Summary
Suave, de baja potencia, biomolecular memristores aprovechan similar composición, estructura y cambio de mecanismos de bio-sinapsis. Presentamos un protocolo de arme y caracterizar biomoléculas memristores procede de bicapas de lípidos entre las gotas de agua en el aceite de aislamiento. La incorporación de resultados de péptidos activados por voltaje alamethicin en memristive de conductancia iónica a través de la membrana.
Abstract
La capacidad de recrear funciones sinápticas en elementos de circuito sintético es esencial para sistemas que pretenden emular los poderes cognitivos del cerebro con densidad y eficacia comparable de computación neuromórfica. Hasta la fecha, basada en silicio transistores de tres terminales y dos terminales memristores han sido ampliamente utilizados en circuitos Neuromórficos, en gran parte debido a su capacidad para ubicar memoria y procesamiento de la información. Sin embargo, estos dispositivos no pueden lograr la interconectividad y la complejidad del cerebro porque están hambrientos de poder, no imitan claves funciones sinápticas y sufren de alto nivel de ruido y alta cambio de tensiones. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado y caracterizado un memristor biomolecular que imita la composición, estructura y características de conmutación de sinapsis biológicas. Aquí, describimos el proceso de ensamblaje y caracterización biomolecular memristores consisten en una bicapa lipídica nm de espesor 5 formado entre gotitas de lípido funcionalizados en aceite y dopado con péptidos de alamethicin activado por voltaje. Mientras que los protocolos de montaje similares se han utilizado para investigar las propiedades biofísicas de apoyado de la gotita del lípido membranas y canales iónicos de membrana-limitan, este artículo se centra en modificaciones claves del gota interfaz bicapa método esencial para lograr el desempeño consistente memristor. Específicamente, se describen el proceso de preparación de liposomas y la incorporación de los péptidos alamethicin en las membranas de bicapa lipídica y las concentraciones adecuadas de cada componente, así como su impacto en la respuesta global de los memristores. También detallamos el proceso de caracterización de memristores de biomoléculas, incluyendo medición y análisis de las relaciones de corriente-voltaje de memristive obtenidos mediante voltametría cíclica, así como la plasticidad a corto plazo y el aprendizaje en respuesta a step-wise trenes de pulso de voltaje.
Introduction
Es ampliamente reconocido que las sinapsis biológicas son responsables de la eficacia alta y el enorme paralelismo del cerebro debido a su capacidad para aprender y procesar información de maneras altamente adaptables. Esta funcionalidad coordinada surge de múltiples mecanismos moleculares muy complejos que impulsan tanto plasticidad sináptica a corto plazo y a largo plazo1,2,3,4,5. Sistemas de computación neuromórfica pretenden emular funciones sinápticas en niveles acerca de la densidad, la complejidad y eficiencia de energía del cerebro, que son necesarias para la próxima generación de ordenadores de cerebro-como6,7 , 8. sin embargo, reproducir características sinápticas usando elementos del tradicional circuito electrónico es virtualmente imposible9, que en lugar de otro requieren el diseño y la fabricación de nuevos elementos de hardware que puede adaptarse a las señales entrantes y recuerda información historias9. Estos tipos de hardware inspirado en sinapsis se denominan mem-elementos9,10,11 (elementos de memoria), que, según Di Ventra et al9,11, son pasivos, dispositivos de dos terminales cuya resistencia, capacitancia o inductancia puede reconfigurarse en respuesta a estímulos externos, y que pueden recordar los Estados anteriores11. Para alcanzar niveles de consumo de energía a ésos en el cerebro, estos elementos deben emplear mecanismos de plasticidad sináptica12y materiales similares.
Hasta la fecha, dos-terminal memristores13,14,15 predominante se han construido tecnología complementaria metal-óxido-semiconductor (CMOS), caracterizado por la conmutación de alta tensión y alto nivel de ruido. Esta tecnología no escala por consumo de energía alta y baja densidad. Para hacer frente a estas limitaciones, varios memristores orgánicos y poliméricos se han construido recientemente. Sin embargo, estos dispositivos presentan significativamente más lento conmutación dinámica debido a la difusión de iones lentos a través de una matriz de polímero conductor16,17. Como resultado, los mecanismos por el cual ambos dispositivos memristive basados en CMOS y orgánicos emulan funcionalidad inspirada en sinapsis son altamente fenomenológicos, que abarcan sólo algunas funcionalidades sinápticas como Spike tiempo dependiente plasticidad (STDP) 18, mientras que la otra cuenta que también tienen un papel esencial en hacer del cerebro un ordenador potente y eficaz, tales como plasticidad presináptica, a corto plazo19.
Recientemente, hemos introducido una nueva clase de memristive dispositivos12 con péptidos activados por voltaje incorporados en las membranas de lípidos biomiméticos que imita la composición biomolecular, estructura de la membrana y cambiar de canal activada de iones mecanismos de sinapsis biológica20. Aquí, describimos cómo montar y eléctricamente interrogar estos dispositivos de dos terminales, con enfoque específico en cómo evaluar la plasticidad a corto plazo para la implementación en línea aprender aplicaciones12. Montaje del dispositivo se basa en el método de21 la gota interfaz bicapa (DIB), que se ha utilizado extensivamente en los últimos años para estudiar la biofísica de membranas modelo21 y membrana-limitan ion canales22,23, 24y como bloques de construcción para el desarrollo de materiales responde a estímulos25,26. Describir el proceso de montaje e interrogatorio de membrana en detalle para aquellos interesados en aplicaciones Neuromórficos pero tienen una limitada experiencia en biomateriales o biología de membrana. El protocolo también incluye una descripción completa del procedimiento de caracterización, que es tan importante como el proceso de montaje, dado las dinámicas y reconfigurable características eléctricas del dispositivo27. Los resultados del procedimiento y representante aquí descritos son bases para una nueva clase de bajo costo, bajo consumo, suaves mem-elementos basados en interfaces de lípidos y otras biomoléculas para aplicaciones en computación neuromórfica, estructuras autónomas y sistemas, e incluso interfaces cerebro-computadora adaptable.
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Protocol
1. Generalidades las instrucciones y
- Seleccione el adecuado y en perfecto estado medir/mezclar material de vidrio (matraces, vasos, etc.) y otros materiales de laboratorio (espátulas, cucharones, etc.) para uso.
- Manejar con cuidado para evitar daños en la cristalería y guantes de látex o nitrilo para evitar la contaminación de la cristalería/material de laboratorio con residuos de alcance y para proteger su piel.
- Cristalería/laboratorio solicitada limpio con solución de detergente y agua frotando con un cepillo suave hasta que queden limpias y todos los residuos se eliminan.
- Enjuague bien con agua del grifo y luego con agua desionizada (DI). Lugar en el tendedero al aire seco.
-
Opcional: Lavar la cristalería/material de laboratorio limpio con isopropílico (IPA, 99,5%) y bajo vacío para evaporar todos los IPA residual para asegurar que están libres de cualquier contaminante (2 h). Retire de la cámara de vacío y en ambiente limpio.
Nota: Utilice paños sin pelusas para limpiar la cristalería y material de laboratorio. Comprar y utilizar frascos de vidrio estériles y tubos safe-lock para el almacenamiento de muestra y preparación de materiales. Para obtener más información sobre limpieza de cristalería y otros procedimientos de operación estándar de laboratorio, consulte la base de datos educación ciencia de Zeus28.
2. preparación de solución tampón acuoso
- Usando guantes de látex o nitrilo, seleccione un recipiente de vidrio limpio y apropiado para preparar 50 mL de solución acuosa (500 mM sodio cloruro (KCl), 10 mM 3-(N-morfolino) ácido propanesulfonic (MOPS), pH 7.0).
- Con un balance de masas digital de alta precisión y una espátula limpia, dispensar 1,86378 g de KCl en limpia de papel pesada y luego añadir al contenedor de vidrio.
Nota: Las cantidades de KCl y MOPS deben variar según el volumen deseado y había deseado concentraciones finales. - Pesar 0,10463 g de fregonas y agregar al contenedor de vidrio. Luego, agregar 50 mL de agua desionizada al recipiente de vidrio y vórtice completamente hasta KCl y fregonas se disuelven completamente.
- Almacenar la solución buffer a temperatura ambiente y utilizar cuando sea necesario.
Nota: Mientras que las soluciones tampón se pueden almacenar por períodos relativamente largos de tiempo, se recomienda utilizar soluciones recién preparadas para obtener resultados mejores y más consistentes.
3. preparación de liposomas
Nota: Paso 3.1 sólo se aplica si los fosfolípidos son adquiridos como polvos liofilizados y por lo tanto, se pueden obviar si se compran los fosfolípidos en cloroformo.
- Disolver 5 mg de 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) o lípidos de cerebro Total lípidos extractos (BTLE) en 1 mL de cloroformo en un frasco de vidrio estéril de 5 mL.
- Mientras suavemente se arremolinan, se evapora el cloroformo bajo una corriente suave de nitrógeno seco hasta que quede una película lipídica en la parte inferior del frasco.
- Coloque el frasco que contiene la película de lípidos bajo vacío para 10-12 h permitir la completa eliminación de residual cloroformo.
- Sacar la cubeta de la cámara de vacío y rehidratar la película lipídica mediante la adición de 10 mL de la solución buffer acuosa preparada en el paso 2 para lograr una concentración de lípidos final de 2 mg/mL.
- Congelación (-20 °C) y descongelar completamente la suspensión lipídica seis veces para facilitar el armado de liposomas multilamellar.
Nota: Deje que la mezcla de descongelar a temperatura ambiente, nunca en un ambiente caliente. - Usando un extrusor de disponible en el mercado, sacar la solución liposomada, forzando la suspensión lipídica completa a través de una membrana de pista-graba al agua fuerte de diámetro de poro 0.1 μm. Saca la suspensión 11 veces en sucesión inmediata para obtener propiedades de liposomas con diámetros de c.a. 100 nm necesarios para la formación de monocapa de lípidos adecuados. Guarde la suspensión liposómica a 4 °C y usar dentro de 1 semana de preparación. Por simplicidad, se refieren a la solución resultante de liposomas como "A".
Nota: Para la extrusión de liposomas BTLE, el investigador es a la extrusora a 45-50 °C, por encima de la transición de fase de calentamiento temperatura de lípidos BTLE (~ 37 °C)23,29, para permitir más fácil extrusión. Hidratado el liposoma BTLE suspensiones pueden también ser directamente preparadas (en lugar de congelación y descongelación y extrusión) colocando el frasco suspensión cerrado en un sonicador de baño a 55 °C ~ 15 minutos.
4. reconstitución de péptidos Alamethicin
Nota: Este procedimiento describe el proceso de reconstitución de la alamethicin en liposomas para una concentración final de 1 μM. Esta concentración es suficiente para inducir las corrientes nA-nivel similares a los previamente publicados12. Aumento de la concentración de péptido reducir el umbral de conmutación y aumentar las amplitudes de corrientes inducidas por el voltaje aplicado29.
- Disolver alamethicin péptidos en etanol a una concentración final de 2,5 mg/mL, vortex para mezclar bien y guardar la solución en el congelador (-20 °C).
Nota: Los péptidos Alamethicin se compran generalmente en forma de polvo. - En un tubo de safe-lock de 1,5 mL, mezclar 99 μL de solución "A" con 1 μL de la solución madre alamethicin para lograr una concentración final de alamethicin de 13 μM en la suspensión de liposomas. Vortex para mezclar bien. Se refieren a la solución de liposomas péptido resultante como "B".
- Mezcla 117 μL de solución "A" con 10 μL de solución B para lograr una concentración final de alamethicin de 1 mM y luego vortex para mezclar bien. Se refieren a la solución resultante como "C".
- Almacenar las soluciones '''' de B y C'' ''a 4 °C y uso según sea necesario.
5. preparación del gel de agarosa
- Con un digital, balance de masas de alta precisión y una espátula limpia, agregue 0.5 g de agarosa en polvo a un papel de peso limpio.
- Transferencia pesó agarosa a un vaso de vidrio limpio de 100 mL y agregar 50 mL de agua desionizada a la agarosa.
Nota: Esto producirá una solución de gel de agarosa 1% (peso/vol). - Colocar un imán limpiado mezclar dentro del vaso de vidrio y coloque el vaso en una placa de agitación.
- Removiendo, poner la mezcla a hervir hasta que la agarosa se disuelva completamente.
- Retire el vaso de la placa que deje que la mezcla enfríe a temperatura ambiente. Almacenar a 4 °C y utilizar cuando sea necesario.
- Antes de usar otra vez, volver a derretir la agarosa calentando con una placa caliente o un microondas.
6. fabricación del depósito de aceite
Nota: El procedimiento descrito a continuación es una de las muchas maneras que se puede fabricar un yacimiento de petróleo. El lector se anima a diseñar y fabricar un depósito basado en materiales disponibles, que trabaja a máquina las capacidades y necesidades específicas.
- Con una sierra de banda, corte 12 x 12 x cubo acrílico de 12 mm de una hoja de acrílico gruesa 12 mm más grande.
- Molino de un agujero de 12 mm de diámetro a una profundidad de 8-12 mm en el tubo de acrílico (Figura 1a).
7. preparación de electrodos
- Con unas tijeras, corte dos piezas (75 mm) de hilos de plata (125 μm de diámetro).
- Utilizando una llama abierta más ligero, fundir un extremo de cada alambre de plata de bolitas esféricas forma (alrededor de 250 μm de diámetro).
- Sumerja los extremos de bola en lejía durante 1-2 h para crear una capa de plata cloruro de plata (Ag/AgCl). Un color gris oscuro indica que la capa de Ag/AgCl ha formado (Figura 2a).
- Retirar ambos cables de cloro, enjuague con agua desionizada y coloque a un lado en un paño limpio libre de pelusas.
- Sumergir los extremos de bola en gel de agarosa fundida para crear una capa fina. Esta capa de gel ayuda a anclar las gotitas acuosas en los cables en aceite.
- Usando un cortador de vidrio, dividir un largo de 10 cm, 1/0,58 OD/ID mm vidrio de borosilicate capilar en dos tubos capilares de 5 cm.
- Introduzca uno de los tubos capilares de vidrio en un sostenedor del electrodo (figura 2b, c) y luego de la alimentación entre el alambre de Ag/AgCl en el capilar de vidrio (Figura 2d). Alimentar el otro alambre de Ag/AgCl en el segundo vaso capilar.
- Monte el segundo capilar de vidrio a un titular de una micropipeta de vidrio (figura 2e, f).
8. establecer el experimento
- Coloque un portaobjetos de vidrio de 25 x 75 mm espesor 1 mm sobre la platina de un microscopio invertido (Figura 1a).
- Dispensar unas gotas de aceite de hexadecano en el centro de la diapositiva de cristal y luego coloque el depósito de aceite directamente en el aceite sobre el portaobjetos de cristal.
Nota: Añadir aceite entre el depósito de vidrio deslizante y el aceite se utiliza para que coincida con el índice de refracción del substrato para ofrecer imágenes más claras y más nítidas. - Llene completamente el depósito de aceite con aceite de hexadecano. Asegúrese de que el depósito se coloca sobre el objetivo.
Nota: Otros aceites hidrofóbicas pueden utilizarse también. - Conectar el cable porta electrodo a la headstage de un amplificador de corriente. El headstage debe ser montado en un micromanipulador (Figura 1a) para minimizar la longitud del electrodo y ruido eléctrico.
- Monte el soporte de una micropipeta de vidrio con el segundo hilo de Ag/AgCl en otro instrumental quirúrgico (Figura 1a).
- Uso de los manipuladores, posición de los electrodos tal que la agarosa recubren los extremos de los cables de Ag/AgCl son completamente sumergidos en el depósito de aceite en un plano vertical similar.
- Alinee los dos electrodos y separados por unos pocos milímetros (Figura 1a, b).
Nota: Después de agregar las gotas (descritas en el Paso 13), los cables deben ser traídos todo el camino hasta que las puntas de los electrodos toquen el fondo del depósito de aceite. Este paso garantizará que los cables no oscilan y por lo tanto, reducirá al mínimo las fluctuaciones innecesarias en la corriente medida.
9. adecuada puesta a tierra para reducir el ruido eléctrico
- Crear un bus de tierra roscando un tornillo en la tabla de la vibración donde se coloca el microscopio (figura 3a).
Nota: Utilizando una mesa antivibración es necesaria para minimizar las vibraciones del entorno, que pueden causar fluctuaciones indeseadas en la corriente medida. - Mediante un alambre conductor, conecte el tornillo para una conexión a tierra (figura 3a) y luego conecte la platina del microscopio para el bus de tierra.
- Coloque una jaula de Faraday sobre la configuración experimental para reducir el ruido y luego conectarlo eléctricamente al bus de tierra (figura 3b).
Nota: Es siempre aconsejable para evitar bucles de tierra innecesarios, como puede llevar a un aumento en el nivel de ruido de medición.
10. retroalimentación de control calefacción
- Una shell en el que el depósito de aceite perfectamente caben29de calefacción de aluminio de la máquina.
- Asegúrese de dejar una abertura en la parte inferior de la cáscara para poder ver a través de la cáscara mediante microscopio invertido.
- Coloque un elemento de calefacción flexible de poliamida resistente de 30 x 30 mm por debajo del caparazón de aluminio.
- Colocar una oblea de polidimetilsiloxano (PDMS) aislante debajo de la estufa para reducir pérdida de calor en dirección descendente y proteger la platina del microscopio.
- Inserte un termopar en la fase de aceite. Después de asegurarse de que el termopar no toca o alambre de Ag/AgCl, conecte los cables de termopar para una tarjeta de adquisición de datos de termopar y la temperatura de registro utilizando el software de programación personalizada.
Nota: Escriba un On-Off, proporcional integral (PI) retroalimentación control de temperatura para calefacción y enfriamiento pasivo de la temperatura del aceite a un valor deseado. Los códigos pueden proporcionar a los lectores a petición.
11. configurar el Software y equipos
- Preparar el software de adquisición de datos con encender el ordenador, microscopio, generador de funciones, amplificador de corriente y sistemas de adquisición de datos de bajo nivel de ruido.
Nota: Aunque se puede usar cualquier equipo de detección actual, las siguientes instrucciones son específicamente para que figuran en la Tabla de materiales. Los investigadores que deseen construir su propio amplificador de corriente se pueden referir a Shlyonsky et al.30. - Fuente de medición modo cuadrantes VHOLD/IHOLD y V-CLAMP, respectivamente y en el panel frontal de la abrazadera del remiendo amplificador de corriente, ajustar la pantalla del panel frontal.
- En el panel frontal, establece el paso bajo Filtro de Bessel a 1 kHz y Output Gain en 0.5.
Nota: Elegir una ganancia de salida baja permite registrar amplitudes actuales más grandes, mientras que aumenta el rango de medición de ganancia de sacrificios para reducir el ruido de medición. - Definir la configuración a toda célula β = 1. Este valor puede ser cambiado más adelante a 0.1 para permitir la grabación de las corrientes más grandes de amplitud.
- Establecer todas las demás esferas de control a cero o en una posición neutral.
- Inicializar el software haciendo doble clic en el icono del escritorio.
- Haga clic en configuración de | Digitalizador para abrir el cuadro de diálogo de digitalizador y haga clic en el botón cambiar .
- En el cuadro de diálogo Cambio digitalizador , seleccione el digitalizador apropiado en la lista Tipo de digitalizador .
- Haga clic en el botón Scan para detectar el digitalizador.
- Haga clic en Aceptar para salir del cuadro de diálogo Cambio digitalizador y haga clic en Aceptar para salir de la pantalla del digitalizador .
- Haga clic en Configura | Banco de laboratorio.
- En la ficha de Entrada de señales del Banco de laboratorio, establecer el factor de escala a 0.0005 V/PA.
Nota: Este valor debe ser actualizado si cambian los valores de ganancia o β.
12. pipeta desplazamiento
Nota: El procedimiento descrito a continuación sólo se aplica a amplificador de corriente mencionado en la Tabla de materiales.
- Usando una micropipeta, depositar 200 nL de la solución acuosa de lípidos "A" en los extremos de cada alambre de Ag/AgCl en aceite.
- Poner las gotitas en contacto y presione el botón ZAP en el panel frontal del amplificador al unirse las gotitas en un volumen que abarca ambos electrodos. Esto debe inducir una respuesta del cortocircuito.
- Set de medida de fuente el dial de modo a pista.
- Cambie el selector de pantalla panel frontal Vpista.
- A su vez las Pipetas desplazamiento marcado (en sentido horario o antihorario) hasta el metro Lee 0 mV y es estable.
- Gire el selector de modo de fuente-medición a V-CLAMP y del panel frontal pantalla dial v /Isostenersostener.
13. formación de la bicapa lipídica
- Suelte las gotas que fueron depositadas previamente moviendo los electrodos verticalmente fuera de la fase de aceite. Esto hace que las gotas que caen de los electrodos en el aceite. Vuelve a sumerge y coloque los electrodos en el aceite.
- Usar la micropipeta al depósito 200 nL de solución lipídica "A" en cada uno de los cables.
- Espere 3-5 min permitir el montaje de monocapa lipídica espontánea que se produzca en cada interfase agua/aceite.
Nota: como las formas de monocapa de lípidos, las disminuciones de tensión de superficie de interfaz lípido/agua/aceite, que pueden causar las gotas a caer si el Aceite circundante es lo suficientemente menos denso21. - Baje los electrodos (y gotas) hasta los extremos de dos electrodos apenas toquen el fondo del depósito de aceite (Figura 1b) y luego moverlos horizontalmente para poner las gotitas en contacto.
Nota: La bicapa lipídica se delgada espontáneamente excluyendo el aceite sobrante entre el contacto con las gotitas. Por lo general, este proceso ocurre dentro de 1 minuto.
14. eléctrica caracterización del Biomolecular Memristor
- Formación de Bilayer del lípido
- Para registrar la formación de la bicapa de lípidos, que corresponde a un aumento en la capacitancia eléctrica entre gotas, aplicar a 10 Hz, 10 tensión de forma de onda triangular de mV con un generador de funciones (figura 4) conectado a la entrada exterior de la abrazadera del remiendo amplificador.
Nota: Debido a la naturaleza capacitiva de la membrana de lípidos, la respuesta actual resultante debe ser una forma de onda cuadrada (figura 4). Durante la formación de bicapa lipídica, 11.6 de paso, el investigador debe ver un crecimiento en la amplitud corriente de pico a pico y también observar un cambio visual entre gotas conectados (figura 4).
- Para registrar la formación de la bicapa de lípidos, que corresponde a un aumento en la capacitancia eléctrica entre gotas, aplicar a 10 Hz, 10 tensión de forma de onda triangular de mV con un generador de funciones (figura 4) conectado a la entrada exterior de la abrazadera del remiendo amplificador.
- Medidas de voltaje de corriente
Nota: El memristor biomolecular se modela como una resistencia y un condensador en paralelo12,21. Por lo tanto, la respuesta actual del dispositivo puede contener componentes resistivos y capacitivos dependiendo de la frecuencia de la tensión aplicada. Para el estudio de la naturaleza memristive del dispositivo y obtener el pellizcado relación histéresis de corriente-voltaje12, puede ser necesario restar corriente capacitiva de la corriente total. El protocolo que a continuación describe este procedimiento.- Mediante un generador de funciones, aplicar una forma de onda de voltaje (triangular o sinusoidal) a una membrana de lípidos libres alamethicin montada con gotas de solución "A".
- Registrar la respuesta corriente inducida a través de múltiples frecuencias.
Nota: Las corrientes capacitivas se reducen al mínimo a frecuencias por debajo de 10 mHz. - Registre el tamaño de la bicapa lipídica interfacial midiendo el diámetro de la membrana lipídica en computadora, o mediante el registro de la amplitud de pico a pico actual resultante de 10 Hz, onda triangular de 10 mV. La amplitud de la corriente es proporcional a la capacitancia de la membrana, que a su vez es proporcional al área de la membrana.
- Quitar las gotitas que no contienen alamethicin.
- Añadir nuevas gotitas acuosas utilizando solución "C" y forman una bicapa lipídica.
- Utilice los micromanipuladores para ajustar el contacto entre las gotitas que la bicapa tiene un área similar (diámetro o cuadrado-agita amplitud actual) como el formado antes.
- Repita los pasos 14.2.1 y 14.2.2.
- Reste paso registrado en actual 14.2.2 del actual en paso 14.2.7.
- Parcela la corriente inducida versus tensión aplicada para cada frecuencia y forma de onda para obtener la respuesta de memristive "histéresis pinchado".
- Experimentos de pulso
- Utilizando un software de programación personalizada y fuente de voltaje analógico, generan pulsos de voltaje con amplitudes específicas de altas y bajas, el tiempo y el tiempo.
Nota: Esto no es necesario si los pulsos de voltaje podrían generarse utilizando un generador de función comercial. - Registro de la corriente en respuesta a los pulsos aplicados.
- Debido a la naturaleza capacitiva del memristor, se registrarán puntos capacitivos. Quitar puntas aplicando un filtro de paso bajo con ancho de banda adecuado.
- Utilizando un software de programación personalizada y fuente de voltaje analógico, generan pulsos de voltaje con amplitudes específicas de altas y bajas, el tiempo y el tiempo.
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Representative Results
Figura 1 muestra el montaje experimental utilizado para montar y para caracterizar el memristor biomolecular. Bajar los extremos libres de los electrodos en la parte inferior del depósito de aceite, como se muestra en la Figura 1b, se encontraron útil para minimizar las vibraciones de los electrodos y las gotas que pueden resultar en variaciones en medida corriente y bicapa, especialmente en casos donde el aceite de calefacción puede generar flujo convectivo en el aceite. La figura 2 muestra el procedimiento y resultado del montaje de los cables de Ag/AgCl, tubos capilares de la clase y sostenedores de electrodo y micropipeta. La configuración se encuentra dentro de una jaula de Faraday debidamente conectado a tierra (figura 3) para minimizar la interferencia electromagnética.
Es imprescindible para formar un establo, aislante bicapa lipídica para este estudio. En el presente Protocolo, una monocapa de lípidos monta en las interfaces del aceite/de agua de las gotitas acuosas inmersas en aceite. Al contacto entre las gotas, se excluye el exceso de aceite, y las oposición monocapas de lípidos delgada a una bicapa lipídica gruesa de 5 nm. La técnica más común utilizada en electrofisiología de la bicapa es abrazadera de tensión, donde se controla el voltaje a través de la bicapa y se mide la corriente inducida. Figura 4a muestra la corriente capacitiva de la onda cuadrada inducida por un de 10 mV, voltaje de 10 Hz durante la formación de la bicapa. Mientras la amplitud aumenta al comienzo bicapa adelgazamiento y posterior expansión radial de la membrana adelgazada, la forma de onda es cuadrada. Utilizando la amplitud estacionaria de corriente de onda cuadrada, el área nominal de la bicapa lipídica se puede calcular utilizando un valor predeterminado de la capacitancia de membrana específicos para un bicapa de DPhPC21. Además, el área de la bicapa puede evaluarse visualmente por la medida del diámetro de dos capas de una imagen tomada con el microscopio Figura 4b. Para los cálculos de área bicapa lipídica precisa, el lector debe referirse a Taylor, et al.21. El área de la bicapa lipídica puede ajustarse cambiando la posición relativa de las gotas21,31.
A solicitud de un sesgo de voltaje a una bicapa de lípidos libres de alamethicin, la actual respuesta variará según la frecuencia de la tensión de entrada. A bajas frecuencias (< 10-50 mHz), donde la resistencia de la bicapa domina la impedancia compleja, la respuesta corriente resistiva es despreciable debido a la resistencia de membrana nominal es mayor a 10 GΩ. A medida que aumenta la frecuencia de entrada, la capacitancia de la membrana contribuye más a la impedancia del sistema, dando por resultado la respuesta actual de cero aparece en la trama de corriente versus voltaje en la figura 5a. Cuando la misma entrada de forma de onda de tensión (150 mV) se aplica a una respuesta de biomolecular que consta de una membrana de lípidos alamethicin dopado, y cuando la amplitud de la tensión supera un umbral crítico de la inserción (~ 100 mV por una membrana DPhPC a temperatura ambiente), péptidos alamethicin que residen en la superficie de la bicapa lipídica Inserte en la membrana y agregan a poros conductores forma. La formación de umbral dependiente de los canales iónicos produce una respuesta corriente macroscópica no lineal, con el aumento exponencial de corrientes con tensiones mayores que el umbral de inserción (figura 5b). Mientras que los péptidos alamethicin son conocidos por formulario de rectificación de canales iónicos sólo en voltajes suficientemente positivos, el carácter simétrico de estas respuestas actuales en ambas polaridades es debido a la inserción y la agregación de poblaciones separadas de péptidos, cada uno de enfrente de lados de la membrana. Dependiendo de la frecuencia de la tensión aplicada, la respuesta corriente inducida también puede contener las contribuciones de la corriente capacitiva. Por lo tanto, la corriente capacitiva en la figura 5a se debe restarse de la total actual mostrada en la figura 5b para obtener sólo el memristive pellizcada histéresis corriente-tensión respuesta, muestra en la figura 5 c, d.
Figura 6 muestra la respuesta de conmutación dinámica de un memristor de biomoléculas inducida por un tren de pulsos de tensión (130 MT (alto), 20 mV (bajo), 100 ms (encendido), 20 ms (apagado)). La tensión OFF es elegida para ser 20 mV a diferenciar el regreso del equipo a un estado de aislamiento como alamethicin canales salen la bicapa algo actual simplemente desapareciendo en la entrada de voltaje cero. El aumento acumulativo en estado ON corriente en pulsos de voltaje sucesivas representa emparejado-pulsada facilitación, una plasticidad que biomolecular volátiles memristores son capaces de exhibir12.
Figura 1: Montaje experimental y principales partes. (a) la estación de trabajo estándar para el montaje y caracterización el memristor biomolecular incluye un microscopio invertido, 3 ejes micromanipuladores, una cámara digital, una tabla de aislamiento de vibración, un sostenedor de electrodo, titular de una micropipeta de vidrio, un amplificador de corriente, un generador de funciones y un yacimiento de petróleo. La instalación está montada en la etapa del microscopio como se describe en los pasos 11-13. (b) una fotografía ampliada de la configuración de las puntas de los cables de Ag/AgCl tocando el fondo del embalse de aceite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de preparación del electrodo. Fotografías: (a) la plata hilos remojo en lejía; (b) un portaelectrodos; (c) un 5 cm largo un capilar de vidrio conectado al cable porta electrodo; (d) un Ag/AgCl electrodo alimentado a través del vidrio capilar; (e) un soporte de una micropipeta de vidrio; y (f) completamente montados los electrodos y los titulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento de puesta a tierra. Fotografías: (a) un tornillo roscado en la superficie de mesa de aislamiento de vibración para crear un bus de tierra cuando se conecta a tierra; y (b) un laboratorio hecho Faraday jaula que cubre la configuración de depósito y electrodo de aceite a la medida de interferencias electromagnéticas. La jaula y el microscopio de fase están atados al suelo del autobús por medio de cables I y II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medidas de corriente en tiempo real muestran crecimiento de adelgazamiento y areal bicapa inicial. (a) la actual medida (arriba) durante la formación espontánea de la bicapa entre revestimiento lípido gotitas en respuesta a una tensión de forma de onda triangular. La magnitud de la corriente medida es directamente proporcional a la capacitancia de la interfaz y por lo tanto, el área de la bicapa. El área de la interfaz se puede variar cambiando la distancia entre los dos electrodos de gota-cojinete. (b) una imagen adquiridos a través de la muestra en el microscopio invertido una vista inferior y las dimensiones de un memristor biomolecular basada en membrana típica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Relación tensión corriente e histéresis pellizcados. (a) la tensión de corriente las respuestas de una bicapa de lipídica DPhPC libre de alamethicin. Una membrana lipídica sólo es altamente aislante (~ 10 GΩ), que explica la baja respuesta actual óhmica a 0,017 Hz, una frecuencia donde la impedancia es dominada por la resistencia de la membrana. En frecuencias más altas, la capacitancia de la membrana contribuye más significativamente a la impedancia total de la interfaz, dando por resultado una corriente capacitiva inducida de cero. (b) las relaciones de corriente-tensión dinámicas versus la frecuencia de una bicapa lipídica forman entre dos gotitas que contienen péptidos alamethicin (obtenidos con una onda triangular de entrada). (c) el memristive, pellizcado histéresis respuesta actual del dispositivo se obtiene restando la corriente capacitiva en un de la corriente total en b. (d) zoom en resaltar las diferencias entre el total y las corrientes memristive. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Respuesta de los memristores biomolecular a impulsos rectangular de tensión y plasticidad. El dispositivo responde a impulsos de tensión posterior con un aumento en la conductancia durante el tiempo de ON, a pesar de la intermitente restaurar un estado de aislamiento durante cada tiempo de apagado. El aumento en la corriente de pulso a pulso se muestra que la conductancia instantánea del dispositivo es una función del estímulo presente y estímulos anteriores, análogos a la plasticidad a corto plazo en bio-sinapsis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este papel presenta un protocolo para el montaje y caracterización biomolecular memristores basado en ion dopado canal sintético biomembranas formadas entre dos gotas de agua en aceite. El dispositivo soft-materia, dos terminales está diseñado y estudiado para: 1) superar las limitaciones que se asocian con tecnología de estado sólido, tales como alto ruido, consumo de alta energía y conmutación de alto voltajes, 2) más de cerca imitan la composición, estructuran cambiar mecanismos de sinapsis biológicas y 3) explorar los mecanismos y características de plasticidad de bio-sinapsis que no son dispositivos de estado sólidos.
La gota interfaz bicapa técnica21, que representa el bloque de construcción de la actual tecnología12, es un enfoque simple y modular para el montaje de la membrana que se ha utilizado ampliamente para estudiar la biofísica de la membrana21, proteínas22, ion canales29y otras biomoléculas32. Ofrece ventajas específicas para precisamente controlar y cuestionar las membranas modelo y representa un bloque de construcción para materiales de estímulos sensibles y autónomos26. Se han desarrollado múltiples métodos de montar bicapas de interfaz de gota, incluyendo el colgante gota método21 que fue adaptado como el método principal para desarrollar y caracterizar el memristor biomolecular. Aunque esta técnica de montaje de la membrana fue utilizada en estudios anteriores, aquí presentamos un minucioso protocolo que permite a los investigadores recrear y estudiar memristive bicapas de interfaz de gota en sus propios laboratorios. El protocolo está escrito específicamente en forma para permitir que los investigadores en los campos de la biología de membrana no, como la comunidad neuromórfica, entender y recrear estos procedimientos.
En su forma más simple, el protocolo que hemos descrito en este documento para la evaluación de funciones de memristive de una biomembrana se puede replicar con equipo de laboratorio básico como un generador de funciones, un microscopio y un sistema de medición actual. El dispositivo montado es eléctricamente equivalente a una resistencia (~ 10 GΩ) y un condensador en paralelo. En presencia de péptidos, como alamethicin, que son capaces de formar poros dependientes de voltaje en la membrana, la resistencia de la membrana disminuye significativamente, y corriente resistiva puede ser detectada en respuesta a señales de voltaje (DC o AC) de entrada. Sin embargo, la resistencia de membrana grande y dependiente de la frecuencia Impedancia eléctrica del dispositivo significan que: 1) inducida por las corrientes son pequeñas (pA-nA) y sujeto a la interferencia electromagnética; y 2) debe tener cuidado para inducir con precisión y medir las propiedades de la memristive deseada aparte de las respuestas de membrana capacitiva, respectivamente. En respuesta a una tensión de CA y dependiendo de la frecuencia de la señal, la corriente registrada contendrá componentes capacitivos y resistivos. Para lograr la histéresis pinchada, que es una firma de memristive dispositivo, hay que seguir el protocolo descrito en el paso 14. Los cables de suspensión son susceptibles a las vibraciones, que pueden resultar en respuestas artefactuales como oscilaciones erróneamente atribuidas a la dinámica real del dispositivo. Este comportamiento mejora la colocación de los cables en la parte inferior del depósito de aceite.
El memristor biomolecular con su estructura actual y su diseño emula la plasticidad sináptica a corto plazo que se produce en la terminal presináptica. También imita algunos de los mecanismos que causan presináptica facilitación pulsada emparejado en el cerebro debido a la acumulación y depleción de las vesículas de neurotransmisor en la neurona presináptica. Esta metodología para montar el imitadores sinápticos permite el estudio y validación de procesos biomiméticos responsables de muchos tipos de plasticidad a corto plazo y la optimización de la modularidad y la escalabilidad no es posible con otras tecnologías33. Funcionalidad imprevista puede descubrir modificando la composición de la membrana, los tipos de canales iónicos que se incorporan a la membrana e incluso el número de gotitas conectadas y membranas interfaciales que constituyen cada terminal dos dispositivo. Por ejemplo, recientemente hemos demostrado las capacidades de aprendizaje en línea del memristor biomolecular por conexión con un estado sólido neurona34.
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Disclosures
Este manuscrito ha sido publicado por UT-Battelle, LLC, bajo contrato no. DE-AC0500OR22725 con el Departamento de energía de Estados Unidos. El gobierno de Estados Unidos retiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno de Estados Unidos mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, mundial para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito, o permitir que otros lo hagan, a los fines del gobierno de Estados Unidos.
Acknowledgments
Ayuda financiera fue proporcionada por la nacional Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Investigación para G.J.T., MaMBeRoS, A.B., y C.P.C. fue parcialmente patrocinado por el laboratorio de investigación dirigida y desarrollo programa de Oak Ridge National Laboratory, dirigido por UT-Battelle, LLC, para el Departamento de energía de Estados Unidos. Una parte de esta investigación se llevó a cabo en el centro de Ciencias de materiales Nanophase, que es un DOE de ciencia usuario oficina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
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