men store membran modstand og frekvens-afhængige elektrisk impedans af enheden, der: 1) inducerede strømme er små (pA-nA) og omfattet af elektromagnetisk interferens; og 2) skal udvises forsigtighed til præcist at fremkalde og måle de ønskede memristive egenskaber adskilt fra kapacitiv membran svar, henholdsvis. Svar til en AC spænding, og afhængig af hyppigheden af signalet, vil den registrerede aktuelle indeholder både kapacitiv og resistive komponenter. For at opnå den sammenklemte hysterese, som er en underskrift af memristive enhed, skal man følge protokollen beskrevet i trin 14. Hængende ledninger er modtagelige for vibrationer, hvilket kan resultere i artefactual svar som svingninger fejlagtigt tilskrives selve dynamikken i enheden. Positionering ledninger nederst i olieglasset forbedringer denne adfærd.

Biomolekylær memristor med sin nuværende struktur og design emulerer den kortsigtede synaptisk plasticitet, der opstår i den præsynaptiske terminal. Det efterligner også nogle af de mekanismer, der forårsager præsynaptiske parrede pulserende lettelse i hjernen på grund af ophobning og nedbrydning af neurotransmitteren vesikler i det præsynaptiske neuron. Denne metode til at samle synaptic efterligner giver undersøgelse og validering af biomimetiske processer ansvarlig for mange typer af kortsigtede plasticitet, og optimering af modularitet og skalerbarhed ikke muligt med andre teknologier33. Uforudsete funktionalitet kan blive opdaget af enten ændre membran sammensætning, typer af Ionkanaler, der er indarbejdet i membranen, og selv antallet tilsluttede dråber og interfacial membraner der udgør hver to-terminal enhed. Som et eksempel, har vi for nylig demonstreret online indlæring evner af Biomolekylær memristor af grænseflade det med en solid-state neuron34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette manuskript har været forfattet af UT-Battelle, LLC, under Kontraktnr. DE-AC0500OR22725 med det amerikanske Department of Energy. USA 's regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artikel til offentliggørelse, erkender, at de Forenede Staters regering bevarer en ikke-eksklusiv, indbetalte, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at udgive eller reproducere den offentliggjorte form af Dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for de Forenede Staters regering formål.

Acknowledgments

Finansielle støtte blev leveret af National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Forskning for G.J.T., C.D.S., A.B., og C.P.C. var delvist sponsoreret af laboratoriet instrueret forskning og udvikling Program af Oak Ridge National Laboratory, forvaltes af UT-Battelle, LLC, for det amerikanske Department of Energy. En del af denne forskning blev udført på Center for Nanophase materialer Sciences, som er en DOE Office of Science bruger Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P/850356C Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) 
Agarose  Sigma-Aldrich A9539
Agarose (0.5g Agarose Tablets) Benchmark A2501 You can either use the powder form or the tablets 
Alamethicin  AG Scientific A-1286
Analytical balance  Mettler Toledo ME204TE/00
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Brain Total Lipid Extracts (Porcine) Avanti Polar Lipids 131101
DigiData 1440A system Molecular Devices -
Extruder Set With Holder/Heating Block  Avanti Polar Lipids 610000 This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block
Freezer (-20 °C) VWR International SCUCBI0420AD
Glassware VWR International -
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Nitrogen (N2) Gas Airgas UN1066
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film Parafilm PM999
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Precleaned Microscope Sildes  Fisher Scientific  22-267-013
Refrigirator (4 °C) VWR International SCUCFS-0504G
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Stirring Hot Plate Thermo Scientific  SP131325
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  2. Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
  3. Benfenati, F. Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory. Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 78 (1Suppl), 58-66 (2007).
  4. Marx, G., Gilon, C. The molecular basis of memory. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 633-642 (2012).
  5. Izquierdo, I., Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiology of learning and memory. 68 (3), 285-316 (1997).
  6. Merolla, P. A. A million spiking-neuron integrated circuit with a scalable communication network and interface. Science. 345 (6197), 668-673 (2014).
  7. Benjamin, B. V. Neurogrid: A mixed-analog-digital multichip system for large-scale neural simulations. Proceedings of the IEEE. 102 (5), 699-716 (2014).
  8. Furber, S. Large-scale neuromorphic computing systems. Journal of neural engineering. 13 (5), 051001 (2016).
  9. Di Ventra, M., Pershin, Y. V. The parallel approach. Nature Physics. 9 (4), 200-202 (2013).
  10. Chua, L. Memristor-the missing circuit element. IEEE Transactions on circuit theory. 18 (5), 507-519 (1971).
  11. Di Ventra, M., Pershin, Y. V., Chua, L. O. Circuit elements with memory: memristors, memcapacitors, and meminductors. Proceedings of the IEEE. 97 (10), 1717-1724 (2009).
  12. Najem, J. S. Memristive Ion Channel-Doped Biomembranes as Synaptic Mimics. ACS Nano. , (2018).
  13. Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S. The missing memristor found. Nature. 453 (7191), 80-83 (2008).
  14. Prezioso, M. Training and operation of an integrated neuromorphic network based on metal-oxide memristors. Nature. 521 (75550), 61-64 (2015).
  15. Prodromakis, T., Toumazou, C., Chua, L. Two centuries of memristors. Nature Materials. 11 (6), 478 (2012).
  16. Berzina, T. Optimization of an organic memristor as an adaptive memory element. Journal of Applied Physics. 105 (12), 124515 (2009).
  17. van de Burgt, Y., Melianas, A., Keene, S. T., Malliaras, G., Salleo, A. Organic electronics for neuromorphic computing. Nature Electronics. 1, (2018).
  18. Dan, Y., Poo, M. M. Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception. Physiological reviews. 86 (3), 1033-1048 (2006).
  19. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Reviews of Physiology. 64 (1), 355-405 (2002).
  20. Shepherd, J. D., Huganir, R. L. The cell biology of synaptic plasticity: AMPA receptor trafficking. Annual Review of Cell Developmental Biology. 23, 613-643 (2007).
  21. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  22. Najem, J. S. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  23. Taylor, G. J. Capacitive Detection of Low-Enthalpy, Higher-Order Phase Transitions in Synthetic and Natural Composition Lipid Membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  24. Taylor, G. Electrophysiological interrogation of asymmetric droplet interface bilayers reveals surface-bound alamethicin induces lipid flip-flop. Biochimica et biophysica acta (BBA)-Biomembranes. , (2018).
  25. Sarles, S. A., Garrison, K. L., Young, T. T., Leo, D. J. Formation and Encapsulation of Biomolecular Arrays for Developing Arrays of Membrane-Based Artificial Hair Cell Sensors. Proceedings of the Asme Conference on Smart Materials, Adaptive Structures and Intelligent Systems (Smasis 2011), Vol 2. , 663-671 (2011).
  26. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. Smart Materials & Structures. 20 (9), (2011).
  27. Sarles, S. A. Physical encapsulation of interface bilayers. , Virginia Tech. (2010).
  28. JoVE Science Education Datatbase. Organic Chemistry II. Cleaning Glassware. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  29. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using Escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2014).
  30. Shlyonsky, V., Dupuis, F., Gall, D. The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. Plos One. 9 (9), e108097 (2014).
  31. Najem, J. S. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  32. Bayley, H. Droplet interface bilayers. Molecular Biosystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  33. Nguyen, M., Srijanto, B., Retterer, S., Collier, C. P., Sarles, S. A. Hydrodynamic trapping for rapid assembly and in situ electrical characterization of droplet interface bilayer arrays. Lab on a Chip. 16, 3576-3588 (2016).
  34. A Soft-Matter Biomolecular Memristor Synapse for Neuromorphic Systems. Weiss, R., Najem, J. S., Hasan, M. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Collier, C. P., Sarles, S. A., Rose, G. S. IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference (BioCAS), 1984 Mar 30-31, Cleveland, Ohio, , (2018).

Tags

Bioteknologi sag 145 mikroelektronik bioteknologi (generelt) kunstig intelligens ingeniør teknik (generelt) elektronik og elektroteknik Life sciences Life Sciences (generelt) matematisk og computer videnskaber Kybernetik kunstig intelligens og robotteknologi Biomolekylær memristor alamethicin memristor ion-kanal biomembrane neuromorphic computing lipid tolagede synapse synaptic efterligner
Samling og karakterisering af Biomolekylær Memristors bestående af Ion-kanal-doped Lipid membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najem, J. S., Taylor, G. J.,… More

Najem, J. S., Taylor, G. J., Armendarez, N., Weiss, R. J., Hasan, M. S., Rose, G. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Sarles, S. A., Collier, C. P. Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (145), e58998, doi:10.3791/58998 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter