Summary
Weich, nutzen Niederleistungs-biomolekularen Memristoren ähnlicher Zusammensetzung, Struktur und Mechanismen der Bio-Synapsen umschalten. Hier vorgestellten wird ein Protokoll zu montieren und zu charakterisieren, biomolekulare Memristoren aus isolierenden Lipid Bilayer gebildet zwischen Wassertröpfchen in Öl gewonnen. Die Einbeziehung der Spannung aktiviert Alamethicin Peptide Ergebnisse in Memristive ionische Leitfähigkeit durch die Membran.
Abstract
Die Fähigkeit zur synaptische Funktionalitäten in synthetischen Schaltkreiselemente neu unbedingt neuromorphen EDV-Systeme, die darauf abzielen, die kognitiven Kompetenzen des Gehirns mit vergleichbarer Effizienz und Dichte zu emulieren. Bisher haben Silizium-basierte 3-Terminal Transistoren und zwei-Terminal Memristors in neuromorphen Schaltungen, größtenteils aufgrund ihrer Fähigkeit zur Informationsverarbeitung und Speicher Zusammenlegung verbreitet. Doch diese Geräte die Vernetzung und die Komplexität des Gehirns erreichen können, weil sie sind machthungrigen, nicht wichtige synaptische Funktionalitäten zu imitieren, und leiden unter hohen Geräuschpegel und hohe Spannungen zu schalten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir entwickelt und charakterisiert eine biomolekularen Memristor, die Zusammensetzung, Struktur und Schaltverhalten der biologische Synapsen imitiert. Hier beschreiben wir den Prozess der Montage und Charakterisierung biomolekularen Memristoren bestehend aus einem 5 nm dicken Lipid Bilayer zwischen Lipid funktionalisiert Wassertröpfchen in Öl gebildet und mit Spannung aktiviert Alamethicin Peptide dotiert. Während ähnliche Versammlung Protokolle verwendet wurden, um die biophysikalische Eigenschaften von Tröpfchen unterstützt Lipidmembranen und Membrane-springen Ionenkanäle untersuchen, dieser Artikel konzentriert sich auf wesentliche Änderungen der Tröpfchen Bilayer Schnittstellenmethode für konsequente Memristor Performance zu erreichen. Speziell, beschreiben wir die Liposomen-Herstellungsverfahren und die Übernahme der Alamethicin Peptide in Lipid Bilayer Membranen und die entsprechenden Konzentrationen von jeden Bestandteil, sowie deren Auswirkungen auf die Gesamtreaktion der Memristoren. Wir beschreiben auch die Charakterisierung Prozess der biomolekularen Memristors, einschließlich Messung und Analyse von Memristive Strom-Spannungs-Beziehungen über zyklische Voltammetrie sowie kurzfristige Plastizität erhalten und lernen schrittweise als Reaktion auf Spannung Impulsfolgen.
Introduction
Es ist allgemein anerkannt, daß biologische Synapsen verantwortlich für die hohe Effizienz und enorme Parallelität des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit sind zu lernen und verarbeiten Informationen auf höchst anpassungsfähige Arten. Diese koordinierte Funktionalität ergibt sich aus mehreren, sehr komplexen molekularen Mechanismen diesem Laufwerk sowohl kurzfristige als auch langfristige synaptische Plastizität1,2,3,4,5. Neuromorphen-computing-Systeme wollen emulieren synaptische Funktionen auf Ebenen nähert sich die Dichte, Komplexität und Energieeffizienz des Gehirns, die notwendig sind, für die nächste Generation von Gehirn-wie Computer6,7 , 8. synaptische Funktionen mit Hilfe von traditionellen elektronischen Schaltelemente zu reproduzieren ist jedoch praktisch unmöglich9, stattdessen erfordert die Konstruktion und Herstellung der neuen Hardware-Elemente, die auf eingehende Signale anpassen können und erinnern Informationen Geschichten9. Diese Arten von Synapse-inspirierten Hardware sind als Mem-Elements9,10,11 (kurz für Speicherelemente), bekannt, die nach Di Ventra Et Al.9,11, passive, zwei-Terminal-Geräte, deren Widerstand, Kapazität oder Induktivität als Reaktion auf äußere Reize neu konfiguriert werden kann, und die vorherige Staaten11erinnern können. Um Energieverbräuche nähert sich in das Gehirn zu erreichen, sollten diese Elemente ähnliche Materialien und Mechanismen für die synaptische Plastizität12beschäftigen.
Bisher worden zwei-Terminal Memristoren13,14,15 überwiegend gebaut mit komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) Technologie, zeichnen sich durch hohe schaltende Spannungen und hohen Geräuschpegel. Diese Technologie skaliert nicht gut wegen hoher Stromverbrauch und geringe Dichte. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurden mehrere organische und Polymere Memristoren vor kurzem gebaut. Diese Geräte weisen jedoch deutlich langsamer Schaltdynamik durch zeitaufwendige Ion Diffusion durch ein leitfähiges Polymer-Matrix16,17. Infolgedessen sind die Mechanismen, mit denen beide CMOS-basierte und organischen Memristive Geräte Synapse-inspirierte Funktionen emulieren, hoch phänomenologische, umfasst nur wenige synaptische Funktionen wie Spike Timing abhängigen Plastizität (STDP) 18, während mit Blick auf andere wichtige Funktionen auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Herstellung des Gehirns eines leistungsfähigen und effizienten Computers, z. B. präsynaptischen, kurzfristige Plastizität19.
Vor kurzem führten wir eine neue Klasse von Memristive Geräten12 mit Spannung aktiviert Peptide biomimetische Lipidmembranen gegründet, die imitiert, biomolekulare Zusammensetzung, Membran-Struktur und Ion Kanalumschaltung ausgelöst Mechanismen der biologischen Synapsen20. Wir beschreiben hier, wie zu montieren und diese zwei-Terminal-Geräte, elektrisch zu verhören mit besonderem Schwerpunkt auf kurzfristige Plastizität für die Umsetzung in Online-Bewertung lernen Anwendungen12. Gerätemontage basiert auf die Tröpfchen Interface Bilayer (DIB)21 -Methode, die in den letzten Jahren weitgehend verwendet worden ist, um die Biophysik des Modells Membranen21 und Membrane-springen Ionen-Kanäle22,23zu studieren, 24, und als Bausteine für die Entwicklung der Reize reagierende Materialien25,26. Wir beschreiben Membranverfahren Montage- und Verhör im Detail für Interessenten in neuromorphen Anwendungen aber wenig Berufserfahrung in Biomaterialien oder Membran Biologie. Das Protokoll enthält auch eine vollständige Beschreibung des Verfahrens Charakterisierung, die ebenso wichtig wie der Montage, die dynamische und rekonfigurierbaren elektrischen Eigenschaften der Vorrichtung27gegeben ist. Die hier beschriebenen Verfahren und Vertreter Ergebnisse sind Grundlagen für eine neue Klasse von Low Cost, Low-Power, weiche Mem-Elemente basierend auf Lipid-Schnittstellen und andere Biomoleküle für Anwendungen im neuromorphen computing, autonome Strukturen und Systeme, auch adaptive Gehirn-Computer-Schnittstellen.
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Protocol
1. Allgemeine Anweisungen und Vorsichtsmaßnahmen
- Wählen Sie geeignete, unbeschädigte Messung/mischen Glaswaren (Fläschchen, Becher, etc.) und andere Labware (Spatel, Löffel, etc.) für den Einsatz.
- Mit Glaswaren sorgfältig durch, um Beschädigungen zu vermeiden, und Latex oder Nitril Handschuhe zur Vermeidung einer Kontamination der Glaswaren/Labware mit Rückständen von Fingerspitzen und zum Schutz Ihrer Haut.
- Saubere gewählten Glaswaren/Labware gründlich mit Wasser und Waschmittel-Lösung durch Schrubben mit einer weiche Flaschenbürste bis Sie sauber und alle Rückstände entfernt sind.
- Spülen Sie gründlich mit Leitungswasser und dann mit entionisiertem Wasser (DI). Platz am Wäscheständer an der Luft trocknen.
-
Optional: Spülen Sie die gereinigten Gläser/Labware mit Isopropylalkohol (IPA, 99,5 %) und legen Sie unter Vakuum verdampfen alle verbleibenden IPA um sicherzustellen, dass sie frei von Verunreinigungen (~ 2 h). Entfernen von Vakuumkammer und in sauberer Umgebung.
Hinweis: Verwenden Sie fusselfrei Tücher zum Abwischen von Glaswaren und Laborartikel. Kaufen Sie und benutzen Sie sterile kleinen Glasfläschchen und Safe-Lock Tubes für Materialien Vorbereitung und Sample-Speicher. Weitere Details über Glaswaren, Reinigung und andere Labor Standard Operating Procedures finden Sie in der Jupiter Science Education Database-28.
2. Vorbereitung des wässrigen Pufferlösung
- Latex oder Nitril Handschuhe, wählen Sie eine geeignete und saubere Glasbehälter, 50 mL wässrige Puffer vorzubereiten (500 mM Natriumchlorid (KCl), 10 mM 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS), pH 7,0).
- Mit einer Massenbilanz digital, hohe Präzision und einem sauberen Spatel, verzichten Sie 1,86378 g KCl auf sauber mit einem Gewicht von Papier zu und fügen Sie den Glasbehälter.
Hinweis: Die Beträge von KCl und MOPS sollte variieren je nach der gewünschten Lautstärke und Endkonzentrationen gewünscht. - Wiegen Sie 0,10463 g von MOPS und verleihen Sie den Glasbehälter. Fügen Sie dann 50 mL VE-Wasser zu den Glasbehälter und Vortex gründlich bis KCl und MOPS vollständig gelöst sind.
- Lagern Sie die Pufferlösung bei Raumtemperatur und verwenden Sie, wenn nötig.
Hinweis: Während Pufferlösungen für relativ lange Zeiträume gespeichert werden können, wird empfohlen, frisch zubereitete Pufferlösungen für bessere und gleichmäßigere Ergebnisse zu verwenden.
3. Vorbereitung der Liposomen
Hinweis: Schritt 3.1 gilt nur, wenn Phospholipide als lyophilisierte Pulver erworben werden, und daher können übersprungen werden, wenn die Phospholipide in Chloroform gekauft werden.
- 5 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) oder Gehirn Total Lipid-Extrakte (BTLE) Lipide in 1 mL Chloroform in einer 5 mL sterile Glas-Durchstechflasche auflösen.
- Während sanft wirbeln, verdunsten Sie das Chloroform unter einen sanften Strom von trockenem Stickstoff bis ein Lipid-Film an der Unterseite der Flasche bleibt.
- Legen Sie das Fläschchen mit der Lipid-Film unter Vakuum für 10-12 h, um vollständige Entfernung der restlichen Chloroform zu ermöglichen.
- Entfernen Sie das Fläschchen aus der Vakuumkammer und rehydrieren Sie die Lipid-Film durch Zugabe von 10 mL der wässrigen Pufferlösung vorbereitet in Schritt2 eine abschließende Lipidkonzentration von 2 mg/mL zu erreichen.
- Einfrieren (-20 °C) und vollständig Auftauen der Lipid-Suspension sechsmal multilamellar Liposomen Montage zu erleichtern.
Hinweis: Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur, nie in einem beheizten Umfeld Auftauen. - Extrudieren Sie mit Hilfe eines handelsüblichen Extruders, die Liposomen-Lösung durch die komplette Lipid-Aussetzung durch eine 0,1 μm Pore Durchmesser Track-etched Membran zu erzwingen. Extrudieren Sie die Suspension 11mal in unmittelbarer Folge Unilamellar Liposomen mit einem Durchmesser von c.a. 100 nm für richtige Lipid Monolage Bildung benötigt zu erhalten. Speichern der Liposomen-Aussetzung bei 4 °C und innerhalb von 1 Woche der Vorbereitung verwenden. Der Einfachheit halber beziehen sich auf die resultierende Liposomen-Lösung als "A".
Hinweis: Für die Extrusion von BTLE Liposomen, ist der Forscher ermutigt zum Aufwärmen der Extruder, 45-50 °C höher als der Phasenübergang Temperatur der BTLE Lipide (~ 37 °C)23,29, um einfacher Extrusion zu ermöglichen. Hydratisiert BTLE Liposomen Suspensionen auch direkt (anstelle von Frost-Tau-wechseln und Extrusion) angefertigt werden können indem man das geschlossene Aussetzung Fläschchen in in einem Bad Sonikator bei 55 °C für ca. 15 min.
(4) Rekonstitution von Alamethicin Peptiden
Hinweis: Diese Vorgehensweise beschreibt den Prozess der Alamethicin Rekonstitution in Liposomen, eine Endkonzentration von 1 μM. Diese Konzentration ist ausreichend, ähnlich wie die zuvor veröffentlichten12nA-Ebene Ströme induzieren. Erhöhung der Peptid-Konzentration verringert die Schaltschwelle und erhöhen die Amplituden der Ströme induziert durch die angelegte Spannung29.
- Lösen Sie Alamethicin Peptide in Ethanol, eine Endkonzentration von 2,5 mg/mL, Wirbel kurz, gut mischen auf und bewahren Sie Vorratslösung im Gefrierschrank (-20 °C auf).
Hinweis: Alamethicin Peptide werden in der Regel in Pulverform gekauft. - Mischen Sie in einem 1,5 mL-Safe-Lock-Rohr 99 μl Lösung "A" mit 1 μl der Stammlösung Alamethicin, eine endgültige Alamethicin Konzentration von 13 μM in der Liposomen-Suspension zu erreichen. Wirbel um gut zu mischen. Die daraus resultierenden Peptid-Liposomen-Lösung als "B" bezeichnet.
- Mix-117 μL der Lösung "A" mit 10 μl der Lösung B für eine endgültige Alamethicin Konzentration von 1 mM und dann Wirbel gut mischen. Die resultierende Lösung als "C" bezeichnet.
- Speichern der Lösungen " "B "" und " "C "" bei 4 °C und Nutzung nach Bedarf.
5. Vorbereitung des Agarose-gel
- Mit einer Massenbilanz digital, hohe Präzision und einem sauberen Spatel, ein sauberes Papier mit einem Gewicht von 0,5 g Agarose Pulver hinzufügen.
- Übertragung der Agarose 50 mL VE-Wasser hinzufügen und wog Agarose, ein sauberes Glas 100 mL-Becherglas.
Hinweis: Dies wird eine 1 % (wt/Vol) Agarose-Gel-Lösung ergeben. - Legen Sie ein sauberes rühren Magnet in das Glasgefäß und stellen Sie den Becher auf eine mitreißende Heizplatte.
- Bringen Sie unter Rühren die Mischung zum Kochen, bis Agarose komplett aufgelöst ist.
- Entfernen Sie das Becherglas von der Heizplatte auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bei 4 °C lagern und bei Bedarf zu verwenden.
- Vor erneutem Gebrauch wieder schmelzen Sie die Agarose durch Erhitzen mit einer Heizplatte oder in der Mikrowelle.
6. Herstellung des Ölbehälters
Hinweis: Das unten beschriebene Verfahren ist nur eine von vielen Möglichkeiten, einem Ölbehälter gefertigt werden kann. Der Leser wird ermutigt, entwerfen und fertigen ein Reservoir anhand der zur Verfügung stehenden Materialien, Bearbeitung von Fähigkeiten und Bedürfnissen.
- Schneiden Sie mit einer Bandsäge, ein 12 x 12 x 12 mm Acryl Würfel aus einer größeren 12 mm Dicke Acrylglasplatte.
- Fräsen Sie ein Loch mit 12 mm Durchmesser bis zu einer Tiefe von 8 bis 12 mm in das Acryl Rohr (Abbildung 1a).
7. Vorbereitung der Elektroden
- Mit einer Schere, Schnitt zwei Stücke (75 mm) von silbernen Drähten (125 μm Durchmesser).
- Mit einer offenen Flamme Feuerzeug, Schmelzen Sie ein Ende jedes Silberdraht, Form kleine kugelförmige Kugeln (rund 250 μm Durchmesser).
- Tauchen Sie die Kugelköpfe in Bleichmittel für 1-2 h, eine Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) Beschichtung zu schaffen. Eine dunkelgraue Farbe zeigt an, dass die Ag/AgCl-Beschichtung (Abbildung 2a) gebildet hat.
- Beide Drähte aus Bleichmittel entfernen, Nachspülen mit VE-Wasser und beiseite legen Sie auf einem sauberen fusselfreien Tuch.
- Tauchen Sie die Kugelköpfe in geschmolzenem Agarosegel erstelle ich eine dünne Schicht. Diese Gel-Beschichtung hilft, um die wässrigen Tröpfchen auf die Drähte unter Öl zu verankern.
- Mit einem Glasschneider, gespalten Sie eine 10 cm lange, 1/0,58 OD/ID mm Borosilikatglas Kapillare in zwei 5 cm Kapillaren.
- Einfügen Sie eines der Glaskapillaren in einen Elektrodenhalter (Abb. 2 b, c), und dann eines der Ag/AgCl-Draht in das Glas Kapillare (Abb. 2d). Füttern Sie den anderen Ag/AgCl-Draht in das zweite Glas Kapillare.
- Montieren Sie die zweite Glas-Kapillare zu einer Mikropipette Glashalter (Abbildung 2e, f).
8. Aufbau des Experiments
- Platzieren Sie einen 1 mm dick, 25 x 75 mm-Objektträger auf der Bühne von einem inversen Mikroskop (Abb. 1a).
- Tropfen Sie ein paar Hexadecan Öl auf die Mitte der Glas-Folie, und platzieren Sie den Ölbehälter direkt auf das Öl auf den Objektträger.
Hinweis: Hinzufügen von Öl zwischen dem Glas Folie und Öl-Reservoir dient zum Abgleichen der Brechungsindex des Substrates, klarere und schärfere Bilder liefern. - Der Ölbehälter vollständig mit Hexadecan Öl auffüllen. Stellen Sie sicher, dass das Reservoir über das Objektiv sitzt.
Hinweis: Andere hydrophob Öle können auch verwendet werden. - Den Elektrodenhalter an der Headstage eines aktuellen Verstärkers anschließen. Die Headstage muss auf einem Mikromanipulator (Abbildung 1a), Elektrodenlänge zu minimieren und elektrisches Rauschen montiert werden.
- Befestigen Sie die Glas Mikropipette Halterung mit dem zweiten Ag/AgCl-Draht auf ein anderes Mikromanipulator (Abbildung 1a).
- Mithilfe der Manipulatoren, Position, die die Elektroden so, dass die Agarose Tipps der Ag/AgCl Drähte beschichtet vollständig in den Ölbehälter an eine ähnliche vertikale Ebene untergetaucht sind.
- Richten Sie die beiden Elektroden und trennen Sie diese durch ein paar Millimeter (Abbildung 1a, b).
Hinweis: Nach dem Hinzufügen der Tröpfchen (in Schritt 13beschrieben), müssen die Drähte eingelegt werden ganz nach unten bis die Elektrodenspitzen unten des Ölbehälters berühren. Diese Schritt wird sichergestellt, dass die Drähte nicht schwingen und somit unnötige Schwankungen in den gemessenen Strom minimiert.
(9) ordnungsgemäße Erdung um elektrisches Rauschen zu reduzieren
- Erstellen einer Boden-Bus Gewinde einer Schraube in die Anti-Vibrations-Tabelle, auf die das Mikroskop (Abb. 3a) gelegt werden.
Hinweis: Verwenden ein Anti-Vibrationstisch ist erforderlich, um Schwingungen aus der Umgebung zu minimieren, die zu unerwünschte Schwankungen der gemessene Strom führen können. - Mit einem leitfähigen Draht, verbinden Sie die Schraube mit einer Erdung (Abbildung 3a), und schließen Sie dann den Mikroskoptisch an den Boden Bus.
- Platzieren Sie einen Faradayschen Käfig über den Versuchsaufbau zur Reduzierung von Lärm und dann elektrisch verbinden Sie es mit dem Boden Bus (Abb. 3 b).
Hinweis: Es wird immer empfohlen, unnötige Erdschleifen zu vermeiden da sie zu einer Zunahme der Messung Geräuschpegel führen können.
10. Feedback-gesteuerte Heizung
- Maschine einen Aluminium Heizung Schale in dem Ölbehälter29behaglich passen kann.
- Stellen Sie sicher, lassen Sie eine Öffnung an der Unterseite der Schale, durch die Shell über den inversen Mikroskop betrachten zu können.
- Legen Sie ein 30 x 30 mm resistiven Polyimid flexible Heizelement unterhalb der Alu-Schale.
- Legen Sie eine isolierende Polydimethylsiloxan (PDMS) Wafer unter die Heizung zur Reduzierung von Wärmeverlusten in der Richtung nach unten und zum Schutz des Mikroskoptisch.
- Legen Sie ein Thermoelement in der Ölphase. Nach sicherstellen, dass das Thermoelement nicht entweder Ag/AgCl Draht berührt, anschließen Sie die Thermoelement Drähte an einem Thermoelement Daten Ankaufskommission und Rekord Temperatur mit Individualsoftware Programmierung.
Hinweis: Schreiben Sie eine On-Off, proportionale integrative (PI) Feedback Temperaturregelung um Heizung und passive Kühlung der Temperatur des Öls auf einen gewünschten Wert zu aktivieren. Codes können Leser auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.
11. Aufbau der Software und Ausrüstung
- Bereiten Sie die Datenerfassungs-Software durch Einschalten/Computer, Mikroskop, Funktionsgenerator, Stromverstärker und geräuscharme Datenerfassungssysteme.
Hinweis: Während alle aktuellen Sensorik verwendet werden kann, sind die folgenden Anweisungen speziell für die in Tabelle Materialienaufgeführt. Shlyonsky Et Al.30steht für Forscher, die ihre eigenen Stromverstärker bauen wollen. - Auf der Vorderseite der Patch-Clamp Stromverstärker, stellen Sie die Frontplatte Anzeige und Quelle-Messung Modus wählt, VHOLD/IHOLD und V-CLAMP, beziehungsweise.
- Setzen Sie auf der Vorderseite den Lowpass Bessel Filter 1kHz und Output Gain auf 0,5.
Hinweis: Auswahl einer niedrigen Ausgangspegel ermöglicht Aufnahme größere höhere aktuelle Amplituden, während Erhöhung des Verstärkung Opfer Messbereichs für Messrauschen verringern. - Legen Sie die Konfiguration , ganze Zelle β = 1. Dieser Wert kann später auf 0,1 bis Aufzeichnung der größere Amplitude Ströme geschaltet werden.
- Legen Sie alle anderen Kontrolle Zifferblätter auf Null oder in einer neutralen Position.
- Initialisieren Sie die Software durch Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop.
- Klicken Sie auf Konfiguration | Digitizer , öffnen Sie das Dialogfeld " Digitizer ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " ändern ".
- Wählen Sie im Wandel Digitizer -Dialog den entsprechenden Digitizer aus Digitizer Typenliste.
- Klicken Sie auf die Scan -Taste, um den Digitizer zu erkennen.
- Klicken Sie auf "OK" um die Änderung Digitizer -Dialogfeld zu schließen, und klicken Sie dann auf "OK" , um das Dialogfeld " Digitizer " zu beenden.
- Klicken Sie auf ConAbbildung | Labortisch.
- Im Register Input Signale der Laborbanksoll den Skalierungsfaktor 0,0005 V/PA.
Hinweis: Dieser Wert muss aktualisiert werden, wenn der Gewinn oder β-Werte geändert werden.
12. die Pipette Offset
Hinweis: Die unten beschriebene Verfahren gilt nur für Stromverstärker in Tabelle Materialienerwähnt.
- 200 einzahlen mit einer Mikropipette nL der wässrigen Lipid-Lösung "A" auf die Enden der einzelnen Ag/AgCl-Draht unter Öl.
- Bringen Sie die Tröpfchen in Kontakt zu, und drücken Sie die ZAP -Taste auf der Frontplatte des Verstärkers, die Tropfen in einem Band umfasst beide Elektroden verschmelzen. Dies sollte induzieren eine Kurzschluss-Reaktion.
- Set Quelle-Messung-Modus-Wahlrad auf Spur.
- Ändern Sie die Frontplatte Display Zifferblatt in VSpur.
- Drehen Sie die PIPETTER ausgeglichen wählen (im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn) bis Meter mal gelesen 0 mV und ist stabil.
- Rückkehr der Quelle-Messung-Modus-Wahlrad zur V-CLAMP und die Frontplatte zeigt Zifferblatt v halten/ihalten.
13. Bildung von Lipid Bilayer
- Lassen Sie die Tropfen, die zuvor durch Verschieben der Elektroden vertikal aus der Ölphase abgelagert wurden. Dies bewirkt, dass die Tropfen von den Elektroden in das Öl fallen. Wieder tauchen Sie und positionieren Sie die Elektroden in Öl.
- Verwenden Sie die Mikropipette, Kaution 200 nL Lipid-Lösung "A" auf jeder der Drähte.
- Warten Sie ca. 3-5 min, um spontane Lipid Monolage Montage an jedem Wasser/Öl-Schnittstelle auftreten zu ermöglichen.
Hinweis: wie die Lipid Monolage Formen, die Wasser/Lipid/Öl-Schnittstelle Oberflächenspannung abnimmt, die die Tröpfchen durchhängen, wenn das umgebende Öl ausreichend weniger dichten21verursachen können. - Niedriger die Elektroden (Tröpfchen) bis zum Ende beiden Elektroden kaum berühren den Boden des Ölbehälters (Abbildung 1 b) und verschieben Sie sie horizontal, um die Tropfen in Kontakt zu bringen.
Hinweis: Die Lipid-Bilayer wird spontan durch den Ausschluss überschüssigen Öl zwischen den sich berührenden Tröpfchen dünn. In der Regel tritt dieser Prozess innerhalb von 1 min.
14 elektrische Charakterisierung der biomolekularen Memristor
- Lipid Bilayer Bildung
- Aufzeichnen die Lipid Bilayer Formation, das entspricht einer Zunahme der elektrischen Kapazität zwischen Tröpfchen gelten Sie ein 10 Hz, 10 mV dreieckige Wellenform Spannung mit einem Funktionsgenerator (Abbildung 4) verbunden mit dem externen Eingang der Patch-Clamp Verstärker.
Hinweis: Aufgrund der kapazitiven die Lipidmembran sollte die resultierende aktuelle Antwort eine quadratische Wellenform (Abbildung 4). Bei der Lipid Bilayer Bildung, Schritt 11,6, sollte der Forscher sehen eine Wachstum in der aktuellen Spitze-Spitze-Amplitude und beachten Sie auch eine optische Veränderung zwischen angeschlossenen Tröpfchen (Abbildung 4).
- Aufzeichnen die Lipid Bilayer Formation, das entspricht einer Zunahme der elektrischen Kapazität zwischen Tröpfchen gelten Sie ein 10 Hz, 10 mV dreieckige Wellenform Spannung mit einem Funktionsgenerator (Abbildung 4) verbunden mit dem externen Eingang der Patch-Clamp Verstärker.
- Strom-Spannungs-Messungen
Hinweis: Der biomolekularen Memristor ist als einen Widerstand und einen Kondensator parallel12,21modelliert. Daher kann die aktuelle Antwort des Geräts resistive und kapazitive Komponenten abhängig von der Frequenz der angelegten Spannung enthalten. Die Memristive Natur des Geräts zu studieren und zu den eingeklemmten hysteretische Strom-Spannungs-Beziehung12können kapazitive Strom aus der Gesamtstrom subtrahieren erforderlich. Das Protokoll unten beschreibt dieses Verfahren.- Mit einem Funktionsgenerator, gelten Sie eine Spannung Wellenform (Dreiecks- oder sinusförmigen) für eine Alamethicin-freie Lipidmembran montiert mit Tropfen der Lösung "A".
- Notieren Sie die induzierte aktuelle Antwort über mehrere Frequenzen.
Hinweis: Kapazitive Ströme werden bei Frequenzen unterhalb von 10 mHz minimiert. - Notieren Sie die Größe der Grenzflächen Lipid Bilayer durch entweder Messung des Durchmessers der Lipidmembran auf Computer oder durch Aufnahme der Peak to Peak aktuelle Amplitude aus 10 Hz, 10 mV Dreieckswelle. Die aktuelle Amplitude ist proportional zu der Membran-Kapazität, die ist wiederum proportional zur Fläche der Membran.
- Entfernen Sie die Tröpfchen, die keine Alamethicin enthalten.
- Fügen Sie neue wässrige Tröpfchen, die mit "C"-Lösung und bilden ein Lipid Bilayer.
- Verwenden Sie die Mikromanipulatoren Kontakt zwischen Tröpfchen anpassen, so dass die Bilayer einen ähnlichen Bereich (Durchmesser oder Rechtecksignal aktuelle Amplitude) als eine früher gebildet hat.
- Wiederholen Sie 14.2.1 und 14.2.2.
- Subtrahieren Sie aktuellen im Schritt 14.2.2 aus aktuellen in Schritt 14.2.7. aufgezeichnet.
- Plot des induzierten Stroms versus angelegte Spannung für jede Frequenz und Wellenform, die "eingeklemmten Hysterese" Memristive Antwort zu erhalten.
- Puls-Experimente
- Mit einem benutzerdefinierten Programmiersoftware und analoge Spannungsquelle, erzeugen Sie Spannungspulse mit spezifischen hohen und niedrigen Amplituden, pünktlich und Ausschaltzeit.
Hinweis: Dies ist nicht erforderlich, wenn die Spannungsimpulse mit einem kommerziellen Funktionsgenerator generiert werden konnte. - Notieren Sie die aktuelle Reaktion auf angewandte Impulse.
- Aufgrund der kapazitiven der Memristor werden kapazitive Spitzen aufgezeichnet. Entfernen Sie Stacheln durch Anwenden eines Tiefpass-Filters mit entsprechenden Durchlassbereich.
- Mit einem benutzerdefinierten Programmiersoftware und analoge Spannungsquelle, erzeugen Sie Spannungspulse mit spezifischen hohen und niedrigen Amplituden, pünktlich und Ausschaltzeit.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau zu montieren und zu charakterisieren, der biomolekularen Memristor verwendet. Senken die freien Enden der Elektroden an der Unterseite des Ölbehälters, wie in Abbildung 1 b, fand hilfreich zur Minimierung von Schwingungen der Elektroden und Tröpfchen, die in Variationen in gemessenen Strom und Bilayer Bereich, insbesondere in Fällen führen kann wo das Heizöl konvektive Strömung im Öl erzeugen kann. Abbildung 2 zeigt das Verfahren und Ergebnis der Montage Ag/AgCl-Drähte, Klasse Kapillaren und Inhaber der Elektrode und Mikropipette. Die Einrichtung befindet sich in eine ordnungsgemäß geerdete Faraday-Käfig (Abbildung 3), um elektromagnetische Störungen zu minimieren.
Es ist zwingend notwendig, um eine stabile, isolierende Lipid Bilayer für diese Studie bilden. In diesem Protokoll baut ein Lipid Monolage an den Öl/Wasser-Grenzflächen der wässrigen Tröpfchen in Öl getaucht. Beim Kontakt zwischen Tröpfchen überschüssiges Öl ist ausgeschlossen, und die gegnerischen Lipid-Monolagen dünn, ein 5-nm dicken Lipid Bilayer. Die am weitesten verbreitete Technik in Bilayer Elektrophysiologie ist Spannung-Clamp, wo die Spannung über der Bilayer gesteuert und der induzierte Strom gemessen wird. Abbildung 4a zeigt die kapazitiven Rechtecksignal Strom induziert durch eine 10 mV, 10 Hz Spannung während Bilayer Bildung. Während die Amplitude auf den Start Bilayer Ausdünnung und anschließende radiales Aufweiten der ausgedünnten Membran erhöht, bleibt die Wellenform quadratisch. Die Steady-State Amplitude der aktuellen quadratische Welle kann, nominalen Bereich Lipid Bilayer berechnet werden mit einem vorgegebenen Wert der speziellen Membran Kapazität für eine DPhPC Bilayer21. Darüber hinaus kann Bilayer Bereich visuell durch Messung des Durchmessers Bilayer aus einem Bild aufgenommen mit dem Mikroskop Abbildung 4 bbeurteilt werden. Für genaue Lipid Bilayer Flächenberechnungen sollte der Leser auf Taylor, Et Al.21beziehen. Die Fläche von Lipid Bilayer kann eingestellt werden, durch eine Änderung der relativen Positionen der Tröpfchen21,31.
Auf Antrag von einer Spannung Vorspannung, ein Alamethicin-freie Lipid Bilayer wird die aktuelle Antwort abhängig von der Frequenz der Eingangsspannung. Bei niedrigen Frequenzen (< 10-50 mHz), wo der Widerstand der Bilayer die komplexen Impedanz dominiert die ohmsche aktuelle Antwort ist vernachlässigbar, da der nominale Membran-Widerstand in der Regel größer als 10 GΩ ist. Mit zunehmender Eingangsfrequenz trägt Membran Kapazität mehr zur die Impedanz des Systems, was in der aktuellen nicht-null-Antwort angezeigt in der Handlung des aktuellen versus Spannung in Abbildung 5a. Wann geben die gleiche Spannung Wellenform (150 mV) gilt für biomolekulare Antwort bestehend aus einer Alamethicin-dotierten Lipidmembran, und wenn die Spannungsamplitude einen kritischen Einfügung Schwellenwert überschreitet (~ 100 mV für eine DPhPC Membran bei Raumtemperatur), Alamethicin Peptide mit Wohnsitz an der Oberfläche des Lipid Bilayer stecken Sie in die Membran und aggregieren zu Form leitfähige Poren. Die Schwelle-abhängige Bildung von Ionenkanälen führt zu einer nichtlinearen makroskopischen aktuelle Antwort, mit exponentiell steigenden Ströme bei Spannungen höher als die Einfügung Schwelle (Abb. 5 b). Während Alamethicin Peptide Form Gleichrichtung Ionenkanäle nur bei ausreichend positive Spannungen bekannt sind, ist die symmetrische Natur dieser aktuelle Antworten auf beide Polaritäten durch die Einfügung und Aggregation von getrennte Populationen von Peptiden, die jeweils aus gegenüberliegenden Seiten der Membran. Abhängig von der Frequenz der angelegten Spannung kann die induzierte aktuelle Antwort auch Beiträge aus der kapazitive Strom enthalten. Daher muss der kapazitive Strom in Abbildung 5a aus der total aktuelle angezeigte in Abbildung 5 b abgezogen werden, um nur die Memristive eingeklemmt Hysterese Strom-Spannungs Antwort, dargestellt in Abbildung 5 c, dzu erhalten.
Abbildung 6 zeigt die Schaltung Dynamik eines biomolekularen Memristor durch eine Impulsfolge Spannung induziert (130 mV (hoch), 20 mV (LOW), 100 ms (ON), 20 ms (OFF)). Die OFF-Spannung wird gewählt, um 20 mV, die Rückkehr des Geräts in einem isolierenden Zustand zu unterscheiden, wie Alamethicin Kanäle der Bilayer eher von aktuellen bei Null-Spannungseingang einfach verschwinden lassen. Die kumulativen Anstieg im ein-Zustand Strom während der aufeinanderfolgenden Spannungsimpulse stellt gepaart-gepulste Erleichterung, eine Plastizität, dass flüchtige biomolekularen Memristoren12ausstellen können.
Abbildung 1: Versuchsaufbau und Hauptteile. (ein) die standard-Workstation für die Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristor gehören einem inversen Mikroskop, 3-Achs Mikromanipulatoren, einer Digitalkamera, einem Rütteltisch Isolierung, ein Elektrodenhalter, ein Glashalter Mikropipette ein Stromverstärker, Funktionsgenerator und einem Ölbehälter. Das Setup ist auf der Bühne des Mikroskops montiert, wie in Schritt 11-13 beschrieben. (b) einem vergrößerten Foto des Setup zeigt die Tipps der Ag/AgCl Drähte berühren den Boden des Ölbehälters. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Elektrode Vorbereitung Verfahren. Fotos zeigen: (ein) das Silber Drähte einweichen in Bleichmittel; (b) ein Elektrodenhalter; (c) mit einem 5 cm langen Glas-Kapillare der Elektrodenhalter verbunden; (d) Ag/AgCl-Elektrode gespeist durch das Glas Kapillare; (e) einer Mikropipette Glashalter; und (f) die fertig montierten Elektroden und Inhaber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Erdung Verfahren. Fotos zeigen: (ein) eine Schraube mit Gewinde in der Vibration Isolation Tischfläche erstelle ich einen Boden-Bus Verbindung zur Erdung; und (b) ein Labor gemacht Faraday-Käfig für das Öl-Reservoir und Elektrode Setup, die Messung von elektromagnetischen Störungen zu schützen. Sowohl im Käfig als auch im Mikroskop Bühne gefesselt auf den Boden bus via Kabel I und II. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: In Echtzeit aktuelle Messungen zeigen erste Bilayer Ausdünnen und areal Wachstum. (ein) die aktuelle gemessene (oben) während der spontanen Bilayer Bildung zwischen Lipid-beschichtete Tröpfchen als Reaktion auf eine dreieckige Wellenform-Spannung. Das Ausmaß der gemessene Strom ist direkt proportional zur Kapazität der Schnittstelle und damit den Bereich der Bilayer. Der Bereich der Oberfläche kann durch Veränderung des Abstandes zwischen den beiden Tropfen tragenden Elektroden variiert werden. (b) ein Bild erworben durch den inversen Mikroskop zeigt eine Ansicht von unten und Abmessungen von einer typischen Membran-basierten biomolekularen Memristor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Strom-Spannungs-Beziehung und eingeklemmter Hysterese. (ein) der Strom-Spannungs Antworten eine Alamethicin-freie DPhPC Lipid Bilayer. Eine nur-Lipid-Membran ist (~ 10 GΩ) hochisolierend was erklärt die niedrigen ohmsche aktuelle Antwort bei 0,017 Hz, eine Frequenz, wo die Impedanz von Membran Widerstand beherrscht wird. Bei höheren Frequenzen leistet wichtige Beiträge Membran Kapazität mehr für die Gesamtimpedanz der Schnittstelle, wodurch eine kapazitive Induktionsstrom Null. (b) die dynamische Strom-Spannungs-Beziehungen versus Frequenz ein Lipid Bilayer zwischen zwei Tropfen mit Alamethicin Peptide (erhältlich mit einer dreieckigen Eingang Welle) gebildet. (c) die Memristive, erhält man eingeklemmter hysteretische aktuelle Antwort des Geräts durch Subtraktion des kapazitiven Stroms in ein von der Gesamtstrom angezeigt in bangezeigt. (d) Zoomen in die Unterschiede zwischen der Summe und Memristive Strömungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Reaktion der biomolekularen Memristoren auf rechteckigen Spannungsimpulse und Plastizität. Das Gerät reagiert auf nachfolgende Spannungsimpulse mit einem Anstieg der Leitfähigkeit während der Einschaltzeit, trotz zeitweise eine isolierende Wiederherstellungsstatus während jedes OFF-Zeit. Die Erhöhung der Strom von Puls zu Puls zeigt, dass die momentane Leitwert des Gerätes eine Funktion der heutigen Reiz und vorherige Reize, analog zu kurzfristige Plastizität in Bio-Synapsen ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Montage und Charakterisierung von biomolekularen Memristoren basierend auf Ionen-Kanal-dotierte synthetische Biomembranen zwischen zwei Wassertröpfchen in Öl gebildet. Das weiche Materie, zwei-Terminal Gerät konzipiert und studierte bis: 1) besiegten Einschränkungen, die mit Solid-State-Technologie verbunden sind, wie z. B. hohe Rauschen, hohen Energieverbrauch und hohe Spannungen, Wechsel (2) genauer Zusammensetzung, imitieren strukturieren Wechsel Mechanismen der biologischen Synapsen und 3) erforschen die Mechanismen und Funktionen des Bio-Synapse Plastizität, die nicht von Solid-State-Geräte ausgestellt sind.
Die Tröpfchen Schnittstelle Bilayer Technik21, die den Baustein der heutigen Technologie12darstellt, ist eine einfache, modulare Ansatz für Membran-Baugruppe, die ausgiebig genutzt wurde, um die Membran Biophysik21zu studieren, Proteine22, Ionen-Kanäle29und andere Biomoleküle32. Es bietet konkrete Vorteile für die präzise Steuerung und Verhören Modell Membranen und ist einen Baustein für mehr Reize reagiert und autonomen Materialien26. Mehrere Methoden sind entwickelt worden, um Tropfen Schnittstelle Bilayer montieren, einschließlich der hängenden Tropfen21 -Methode, die wurde als die main-Methode zu entwickeln und zu charakterisieren die biomolekularen Memristor angepasst. Obwohl diese Membran Montagetechnik in früheren Studien verwendet wurde, präsentieren hier wir eine gründliche Protokoll, das erlaubt es den Forschern, neu und Memristive Tropfen Schnittstelle Bilayer in eigenen Laboratorien zu studieren. Das Protokoll ist speziell in einer Weise zu erlauben Forschern in den Biologie-Membran Bereichen der neuromorphen-Gemeinschaft, zu verstehen und diese Verfahren neu geschrieben.
In seiner einfachsten Form kann das Protokoll, die, das wir hier beschrieben haben, für die Beurteilung der Memristive Funktionalitäten eine Biomembran, mit grundlegenden Labor-Geräte wie Funktionsgenerator, ein Mikroskop und eine aktuelle Mess-System repliziert werden. Das zusammengebaute Gerät ist elektrisch Äquivalent zu einem Widerstand (~ 10 GΩ) und einem Kondensator parallel verdrahtet. In Anwesenheit von Peptiden, wie Alamethicin, die in der Lage bilden spannungsabhängige Poren in der Membran sind, der Membran Widerstand deutlich sinkt, und ohmsche Strom als Reaktion auf Spannung Eingangssignale (gleich- oder Wechselspannung) detektiert werden. Jedoch bedeuten, dass die große Membran Widerstand und frequenzabhängige elektrische Impedanz des Gerätes: 1) induzierten Ströme sind klein (pA-nA) und elektromagnetische Störungen; und 2) muss darauf geachtet werden, genau zu induzieren und Messen Sie die gewünschte Memristive Eigenschaften getrennt von kapazitiven Membran Antworten bzw.. In Reaktion auf eine Wechselspannung und abhängig von der Frequenz des Signals wird der aufgenommene Strom kapazitive und resistive Komponenten enthalten. Um die eingeklemmten Hysterese zu erreichen, die eine Signatur des Memristive Gerät ist, muss man das Protokoll in Schritt 14 beschrieben folgen. Die hängenden Drähte sind anfällig für Schwingungen, die artifizielle Reaktionen wie Schwingungen, die fälschlicherweise zugeschrieben die eigentliche Dynamik des Gerätes führen kann. Positionierung der Drähte an der Unterseite des Ölbehälters mildert dieses Verhalten.
Der biomolekularen Memristor mit seiner derzeitigen Struktur und Design emuliert die kurzfristige synaptische Plastizität, die in den präsynaptischen Terminal auftritt. Es ahmt auch einige der Mechanismen, die präsynaptischen gekoppelten gepulste Erleichterung im Gehirn aufgrund der Ansammlung zu verursachen und die Erschöpfung der Neurotransmitter Vesikel in der präsynaptischen Nervenzelle. Diese Methodik für die Montage der synaptischen Mimik ermöglicht die Studie und Validierung biomimetische Prozesse verantwortlich für viele Arten von kurzfristigen Plastizität und die Optimierung der Modularität und Skalierbarkeit mit anderen Technologien33nicht möglich. Unvorhergesehene Funktionalität kann ermittelt werden, indem entweder Änderung der Membran-Zusammensetzung, die Arten von Ionenkanälen, die in die Membran integriert sind und auch die Anzahl der angeschlossenen Tröpfchen und Grenzflächen Membranen bilden jeweils zwei-terminal Gerät. Als Beispiel haben wir vor kurzem den Onlinelernen Leistungsumfang der biomolekularen Memristor bewiesen, durch mit einem Solid-State-Neuron34Schnittstellen.
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Disclosures
Diese Handschrift hat von UT-Battelle, LLC, unter Vertragsnr. verfasst worden DE-AC0500OR22725 mit dem US-Department of Energy. Behält sich die Regierung der Vereinigten Staaten und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nichtausschließliche eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder zu reproduzieren das veröffentlichte Formular der Diese Handschrift, oder andere zu tun, für die Zwecke der US-Regierung zu ermöglichen.
Acknowledgments
Finanziell unterstützt wurde von der National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Forschung für G.J.T., C.D.S, A.B und C.P.C wurde teilweise vom Labor gerichtet Research and Development Program des Oak Ridge National Laboratory, verwaltet von UT-Battelle, LLC, für das US-Department of Energy gesponsert. Ein Teil dieser Forschung wurde in der Mitte für Anwendungspotential Materialwissenschaften durchgeführt, die eine Damhirschkuh Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage ist.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
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