Summary
ソフト、低消費電力、生体分子 memristors は活用と同様の組成、構造、およびスイッチング バイオ シナプス機構です。ここで紹介を組み立てるし、生体分子 memristors を特徴付けるプロトコルは絶縁油中水滴間に形成される脂質二重層から取得します。メムリスティブ イオン伝導膜の電圧作動したアラメチシン ペプチド結果定款。
Abstract
コンピューティング システムを同等の効率と密度と脳の認知力をエミュレートしようとする神経は合成回路においてシナプスの機能を再現する能力が欠かせません。日には、3 端子シリコン トランジスタ、2 端子 memristors 使用されている広く能力共同情報処理およびメモリを検索するための大部分の神経回路で。これらのデバイスは相互接続性、脳の複雑性を達成することはできませんので、まだパワーハングリー、失敗、シナプスの重要な機能を模倣し、高ノイズと高電圧をスイッチングに苦しみます。これらの制限を克服するために開発し、組成、構造、および生物学的シナプスのスイッチング特性を模倣した生体分子 memristor を特徴付けられます。ここで組立のプロセスについて述べる、脂質修飾の水滴はオイルの間に形成され、電圧作動したアラメチシン ペプチドをドープした 5 nm 厚の脂質二重層からなる生体分子 memristors を特徴付けます。液滴インターフェイス層メソッドのために不可欠の主要な修正に焦点を当ててこの記事と同様のアセンブリ プロトコルは、液滴脂質膜と膜結合型イオン チャネルの生物物理学的性質を調べるに使用されてきたが、memristor の一貫性のあるパフォーマンスを達成します。具体的には、我々 は、memristors の全体的な応答のリポソームの調製とアラメチシン ペプチド脂質二分子膜の定款およびその影響と同様に、各成分の適切な濃度をについて説明します。我々 も短期可塑性と同様、サイクリックボルタンメトリー、を介して取得し、ステップごとに応答学習メムリスティブ電流-電圧特性の測定と解析を含む生体分子 memristors の評価プロセスを詳細します。電圧パルス。
Introduction
それは広く生物学的シナプス高効率と能力を学ぶし、非常に適応の方法で情報を処理するための脳の巨大な並列処理の責任があることが認識されます。この調整機能を両方短期的および長期的なシナプス可塑性1,2,の3,4,5そのドライブ、複数の非常に複雑な分子メカニズムから出ています。ニューロ コンピュータ システム レベル脳型コンピューター6、7の次の世代に必要な密度、複雑さ、および脳のエネルギー効率に近づいているシナプスの機能をエミュレートすることを目指してください。,8しますただし、事実上9、代わりに設計と受信信号に適応でき、記憶の新しいハードウェア要素の作製を必要とするは、伝統的な電子回路素子を用いたシナプスの機能を再現。情報履歴9。これらの種類のシナプスに触発されたハードウェアとして知られている mem 要素9,10,11 (略してメモリ要素) で119,・ ディ ・ Ventra らによると、受動的、2 端子デバイスが抵抗、キャパシタンス、インダクタンスは外部からの刺激への応答で再構成でき、前の状態11を覚えています。頭脳のそれらに近づいているエネルギー消費レベルを達成するためにこれらの要素は、類似の材料とシナプス可塑性12メカニズムを採用すべき。
日には、2 端子 memristors13,14,15主に高スイッチング電圧および高ノイズによって特徴付けられる補完の金属酸化膜半導体 (CMOS) 技術を使用して構築されています。この技術は、高い消費電力と低密度のためにまたスケーリングしません。これらの制限に対処するため、複数の有機・高分子 memristors を最近構築されています。ただし、これらのデバイスは、導電性高分子マトリックス16,17まで時間のかかるイオン拡散によるスイッチング速度が遅くダイナミクスを展示します。その結果、両方の CMOS ベースおよび有機メムリスティブ デバイスがシナプスをほうふつさせる機能をエミュレート メカニズムが高い現象、のみいくつかシナプス機能などスパイク タイミング依存可塑性 (STDP)を網羅18、他のキーを見渡せる機能が脳のシナプス前、短期可塑性19など、強力で効率的なコンピューターを作ることに重要な役割を果たします。
最近では、紹介したメムリスティブ デバイス12生体脂質膜に組み込まれている電圧作動したペプチドを備えた生体分子組成、膜構造、およびイオン チャネル トリガー スイッチを模した新しいクラス生物学的シナプス20のメカニズム。 ここでは、組み立て、電気これら 2 つの端末を調査する方法について述べる学習アプリケーション12オンラインの実装の短期可塑性を評価する方法の特定の焦点を。デバイス アセンブリが使用されている広く近年モデル膜21と膜結合型イオン チャネル22,23の生物物理学の研究に、液滴インターフェイス層 (DIB)21メソッドに基づいてください。 24, 刺激応答性材料25,26の開発のためのビルディング ブロックとして。私たちはニューロ アプリケーションに興味のある方膜アセンブリと尋問プロセスの詳細を説明するが、生体材料または膜生物学の経験が限られています。プロトコルにはも27デバイスの動的な再構成可能な電気的特性を与えられたアセンブリ プロセスと同様に重要である評価手順の完全な説明が含まれます。ここで説明した手順と代表の結果は、低コスト、低消費電力、脂質インターフェイスおよびニューラルネットワークコンピューティング、自律構造、システム、アプリケーションの他の生体に基づいたソフト mem 要素の新しいクラスの基礎さらに適応脳-コンピューターのインターフェイス。
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Protocol
1 一般的な説明と注意事項
- 適している、破損していない測定混合ガラス製品 (フラスコ、ビーカー、等)、他の器具 (へら、スクープ等) 用を選択します。
- 慎重に損傷を防ぐため、ガラスを処理し、指先から残基とガラス/実験器具の汚染を避けるために、お肌を保護するためにラテックスやニトリル手袋を着用します。
- きれいな選ばれたガラス製品/実験器具まできれいな柔らかいボトル ブラシとすべての残基をスクラブして洗剤と水を使用して徹底的に削除されます。
- 水道水と純水 (DI)、徹底的にすすいでください。乾燥空気にラックの場所は乾燥します。
-
オプション:リンス イソプロピル (IPA、99.5%) と洗浄ガラス/実験器具任意の汚染物質 (~ 2 h) の無料であることを確認するすべての残留 IPA の蒸発を真空下で配置します。真空チャンバーから除去し、クリーンな環境に置き。
注: は、ガラス製品や実験器具を拭くため糸くずのおしりふきを使用します。購入し、材料の準備とサンプルの保管用滅菌の小さなガラスの瓶と安全ロック チューブを使用します。ガラス クリーニング、その他ラボの標準操作手順の詳細については、ゼウス科学教育データベース28を参照してください。
2. 水性緩衝液の調製
- ラテックスやニトリル手袋をはめて、選択緩衝水溶液 50 mL を準備する適切かつ清潔なガラス容器 (500 mM 塩化ナトリウム (KCl)、10 mM 3-(N morpholino) propanesulfonic 酸 (モップ)、pH 7.0)。
- デジタル、高精度の質量バランスときれいなヘラを使用して、クリーン計量紙に KCl の 1.86378 g を塗布し、ガラス容器に追加。
注: KCl とモップの量は目的のボリュームによって異なりますが、最終濃度を必要に応じています。 - モップの 0.10463 グラムの重量を量るし、ガラスのコンテナーに追加します。その後、追加・ ディ ・水 50 mL ガラス容器と渦に徹底的に KCl とモップを完全に溶解するまで。
- 室温で緩衝液を格納し、必要なときに使用します。
注: 緩衝液は、比較的長い期間にわたって保存できますが、お勧め良いとより一貫性のある結果を得るのため作りたての緩衝液を使用します。
3. リポソームの調製
注: 手順 3.1 は、リン脂質として凍結乾燥粉末を取得し、リン脂質をクロロホルムで購入した場合スキップする可能性がある場合にのみ適用されます。
- 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) または 5 mL 滅菌バイアルにクロロホルム 1 mL で脳総脂質抽出 (容器) 脂質の 5 mg を溶解します。
- ゆっくり旋回しながら脂質膜のままバイアルの底まで乾燥窒素の穏やかな流れの下でクロロホルムを蒸発させます。
- 残留クロロホルムの完全な除去のために 10 〜 12 時間の真空下での脂質膜を含むバイアルを配置します。
- 真空チャンバーからバイアルを外し、2 mg/mL の最終的な脂質濃度を達成するステップ 2 で準備して水性緩衝液 10 mL を追加することにより、脂質膜を水分補給。
- (-20 °C) を凍結し、多重リポソーム アセンブリを容易にする脂質懸濁液を 6 回完全に解凍します。
注: は、混合物は加熱された環境で決して室温で解凍しましょう。 - 市販押出機を使用すると、強制的に完全な脂質濁液 0.1 μ m の細孔径トラック エッチング膜のリポソーム液を押し出します。適切な脂質単分子膜の形成に必要な c. a. キャスバル 100 nm の直径を持つ単層リポソームを取得するすぐに連続で 11 回懸濁液を押し出します。4 °C のリポソーム懸濁液を保存し、調製後 1 週間以内使用します。シンプルさ、結果のリポソーム液として"A"を参照してください。
注: 容器リポソームの押出、研究者は容器脂質の 45-50 °C、相転移より高い押出機ウォーム アップすることが推奨温度 (〜 37 °C)23,29, 容易に押出を有効にします。和容器リポソーム懸濁液も直接用意できます (凍結融解と押出) 代わりに 55 °C ~ 15 分お風呂超音波発生装置内に閉じた懸濁液バイアルを配置することによって。
4. アラメチシン ペプチドの再構成
注: この手順は、1 μ M の最終的な集中にリポソーム内アラメチシン再構成のプロセスをについて説明します。この濃度は nA レベル流れそれらの以前に発行された12のように誘導するために十分です。スイッチングのしきい値を削減し、印加電圧29によって引き起こされる流れの振幅を増加ペプチド濃度を増加させます。
- 2.5 mg/mL、ミックスも、簡単に渦の最終的な集中にエタノール アラメチシン ペプチドを溶解し、冷凍庫 (-20 °C) の原液を格納します。
注: アラメチシン ペプチドは、粉末の形で通常購入されます。 - 1.5 mL 安全ロック チューブをリポソーム懸濁液に 13 μ M の最終アラメチシン濃度を達成するためにアラメチシン原液 1 μ l ソリューション"A"の 99 μ L をミックスします。 よく混合する渦。結果として得られるペプチド リポソーム液を"B"と呼びます。
- 1 mM とし、よく混ぜて渦の最終アラメチシン濃度を達成するためにソリューション B のソリューションを 10 μ l"A"のミックス 117 μ L。"C"としては、結果のソリューションを参照してください。
- 格納ソリューション"B" 、 "C" 4 °C で必要に応じて使用。
5. Agarose のゲルの準備
- デジタル、高精度の質量バランスときれいなヘラを使って、きれいな計量紙に agarose 粉末 0.5 g を追加します。
- 転送は、きれいなガラスを 100 mL ビーカーに agarose の重量を量った、DI 水 50 mL を agarose に追加します。
注: これは 1% (重量/巻) agarose のゲル溶液になります。 - ガラス製ビーカーの中きれいな攪拌磁石に、攪拌ホット プレート上ビーカーを置きます。
- を攪拌しながらアガロースを完全に溶解するまで沸騰する混合物を持参します。
- 部屋の温度に混合物を冷ますにホット プレートからビーカーを削除します。4 °C で保存し、必要なときに使用します。
- もう一度を使用して、前にホット プレートや電子レンジでの加熱による agarose を再溶解します。
6. 石油貯留層の作製
注: 以下の手順は、石油貯留層を作製することができる多くの方法の 1 つです。リーダーは、加工機能、および特定のニーズを設計および入手可能な材料に基づく貯留層を作製することをお勧めです。
- バンド鋸を使用して大きい 12 mm 厚アクリル シートから 12 mm のアクリル キューブ x 12 x 12 カット。
- アクリル管 (図 1 a) 8-12 mm の深さ 12 mm 径の穴を加工します。
7 電極の作製
- 銀線 (125 μ m 径) のはさみ、カット 2 個セット (75 mm) を使用します。
- 軽く開いた炎を使用して、フォームの小さな球状のボール (直径約 250 μ m) にそれぞれの銀線の一方の端を溶かします。
- 1-2 h 銀 - 塩化銀 (銀/塩化銀) コーティングを作成するための漂白剤のボールの両端を浸します。濃い灰色は銀/塩化銀コーティングが (図 2 a) を形成していることを示します。
- 漂白剤から両方のワイヤを削除、DI 水で完全にすすぎます、きれいな糸くずのワイプの脇に置きます。
- 薄層を作成する溶融 agarose のゲルにボール端を浸しなさい。このゲルのコーティングは油の下でワイヤー上に水の滴を固定するのに役立ちます。
- ガラス カッターを使用すると、10 cm 長く、1/0.58 外/内径 mm ホウケイ酸ガラス 2 5 cm 毛細血管にキャピラリーを分割します。
- 電極ホルダー (図 2 b, c)、ガラス管の 1 つ挿入し、ガラス管 (図 2 d) に銀/塩化銀のワイヤーの 1 つのフィードします。2 番目のガラス管に他の銀/塩化銀線をフィードします。
- ガラス マイクロ ピペット ホルダー (図 2 e、 f) に 2 番目のガラス管をマウントします。
8 実験の設定
- 倒立顕微鏡 (図 1 a) の段階で 1 mm、厚さ 25 × 75 mm ガラス スライドを配置します。
- ヘキサデカン、スライド ガラスの中央にオイルを数滴を分配し、スライド ガラスに油に直接油タンク。
注: 明確でシャープな画像を提供するために基板の屈折を合わせて使用ガラス スライドおよびオイル貯蔵所の間にオイルを追加します。 - ヘキサデカン油油タンクがいっぱい。貯水池は、対物レンズの上にあることを確認します。
注: 他の疎水性オイルを同様使用可能性があります。 - 電極ホルダーを電流増幅器のパッチアンプ用アダプターに接続します。マイクロマニピュレーター (図 1 a) 電極の長さを最小限に抑えるため、電気的なノイズ、パッチアンプ用アダプターをマウントしなければなりません。
- 別マイクロマニピュレーター (図 1 a) の上に 2 番目の銀/塩化銀ワイヤーとガラス マイクロ ピペット ホルダーをマウントします。
- マニピュレーター、電極その agarose コーティング銀/塩化銀ワイヤーの先端が完全に水没同様垂直面で石油貯留層に位置を使用してください。
- 2 つの電極を合わせ、数ミリ (図 1 a, b) で区切ります。
注: 液滴 (手順 13で説明) を追加した後ワイヤ提起しなければならないすべての方法ダウン電極先端が油タンクの底に触れるまで。この手順は、ワイヤ振動を行うし、したがって、測定電流で不要な変動を最小限に抑えることを確認します。
9. 適切な電気ノイズを低減するアース
- 顕微鏡が (図 3 a) 配置されている防振テーブルにネジをスレッドによって地上のバスを作成します。
注: 防振テーブルを使用する測定電流で望ましくない変動を引き起こす可能性があります、周囲からの振動を最小限に抑える必要が。 - 導電性ワイヤーを使用して、アース (図 3 a) にネジを接続し、顕微鏡ステージを地上のバスに接続します。
- ノイズを低減し、電気地面バス(図 3 b) を接続する実験のセットアップにファラデーケージを置きます。
注: 常に勧めします不要なグランド ループを回避する、彼らは測定ノイズ レベルの増加につながる可能性があります。
10. フィードバック制御された加熱
- アルミニウム シェル石油貯留層に合うことができる29ぴったりの暖房機します。
- 倒立顕微鏡を介してシェルを通じて表示することができるシェルの下部に開口部を残すことを確認します。
- アルミ シェルの下に 30 × 30 mm ポリイミド柔軟な発熱体を配置します。
- 下方向の熱損失を低減し、顕微鏡ステージを保護するヒーターの下に絶縁ポリジメチルシロキサン (PDMS) ウェーハを配置します。
- 油相に熱電対を挿入します。熱電対を確かめるか銀/塩化銀線に触れない後、熱電対データの集録ボードとカスタム プログラミング ソフトウェアを使用してレコードの温度を熱電対ワイヤを接続します。
注: コントロールを作成、On-Off、比例積分 (PI) フィードバック温度暖房および希望値に油温のパッシブクー リングを有効にします。コードは、要求時に読者に提供できます。
11. ソフトウェアと機器の設定
- データ集録ソフトウェアを準備するには、コンピューター、顕微鏡、関数発生器、電流増幅器、低ノイズのデータ集録システムに電力を供給します。
注: 現在センシング機器を使用可能性があります、次の手順、特に材料の表に記載されている 1 つ。自分の現在のアンプを構築する研究者は、Shlyonsky ら30を参照できます。 - パッチ ・ クランプのフロント パネルに電流アンプ、フロント パネル表示に設定、ソース測定モードダイヤル VHOLD/IHOLD、V クランプ、それぞれ。
- フロントのパネルでは、0.5 に 1 kHz、出力ゲインを低域通過ベッセル フィルターを設定します。
注: は、測定ノイズを低減の利得の犠牲の測定範囲を増やすに対し、低出力ゲインにより大きいのより高い電流振幅を記録を選択します。 - 構成をセル全体 β に設定 1 を =。この値は、大きな振幅電流を記録可能に 0.1 に後で切り替えた可能性があります。
- ゼロまたは中立的な立場では、他のすべてのコントロール ダイヤルを設定します。
- デスクトップのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを初期化します。
- 構成をクリックして |デジタイザー デジタイザー ] ダイアログを開き、[変更] ボタンをクリックします。
- デジタイザーの変更ダイアログ ボックスで、デジタイザーの種類] の一覧から適切なデジタイザーを選択します。
- デジタイザーを検出するスキャンボタンをクリックします。
- 変更デジタイザー ] ダイアログを終了する[ok]をクリックしてし、デジタイザー ] ダイアログを終了する[ok]をクリックします。
- コン図をクリックして |研究室のベンチ。
- 研究室のベンチの入力信号タブでは、0.0005 V/Pa に尺度係数を設定します。
注: 利得または β の値が変更された場合は、この値を更新する必要があります。
12 ピペット オフセット
注: 以下の手順は、表の資料に記載されている現在のアンプにのみ適用されます。
- 200 の預金、マイクロ ピペットを使用して油の下で各銀/塩化銀のワイヤーの両端に水性脂質液"A"の nL。
- 連絡先に水滴を取り込んで、両電極にまたがる 1 つのボリュームに、液滴の合体にアンプのフロント パネルの攻撃ボタンを押します。これを誘導する必要があります、応答を短絡します。
- トラックセットのソース測定モード ダイヤル。
- フロント パネル表示ダイヤルをVトラックに変更します。
- ピペッター オフセットメーター読み取り 0 mV まで (時計回りまたは反時計回り) をダイヤルし、安定して電源を入れます。
- V クランプにソース測定モード ダイヤルを戻り、前面パネルは、 Vを保持する保持/Iにダイヤルを表示します。
13. 脂質二重膜の形成
- 以前、油相から垂直方向に電極を移動することによって堆積した液滴をリリースします。これは、油に電極から落ちる水滴を発生します。再度水没し、油で電極を配置します。
- デポジット 200 にマイクロ ピペットを使用して、各ワイヤーの脂質ソリューション"A"の nL。
- 各水/油の界面で発生する自発的な脂質単分子膜アセンブリを許可する 3-5 分を待ちます。
注: として脂質単分子膜形態、周辺のオイルが十分に少ない高密度21場合をサグに液滴を引き起こすことができます水/脂質/油界面の表面張力が減少。 - 下が終了するまで両電極の電極 (と液滴) やっと油層 (図 1 b) の底に触れるし、接触に水滴を持って水平に移動します。
注: 脂質二分子膜が自発的に薄膜接触液滴の間から余分な油を除きます。通常、このプロセスは、1 分以内で発生します。
14 生体分子 Memristor の電気特性評価
- 脂質二分子膜形成
- 液滴間の静電容量の増加に対応する脂質二分子膜形成を記録するには、10 Hz、パッチ クランプの外部入力に接続されているファンクション ・ ジェネレーター (図 4) を用いた 10 mV 三角波電圧を適用します。増幅器です。
注: 脂質膜の容量性の性質のため結果の現在の応答は方形波 (図 4) をする必要があります。脂質二分子膜形成、ステップ 11.6 中研究者はピーク ・ トゥ ・ ピーク電流振幅の成長を参照してください、また接続された液滴 (図 4) の間の視覚的な変化を観察します。
- 液滴間の静電容量の増加に対応する脂質二分子膜形成を記録するには、10 Hz、パッチ クランプの外部入力に接続されているファンクション ・ ジェネレーター (図 4) を用いた 10 mV 三角波電圧を適用します。増幅器です。
- 電流電圧測定
注: 生体分子 memristor は抵抗とコンデンサー並列12,21としてモデル化されます。したがって、デバイスの現在の応答は、印加電圧の周波数によって抵抗膜方式と静電容量方式の両方のコンポーネントを含めることができます。メムリスティブ性デバイスを研究してピンチ ヒステリシス電流-電圧特性12を取得するには、現在の合計から容量性電流を減算する必要があります。以下のプロトコルでは、この手順について説明します。- 関数発生器を使用して、ソリューション"の A"の液滴と組み立てアラメチシン無料脂質膜に電圧波形 (三角形または正弦波) が適用されます。
- 複数の周波数で誘導の現在の応答を記録します。
メモ: 容量性電流は、10 mHz 以下の周波数で最小限に抑えられます。 - どちらかのコンピューターで、脂質膜の直径を測定することによってまたは 10 Hz、10 mV 三角波に起因ピーク-ピーク電流を記録することによって界面脂質二重層のサイズを記録します。現在の振幅は膜容量に比例してある順番膜の面積に比例です。
- アラメチシンを含まない液滴を削除します。
- ソリューション"C"を使用して新しい滴を追加し、脂質二重層を形成します。
- マニピュレーターを使用すると、2 層が以前に形成されたものとして同じような区域 (直径または矩形波電流振幅) があるような液滴間の接触を調整できます。
- 14.2.1 と 14.2.2 の手順を繰り返します。
- 14.2.7 の手順で記録した現在から現在に記録されたステップ 14.2.2 を減算します。
- 各周波数と"ピンチ ヒステリシス「メムリスティブ応答波形印加電圧対誘導電流をプロットします。
- 光パルス伝送実験
- 時間、オンとオフの時間、特定の高、低振幅の電圧パルスを生成カスタム プログラミング ソフトウェアとアナログ電圧ソースを使用する。
注: これは必要ありません商業関数発生器を使用して電圧パルスを生成することができる場合。 - 応用パルス応答電流を記録します。
- Memristor の容量性の性質のため、静電容量式のスパイクが記録されます。スパイクを削除するには、適切な通過帯域の低域通過フィルターを適用します。
- 時間、オンとオフの時間、特定の高、低振幅の電圧パルスを生成カスタム プログラミング ソフトウェアとアナログ電圧ソースを使用する。
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Representative Results
図 1は、組み立てるし、生体分子 memristor を特徴付けるため実験のセットアップを表示します。石油貯留層の下部に電極の端を下げる、図 1 bに示すようだったが参考に電極と測定電流と二分子膜領域、特に場合は、の変化につながる液滴の振動を最小限に抑えるためどこに暖房油、油の対流を生成できます。図 2は、手順や銀/塩化銀ワイヤー、クラス毛細血管および電極とマイクロ ピペット ホルダーを組み立てることの結果を示しています。セットアップはアース ファラデーケージ (図 3) 電磁干渉を最小限に抑えるための内で収容されています。
安定した、この研究のための脂質二重膜を絶縁を形成することが不可欠です。このプロトコルでは脂質単分子膜は、油に浸漬、水滴の油/水界面におけるアセンブルします。液滴間の接触、余分な油を除いては、反対脂質単分子膜が 5 nm 厚の脂質二重層に薄い。二分子膜の電気生理学で使われる最も一般的な方法は、電圧クランプ、2 層間で電圧の制御、誘導電流の測定です。 図 4 aは、10 静電容量式方形波電流を描いている mV、二分子膜形成過程の 10 Hz の電圧。振幅が増加開始二層間伐と間伐の膜の後続の放射状拡張時に、波形のまま正方形です。現在の方形波の定常振幅を使用すると、脂質二重膜の公称断面積は DPhPC 二層21特定膜容量のあらかじめ決められた値を使用して計算されます。 また、図 4 b顕微鏡で撮影した画像から膜径の測定による膜領域を視覚的に評価できます。正確な脂質二分子膜面積の計算、リーダーが、テイラーら21参照してください。脂質二重層の領域は、液滴21,31の相対位置を変更することによって調整できます。
電圧バイアス アラメチシン無料脂質に、申請により現在の応答は入力電圧の周波数に基づいて異なります。低周波 (< 10-50 の mHz)、二重膜の抵抗を支配する複雑なインピー ダンス公称膜抵抗は通常 10 GΩ よりも大きいので、オームの現在の応答は無視。入力周波数が高くなると、膜容量は図 5 aの電圧と現在のプロットに表示される非ゼロ現在の応答の結果として、システムのインピー ダンスに貢献しています。とき同じ入力電圧波形 (150 mV) 生体分子応答アラメチシン添加脂質膜と電圧振幅が重要な挿入のしきい値を超えたときに適用される (~ 100 mV、常温 DPhPC 膜)、アラメチシン ペプチドの脂質二重膜の表面に存在する膜に挿入し、フォーム導電性毛穴に集計。イオン チャネルの閾値に依存形成非線形巨視的電流応答である、カーソルのしきい値 (図 5 b) よりも高い電圧で電流を指数関数的に増加で起因します。アラメチシン ペプチドが十分に肯定的な電圧はイオン チャネルを整流形知られている、これら現在応答を両方の極性での対称の性質は挿入とそれぞれからペプチドの別々 の人口の集計のため膜の両側。誘導の現在の応答には印加電圧の周波数に応じて容量性電流からの貢献もあります。したがって、図 5 aの容量性電流を挟メムリスティブ ヒステリシス電流電圧応答だけ、図 5 c、 dに表示されますを取得する、合計現在に表示されます図 5 bから減算しなければなりません。
図 6は、電圧パルスによる分子 memristor の動的スイッチング応答を表示 (130 mV (高)、20 mV (低)、100 ms (上)、20 ms (OFF))。オフ状態の電圧は 20 に選ばれた mV アラメチシン チャネルではなく現在から 2 層を残し、単にゼロ電圧入力で消失としてデバイスの絶縁状態への復帰を区別するために。連続した電圧パルス中にオン電流の累積的な増加は、対パルス円滑化、可塑性の揮発性の分子 memristors が12を示すことができることを表します。
図 1:実験概要および主要な部品。倒立顕微鏡、3 軸マニピュレーター、デジタル カメラ、除振台、電極ホルダー、ガラス ピペット ホルダー (、) 組立・生体分子 memristor の特性のための標準的なワークステーションが含まれます、電流増幅器、関数発生器、石油貯留層。セットアップは、手順 11-13 で顕微鏡のステージに組み立てられます。(b) 油タンクの底に触れる銀/塩化銀ワイヤーの先端を示すセットアップの拡大写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:電極の準備手順です。写真:; 漂白剤に浸漬 (、)、銀線(b) 溶接棒ホルダー;(c) 5 cm 長いガラス管電極ホルダーに接続(d) 銀/塩化銀電極がガラス管; を介して供給(e) ガラス マイクロ ピペット ホルダー;(f) 完全に組み立てられた電極とホルダー。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:接地方法。写真: (、) 地上のバス; アースに接続されている場合を作成する振動分離のテーブル面に螺(b) ラボ製ファラデーおり電磁干渉から測定をシールドする石油貯留層と電極セットアップをカバーします。ケージと顕微鏡のステージは、関連付けられて地面にケーブル経由で I および II のバスします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:リアルタイム電流測定表示初期層間伐面積成長します。(、)、現在測定 (top) 自発的な二分子膜形成過程における三角波電圧への応答における脂質コーティング液滴間。測定電流の大きさは、インターフェイスの容量に比例し、したがって、二重膜の領域。インターフェイスの領域は、2 つの液滴軸受電極間の距離を変更することによって変えることができます。下部ビューと典型的な膜を用いた生体分子 memristor の寸法 (b) イメージを倒立顕微鏡ショーを獲得しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:電流-電圧特性とピンチ ヒステリシス。(、) 電流電圧応答、アラメチシン無料 DPhPC 脂質二重膜の。脂質だけの膜は絶縁性 (〜 10 GΩ)、0.017 Hz、インピー ダンスが膜抵抗によって支配されている周波数で低オームの現在の応答を説明します。周波数が高い膜容量誘導容量性電流のゼロ以外の結果、インターフェイスの合計インピー ダンスにさらに貢献しています。(b) 脂質二分子膜の周波数対動的な電流-電圧特性 (三角波入力を用いて) アラメチシン ペプチッドを含んでいる 2 つの液滴間に形成。(c)、メムリスティブ、デバイスのピンチの履歴現在の応答は、 bに表示されます合計電流からの表示容量性電流を減算することによって得られます。(d) ズームの合計とメムリスティブ電流の違いを強調します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:生体分子 memristors の長方形電圧パルスと可塑性に対する応答。デバイスは、ON 時は、断続的に OFF するたびに中に絶縁状態を復元するにもかかわらず導電率の増加とその後の電圧パルスに応答します。パルス パルスから電流の増加は、デバイスの瞬時のコンダクタンス存在刺激先行刺激、バイオ シナプスにおける短期可塑性に類似の関数であることを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
組立のイオン チャネルをドープした合成膜中の水の二液滴の間に形成に基づく生体分子 memristors を特徴付けるためのプロトコルを提案する.ソフトマター、2 ターミナル デバイスを設計および検討: 構造の組成、2) もっと密接に模倣高ノイズ、高エネルギー消費、高電圧の切り替えのように固体状態の技術に関連付けられている 1) 克服の制約、スイッチング機構の生物学的シナプスと 3) メカニズムと固体素子によって公開されていないバイオ ・ シナプス可塑性の機能を探る。
液滴インターフェイス層技術21、現在の技術12のビルディング ブロックを表しは膜生物21、研究に広く使用されている膜アセンブリのシンプルなモジュラー ・ アプローチタンパク質22、イオン チャンネル29, と他の生体分子32。それは正確に制御し、モデル膜を尋問のための特定の利点を提供しています、刺激応答性と自律材料26のビルディング ブロックを表します。複数のメソッドは、液滴インターフェイス膜を組み立てる、絞首刑を含むドロップを開発し、生体分子 memristor を特徴付ける主な方法として採用した21のメソッドに開発されています。にもかかわらず、この膜アセンブリ技術は、従来の研究で使用された、ご紹介を再現し、自分の所のメムリスティブ液滴インターフェイス磁性を研究する研究者を可能にする徹底したプロトコル。プロトコルは、具体的にはニューロ コミュニティの理解し、これらのプロシージャを再作成するなどの非膜生物学分野の研究者を可能にする方法で書き込まれます。
最も単純な形式の関数発生器、顕微鏡、現在測定システムなど基本的な実験装置と我々 はメムリスティブ生体膜の機能を評価するため記載がプロトコルをレプリケートできます。組み立てられたデバイスは、電気抵抗 (〜 10 GΩ) とコンデンサー並列に配線と同等です。アラメチシンなどに、膜電位依存性細孔を形成できるが、ペプチドの存在下で膜抵抗値が大幅減少、および入力電圧信号 (DC または AC) に対して抵抗性電流を検出できます。ただし、大型膜抵抗とインピー ダンス周波数依存電気デバイスのことを意味: 1) 誘導電流は小さな pA (nA) と電磁干渉の対象・ 2) 正確に誘導し、それぞれ容量の膜応答から別の目的メムリスティブ特性の測定には注意が必要があります。AC 電圧と信号の周波数によっては対応、記録された電流容量と抵抗の両方のコンポーネントが含まれます。メムリスティブ デバイスの署名がピンチのヒステリシスを達成するために手順 14 で説明されているプロトコルに従う必要があります一つ。吊りワイヤ artefactual 応答誤ってデバイスの実際のダイナミクスに起因する振動などでなることができます振動に敏感であります。この現象を改善する油層の下に線を配置します。
現在の構造および設計の生体分子 memristor シナプス前ターミナルで発生する短期的なシナプス可塑性をエミュレートします。それはまたいくつかの蓄積による脳のシナプス前対パルス円滑化を引き起こすメカニズムとシナプス前ニューロンの神経伝達物質の小胞の枯渇をまねます。シナプスの模倣を組み立てるためこの方法論は、研究およびバイオミメティック プロセス短期可塑性の多くの種類の責任の検証と、モジュール性と拡張性33その他の技術では不可能な最適化をできます。膜組成、膜に組み込まれているイオン チャネルの種類と接続された液滴の界面膜の各 2 ターミナルを構成する数もいずれか変更することによって予期しない機能を発見があります。デバイス。例として、我々 は最近固体ニューロン34インタ フェースで生体分子 memristor のオンライン学習機能を実証した.
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Disclosures
この原稿が UT バテル、LLC は、契約番号の下で作成されて米国エネルギー省で・ デ ・ AC0500OR22725。アメリカ合衆国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることによってアメリカ合衆国政府が発行または公開された形態を再現する非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める本稿では、またはそうアメリカ合衆国政府の目的のために他の人を許可します。
Acknowledgments
財政支援により、国立科学財団助成 NSF ECCS-1631472 を行いました。G.J.T. 債 cds 市場、a. b. のための研究と C.P.C. が監督研究と開発プログラムのオークリッジ国立研究所、ユタ州-バテル、LLC は、によって管理されて米国エネルギー省によって後援された部分的に。本研究の一部は、ナノ相物質科学は、科学ユーザー施設 DOE のオフィスは、センターで実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
- Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
- Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
- Benfenati, F. Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory. Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 78 (1Suppl), 58-66 (2007).
- Marx, G., Gilon, C.
- Izquierdo, I., Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiology of learning and memory. 68 (3), 285-316 (1997).
- Merolla, P. A. A million spiking-neuron integrated circuit with a scalable communication network and interface. Science. 345 (6197), 668-673 (2014).
- Benjamin, B. V. Neurogrid: A mixed-analog-digital multichip system for large-scale neural simulations. Proceedings of the IEEE. 102 (5), 699-716 (2014).
- Furber, S.
- Di Ventra, M., Pershin, Y. V.
- Chua, L.
- Di Ventra, M., Pershin, Y. V., Chua, L. O. Circuit elements with memory: memristors, memcapacitors, and meminductors. Proceedings of the IEEE. 97 (10), 1717-1724 (2009).
- Najem, J. S. Memristive Ion Channel-Doped Biomembranes as Synaptic Mimics. ACS Nano. , (2018).
- Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S.
- Prezioso, M. Training and operation of an integrated neuromorphic network based on metal-oxide memristors. Nature. 521 (75550), 61-64 (2015).
- Prodromakis, T., Toumazou, C., Chua, L.
- Berzina, T. Optimization of an organic memristor as an adaptive memory element. Journal of Applied Physics. 105 (12), 124515 (2009).
- van de Burgt, Y., Melianas, A., Keene, S. T., Malliaras, G., Salleo, A. Organic electronics for neuromorphic computing. Nature Electronics. 1, (2018).
- Dan, Y., Poo, M. M. Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception. Physiological reviews. 86 (3), 1033-1048 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Shepherd, J. D., Huganir, R. L. The cell biology of synaptic plasticity: AMPA receptor trafficking. Annual Review of Cell Developmental Biology. 23, 613-643 (2007).
- Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
- Najem, J. S. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
- Taylor, G. J. Capacitive Detection of Low-Enthalpy, Higher-Order Phase Transitions in Synthetic and Natural Composition Lipid Membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
- Taylor, G. Electrophysiological interrogation of asymmetric droplet interface bilayers reveals surface-bound alamethicin induces lipid flip-flop. Biochimica et biophysica acta (BBA)-Biomembranes. , (2018).
- Sarles, S. A., Garrison, K. L., Young, T. T., Leo, D. J. Formation and Encapsulation of Biomolecular Arrays for Developing Arrays of Membrane-Based Artificial Hair Cell Sensors. Proceedings of the Asme Conference on Smart Materials, Adaptive Structures and Intelligent Systems (Smasis 2011), Vol 2. , 663-671 (2011).
- Sarles, S. A., Leo, D. J.
- Sarles, S. A. Physical encapsulation of interface bilayers. , Virginia Tech. (2010).
- JoVE Science Education Datatbase. Organic Chemistry II. Cleaning Glassware. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using Escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2014).
- Shlyonsky, V., Dupuis, F., Gall, D. The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. Plos One. 9 (9), e108097 (2014).
- Najem, J. S. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Bayley, H.
- Nguyen, M., Srijanto, B., Retterer, S., Collier, C. P., Sarles, S. A. Hydrodynamic trapping for rapid assembly and in situ electrical characterization of droplet interface bilayer arrays. Lab on a Chip. 16, 3576-3588 (2016).
- A Soft-Matter Biomolecular Memristor Synapse for Neuromorphic Systems. Weiss, R., Najem, J. S., Hasan, M. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Collier, C. P., Sarles, S. A., Rose, G. S. IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference (BioCAS), 1984 Mar 30-31, Cleveland, Ohio, , (2018).
