Summary
Macio, baixo consumo de energia, biomolecular memristors alavancar semelhante composição, estrutura e mecanismos de bio-sinapses de comutação. Apresentado aqui é um protocolo para montar e caracterizar biomolecular memristors obtido de isolamento bilayers do lipid formadas entre as gotículas de água em óleo. A incorporação dos resultados de peptídeos alamethicin tensão-ativado em memristive de condutância iônica através da membrana.
Abstract
A capacidade de recriar funcionalidades sinápticas em elementos de circuito sintético é essencial para neuromorphic computação sistemas que procuram imitar os poderes cognitivos do cérebro com densidade e eficiência comparável. Até à data, transistores de três terminais à base de silicone e dois terminais memristors foram amplamente utilizados em circuitos de neuromorphic, em grande parte devido à sua capacidade de co-localização memória e processamento de informações. No entanto, esses dispositivos não podem atingir a interconectividade e a complexidade do cérebro, porque eles são poder-com fome, não conseguem imitar chaves funcionalidades sinápticas e sofrem de ruído elevado e alta comutação de tensões. Para superar essas limitações, temos desenvolvido e caracterizado um memristor biomolecular que imita a composição, estrutura e características de comutação das sinapses biológicas. Aqui, descrevemos o processo de montagem e caracterização biomolecular memristors consistindo de uma lipídica 5 nm de espessura formada entre as gotas de água acrescida de lipídios em óleo e dopado com peptídeos alamethicin tensão-ativado. Enquanto protocolos de montagem semelhantes têm sido usados para investigar as propriedades biofísicas de membranas compatíveis com gotículas lipídicas e canais iônicos de membrana-limite, este artigo centra-se na chaves modificações de método da bicamada de interface da gota essencial para atingir o desempenho consistente do memristor. Especificamente, descrevemos o processo de preparação de lipossomas e a incorporação de peptídeos de alamethicin em membranas de bicamada lipídica e as concentrações adequadas de cada constituinte, bem como seu impacto sobre a resposta global dos memristors. Também detalhamos o processo de caracterização de memristors biomolecular, incluindo medição e análise das relações de corrente-tensão de memristive obtidos via voltametria cíclica, bem como a curto prazo plasticidade e aprendizagem em resposta a step-wise trens de pulso de tensão.
Introduction
É amplamente reconhecido que as sinapses biológicas são responsáveis pela alta eficiência e paralelismo enorme do cérebro devido à sua capacidade de aprender e processar informações de formas altamente adaptáveis. Essa funcionalidade coordenada emerge múltiplas, mecanismos moleculares altamente complexos que conduzem ambos plasticidade sináptica a curto e a longo prazo1,2,3,4,5. Sistemas de computação Neuromorphic visam emular as funcionalidades sinápticas em níveis próximos a densidade, complexidade e eficiência de energia do cérebro, que são necessários para a próxima geração de computadores, como cérebro6,7 , 8. no entanto, reproduzir características sinápticas, usando elementos de circuito eletrônico tradicional é virtualmente impossível9, em vez disso, exigir que o projeto e fabricação de novos elementos de hardware que pode adaptar-se a sinais de entrada e lembre-se histórias de informações9. Estes tipos de hardware de inspiração sinapse são conhecidos como elementos de mem-9,10,11 (elementos de abreviação de memória), que, de acordo com Di Ventra et al.9,11, são passivos, dispositivos de dois terminais cuja resistência, capacitância ou indutância pode ser reconfigurada em resposta a estímulos externos, e que me lembro de Estados anteriores11. Para atingir os níveis de consumo de energia se aproximando aqueles no cérebro, estes elementos devem empregar materiais e mecanismos de plasticidade sináptica12semelhantes.
Até à data, dois terminais memristors13,14,15 predominantemente foram construídos usando tecnologia de (CMOS) metal-óxido-semicondutor complementar, caracterizada pela alternância de alta tensões e ruído elevado. Esta tecnologia não se adapta bem devido ao consumo de energia de alta e baixa densidade. Para lidar com essas limitações, vários orgânicos e poliméricos memristors foram recentemente construídos. No entanto, esses dispositivos apresentam dinâmica switching significativamente mais lento devido à difusão do íon demorado através de uma matriz de polímero condutor16,17. Como resultado, os mecanismos pelo qual ambos os dispositivos baseados em CMOS e orgânicos memristive emulam sinapse-inspirado funcionalidades são altamente fenomenológicos, abrangendo apenas algumas funcionalidades sinápticas como Spike temporização dependente plasticidade (STDP) 18, enquanto com vista para outra chave que apresenta também desempenham papéis essenciais na tomada o cérebro de um computador poderoso e eficiente, como plasticidade pré-sinápticos, a curto prazo19.
Recentemente, nós introduzimos uma nova classe de memristive dispositivos12 com peptídeos ativado voltagem incorporados em membranas de lipídios biomimético que imita a composição biomolecular, a estrutura da membrana e íon canal acionado comutação mecanismos de sinapses biológicas20. Aqui, descrevemos como montar e eletricamente interrogar estes dispositivos de dois terminais, com foco específico sobre como avaliar a plasticidade a curto prazo para implementação em on-line de aprendizagem aplicações12. Montagem do dispositivo é baseada no método da gota interface BICAMADA (DIB)21 , que tem sido amplamente utilizado nos últimos anos para estudar a Biofísica de membranas de modelo21 e de22,de canais de íon de membrana-limite23, 24e como blocos de construção para o desenvolvimento de materiais sensíveis estímulos25,26. Podemos descrever o processo de montagem e interrogatório de membrana em detalhes para aqueles interessados em aplicações de neuromorphic mas experiência em biomateriais ou membrana biologia limitada. O protocolo também inclui uma descrição completa do processo de caracterização, que é tão importante quanto o processo de montagem, dado as dinâmicas e reconfiguráveis Propriedades elétricas do dispositivo27. Os procedimento e representante resultados aqui descritos são bases para uma nova classe de baixo custo, baixo consumo de energia, macios mem-elementos com base em interfaces de lipídios e outras biomoléculas para aplicações em computação neuromorphic, estruturas autónomas e sistemas, e até mesmo interfaces cérebro-computador adaptável.
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Protocol
1. precauções e instruções gerais
- Selecione o apropriado, sem danos de medição/mistura vidro (frascos, copos, etc.) e outros materiais de laboratório (espátulas, colheres, etc.) para uso.
- Lidar com produtos vidreiros cuidadosamente para evitar danificar e usar luvas de látex ou nitrilo para não poluir a vidraria/material de laboratório com resíduos dos dedos e para proteger sua pele.
- Limpa vidro/labware escolhido cuidadosamente usando solução detergente e água, esfregando com uma escova macia garrafa até limpo e todos os resíduos são removidos.
- Enxágue com água da torneira e depois com água desionizada (DI). Lugar no cavalete ao ar seco.
-
Opcional: Lave o vidro limpo/labware com isopropílico (IPA, 99,5%) e coloque sob vácuo para evaporar todos IPA residual para garantir que eles sejam isentos de contaminantes (~ 2 h). Remova a câmara de vácuo e coloque em ambiente limpo.
Nota: Utilize toalhetes de fiapos para limpar o vidro e materiais de laboratório. Comprar e usar frascos de vidro pequeno estéril e tubos de bloqueio de segurança para o armazenamento de materiais de preparação e amostra. Para mais detalhes sobre a limpeza de vidraria e outros procedimentos operacionais padrão de laboratório, referir-se a JoVE ciência educação de banco de dados,28.
2. preparação da solução-tampão aquosa
- Usando luvas de látex ou nitrilo, selecione um recipiente de vidro limpo e adequado para preparar 50 mL de tampão aquosa (500 mM de cloreto de sódio (KCl), 10 mM 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS), pH 7,0).
- Usando um balanço de massa digital, alta precisão e uma espátula limpa, dispense a 1,86378 g de KCl em papel de pesagem limpo e em seguida, adicione o recipiente de vidro.
Nota: As quantidades de KCl e MOPS devem variar dependendo do volume desejado e desejado concentrações finais. - Pesar 0,10463 g de MOPS e adicionar para o recipiente de vidro. Em seguida, adicione 50 mL de água Desionizada para o recipiente de vidro e vórtice completamente até KCl e MOPS são completamente dissolvidos.
- Armazenar a solução-tampão à temperatura ambiente e usar quando necessário.
Nota: Enquanto soluções tampão podem ser armazenadas por períodos relativamente longos de tempo, é recomendável usar soluções tampão preparadas para resultados melhores e mais consistentes.
3. preparação de lipossomas
Nota: Passo 3.1 só se aplica se os fosfolípidos são adquiridos como pó liofilizado e portanto, podem ser ignorados se os fosfolípidos são comprados em clorofórmio.
- Dissolva 5 mg de 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) ou lipídios cérebro Total lipídios extrai (BTLE) em 1 mL de clorofórmio em um frasco de vidro estéril 5 mL.
- Enquanto rodando suavemente, evapore o clorofórmio sob uma ligeira corrente de nitrogênio seco até um filme lipídico permanece na parte inferior do frasco.
- Coloque o frasco que contém o filme lipídico sob vácuo para 10-12 h permitir a completa remoção de residual clorofórmio.
- Retirar o frasco da câmara de vácuo e Re-hidratar o filme lipídico, adicionando 10 mL da solução-tampão aquosa preparada na etapa 2 para obter uma concentração final de lipídios de 2 mg/mL.
- Congelamento (-20 °C) e descongelar completamente a suspensão lipídico seis vezes para facilitar a montagem multilamellar em lipossomas.
Nota: Deixe a mistura descongelar à temperatura ambiente, nunca em um ambiente aquecido. - Utilizando uma extrusora comercialmente disponível, extrude a solução em lipossomas, forçando a suspensão lipídico completo através de uma membrana gravadas a faixa de diâmetro dos poros 0.1 μm. EXTRUDE a suspensão 11 vezes em sucessão imediata para obter unilamellar lipossomas com diâmetros de c.a. 100 nm, necessários para a formação de monocamada lipídico adequado. Armazenar a suspensão de lipossomas a 4 °C e usar dentro de 1 semana de preparação. Para simplificar, referir-se a solução resultante de lipossomas como "A".
Nota: Para a extrusão de lipossomas BTLE, o pesquisador é encorajado a extrusora de 45-50 °C, superior a transição da fase de aquecimento temperatura de lipídios BTLE (~ 37 °C)23,29, para permitir mais fácil extrusão. Hidratado em lipossomas BTLE suspensões podem também ser diretamente preparadas (no lugar de congelamento-descongelamento e extrusão), colocando o frasco de suspensão fechado em um sonicador de banho a 55 °C para ~ 15 min.
4. reconstituição de peptídeos de Alamethicin
Nota: Este procedimento descreve o processo de reconstituição de alamethicin em lipossomas para uma concentração final de 1 μM. Esta concentração é suficiente para induzir correntes at-nível semelhantes daqueles previamente publicado12. Aumentando a concentração de peptídeo irá reduzir o limiar de comutação e aumentar as amplitudes das correntes induzidas pela tensão aplicada29.
- Dissolver alamethicin peptídeos em etanol a uma concentração final de 2,5 mg/mL, vórtice brevemente para misturar bem e armazenar a solução estoque no freezer (-20 °C).
Nota: Alamethicin peptídeos são geralmente comprados em forma de pó. - Em um tubo de segurança-bloqueio de 1,5 mL, misture 99 μL da solução "A" com 1 μL de solução de alamethicin para obter uma concentração final de alamethicin de 13 μM na suspensão de lipossomas. Vórtice para misturar bem. Referir-se a solução resultante de peptídeo-lipossoma como "B".
- Mix 117 μL da solução "A" com 10 μL de solução B para obter uma concentração final de alamethicin de 1 mM e em seguida vórtice para misturar bem. Referir-se a solução resultante como "C".
- Armazenar as soluções 'B '' e ' 'C' a 4 °C e uso como necessário.
5. preparação do gel do Agarose
- Usando um balanço de massa digital, alta precisão e uma espátula limpa, adicione 0,5 g de agarose em pó para um papel de pesagem limpo.
- Transferência pesava agarose para um copo de vidro limpo de 100 mL e adicionar 50 mL de água Desionizada para o agarose.
Nota: Isto irá produzir uma solução de gel de agarose 1% (wt/vol). - Coloque um imã de agitação limpo dentro do copo de vidro e colocar o copo sobre um prato quente mexendo.
- Agitação, leve a mistura para ferver até agarose é completamente dissolvido.
- Retire o copo da chapa quente deixe a mistura esfriar a temperatura ambiente. Armazenar a 4 °C e usar quando necessário.
- Antes de usar novamente, re-derreta o agarose por aquecimento com uma placa quente ou microondas.
6. fabricação do reservatório de óleo
Nota: O procedimento descrito abaixo é apenas uma das muitas maneiras que um reservatório de óleo pode ser forjado. O leitor é encorajado a projetar e fabricar um reservatório com base em materiais disponíveis, capacidades e necessidades específicas de usinagem.
- Usando uma serra de fita, corte um 12 x 12 x 12 mm acrílico cube de uma folha de acrílico grosso de maior 12 mm.
- Moinho de um furo de diâmetro de 12 mm até uma profundidade de 8-12 mm no tubo de acrílico (Figura 1a).
7. preparação de eletrodos
- Com uma tesoura, corte duas peças (75 mm) de fios de prata (125 μm de diâmetro).
- Usando uma chamas isqueiro, derreta uma extremidade de cada fio de prata que forma esférica bolinhas (cerca de 250 μm de diâmetro).
- Mergulhe as extremidades da bola na água sanitária para 1-2 h criar um revestimento de prata-cloreto de prata (Ag/AgCl). Uma cor cinza escura indica que o revestimento de Ag/AgCl formou (Figura 2a).
- Remover os dois fios de água sanitária, enxaguar abundantemente com água e coloque de lado em uma limpeza limpa fiapos.
- Mergulhe as extremidades da bola em gel de agarose derretido para criar uma camada fina. Este revestimento de gel ajuda a ancorar as gotas aquosas para os fios sob óleo.
- Usando um cortador de vidro, dividir uma longa de 10 cm, 1/0,58 milímetros OD/ID vidro borosilicato capilar em dois capilares de 5 cm.
- Insira um dos capilares de vidro em um eléctrodo (Figura 2b, c) e então alimentar dentre o fio de Ag/AgCl para o capilar de vidro (Figura 2d). Alimente o outro fio de Ag/AgCl no segundo capilar de vidro.
- Monte o segundo capilar de vidro para um suporte de micropipeta de vidro (Figura 2e, f).
8. configuração da experiência
- Coloque uma lâmina de vidro 1mm grosso, 25 x 75 mm no palco de um microscópio invertido (Figura 1a).
- Distribuir algumas gotas de óleo de hexadecano para o centro da lâmina de vidro e em seguida coloque o reservatório de óleo diretamente sobre o óleo sobre a lâmina de vidro.
Nota: Adição de óleo entre o reservatório de slide e óleo de vidro é usado para coincidir com o índice de refração do substrato para fornecer imagens mais claras e mais nítidas. - Preencha completamente o reservatório de óleo com óleo de hexadecano. Certifique-se que o reservatório está posicionado acima da lente objetiva.
Nota: Outros óleos hidrofóbicos podem ser usados também. - Ligue o porta-eletrodo para o headstage de um amplificador de corrente. O headstage deve ser montado em um micromanipulador (Figura 1a) para minimizar o comprimento do eletrodo e do ruído elétrico.
- Monte o suporte de micropipeta de vidro com o segundo fio de Ag/AgCl até outro micromanipulador (Figura 1a).
- Usando os manipuladores, a posição dos eléctrodos tal que a agarose revestidos dicas dos fios Ag/AgCl são completamente submersa no reservatório de óleo em um plano vertical semelhante.
- Alinhe os dois eletrodos e separá-los por alguns milímetros (Figura 1a, b).
Nota: Depois de adicionar as gotas (descritas no passo 13), os fios devem ser derrubados todo o caminho até as pontas de eletrodo são tocar no fundo do reservatório de óleo. Esta etapa irá garantir que os fios não oscilar e assim, irão minimizar flutuações desnecessárias na corrente medida.
9. adequada para reduzir o ruído elétrico de aterramento
- Crie uma barra rosqueando um parafuso antivibração na tabela em que o microscópio é colocado (Figura 3a).
Nota: Usar uma tabela de antivibração é necessária para minimizar as vibrações no entorno, que podem causar flutuações indesejáveis na corrente medido. - Usando um fio condutor, conecte o parafuso a um aterramento (Figura 3a) e em seguida, conecte o palco do microscópio para o ônibus de chão.
- Coloque uma gaiola de Faraday sobre a instalação experimental para reduzir o ruído e eletricamente Conecte-o ao chão de ônibus (Figura 3b).
Nota: Sempre é recomendável para evitar loops de terra desnecessárias, como eles podem levar a um aumento no nível de ruído de medição.
10. feedback controlado de aquecimento
- Um escudo em que o reservatório de óleo cabem confortavelmente29de aquecimento de alumínio da máquina.
- Certifique-se de deixar uma abertura na parte inferior do reservatório para que consigas ver através do shell através do microscópio invertido.
- Coloca um elemento de aquecimento flexível de poliimida resistivo de 30 x 30 mm por baixo do escudo de alumínio.
- Coloca uma isolante da bolacha polydimethylsiloxane (PDMS) abaixo do aquecedor para diminuir a perda de calor no sentido descendente e proteger o palco do microscópio.
- Insira um termopar na fase óleo. Depois de certificar-se de que o termopar não toca qualquer fio de Ag/AgCl, ligue os fios do termopar a uma placa de aquisição de dados de termopar e registro da temperatura usando o software de programação personalizado.
Nota: Escreva um On-Off, proporcional integral (PI) temperatura controle de gabarito para habilitar o aquecimento e arrefecimento passivo da temperatura do óleo para um valor desejado. Os códigos podem ser fornecidos aos leitores a pedido.
11. Configurando o Software e equipamento
- Prepare o software de aquisição de dados, ligar o computador (es), microscópio, gerador de função, amplificador atual e sistemas de aquisição de dados de baixo ruído.
Nota: Enquanto qualquer equipamento de sensoriamento atual pode ser usado, as instruções a seguir são específicas para o um listado na Tabela de materiais. Pesquisadores que desejam construir seu próprio amplificador atual podem se referir a Shlyonsky et al.30. - No painel frontal da mordaça remendo amplificador atual, defina o visor frontal e fonte-medição modo disca para VHOLD/APERTOCONTROL e V-braçadeira, respectivamente.
- No painel frontal, defina o Lowpass , Filtro de Bessel de 1 kHz e Saída ganhar a 0,5.
Nota: Escolhendo um ganho de saída baixa permite gravação maiores amplitudes atuais superiores, Considerando que aumentando a ganho de faixa de medição de sacrifícios para reduzir o ruído de medição. - Definir a configuração toda célula β = 1. Esse valor pode ser mudado mais tarde para 0.1 para permitir a gravação das correntes de amplitude maiores.
- Defina todos os outros botões de controle como zero ou em uma posição neutra.
- Inicialize o software clicando duas vezes no ícone da área de trabalho.
- Clique em configuração de | Digitalizador para abrir a caixa de diálogo do digitalizador e, em seguida, clique no botão alterar .
- Na caixa de diálogo Alterar digitalizador , selecione o digitalizador apropriado na lista de Tipo de digitalizador .
- Clique no botão digitalizar para detectar o digitalizador.
- Clique Okey para sair da caixa de diálogo Alterar digitalizador e clique Okey para sair da caixa de diálogo do digitalizador .
- Clique ConFigura | Bancada de laboratório.
- Na aba de Sinais de entrada do Banco de laboratório, definir o fator de escala para 0,0005 V/PA.
Nota: Esse valor deve ser atualizado, se os valores de ganho ou β são alterados.
12. pipeta deslocamento
Nota: O procedimento descrito abaixo aplica-se somente ao amplificador atual mencionado na Tabela de materiais.
- Utilizando uma micropipeta, deposite 200 nL da solução aquosa de lipídios "A" para as extremidades de cada fio de Ag/AgCl sob o óleo.
- Trazer as gotas em contato e pressione o botão ZAP no painel frontal do amplificador a coalescer as gotas em um volume, abrangendo os dois eléctrodos. Isto deve induzir uma resposta de curto-circuito.
- Dial de modo conjunto fonte-medição de faixa.
- Altere o mostrador do visor do painel frontal para VTRACK.
- Rode o PIPETTER OFFSET discar (no sentido horário ou no sentido anti-horário) até medidor 0 mV e está estável.
- Retornar o selector de modo de fonte-medição de V-braçadeira e painel frontal Exibir seletor de V/iHOLDsegurar.
13. formação da bicamada lipídica
- Libere as gotas que anteriormente foram depositadas, movendo os eléctrodos verticalmente fora da fase de óleo. Isso faz com que as gotas a cair de eletrodos para o petróleo. Re-submergir e posicionar os eletrodos no óleo.
- Use a micropipeta para depósito 200 nL de solução lipídica "A" em cada um dos fios.
- Espere 3-5 min permitir a montagem de monocamada lipídica espontânea ocorrer em cada interface água/óleo.
Nota: como as formas de monocamada lipídica, as diminuições de tensão superficial interface óleo/água/lipídica, que podem causar as gotas a ceder se o óleo circundante é suficientemente menos densa21. - Inferior a eletrodos (gotículas) até as extremidades de ambos os eletrodos mal tocarem no fundo do reservatório de óleo (Figura 1b) e então movê-los horizontalmente para trazer as gotas em contato.
Nota: A bicamada lipídica espontaneamente será fino, excluindo o excesso de óleo entre as gotas de contato. Normalmente, este processo ocorre dentro de 1 min.
14. elétrica caracterização do Biomolecular Memristor
- Formação de bicamada lipídica
- Para registrar a formação de bicamada lipídica, que corresponde a um aumento da capacitância elétrica entre as gotas, aplicar um 10 Hz, tensão de forma de onda triangular 10 mV usando um gerador de função (Figura 4) conectado à entrada externa da braçadeira do remendo amplificador.
Nota: Devido à natureza capacitiva da membrana lipídica, a resposta atual resultante deve ser uma forma de onda quadrada (Figura 4). Durante a formação de bicamada lipídica, 11.6 etapa, o pesquisador deve ver um crescimento da amplitude de corrente de pico-a-pico e observar também uma mudança visual entre gotículas conectadas (Figura 4).
- Para registrar a formação de bicamada lipídica, que corresponde a um aumento da capacitância elétrica entre as gotas, aplicar um 10 Hz, tensão de forma de onda triangular 10 mV usando um gerador de função (Figura 4) conectado à entrada externa da braçadeira do remendo amplificador.
- Medições de corrente-tensão
Nota: O memristor biomolecular é modelado como um resistor e um capacitor em paralelo12,21. Portanto, a resposta atual do dispositivo pode conter componentes resistivos e capacitivos, dependendo da frequência da tensão aplicada. Para estudar a natureza memristive do dispositivo e para obter a relação de corrente-tensão histerético pinçado12, pode ser necessário subtrair a corrente capacitiva da corrente total. O protocolo abaixo descreve este procedimento.- Usando um gerador de função, aplica uma forma de onda de tensão (triangular ou senoidal) de uma membrana lipídica livre alamethicin montada com as gotas da solução "A".
- A resposta corrente induzida através de múltiplas frequências de registro.
Nota: As correntes capacitivas são minimizadas nas frequências abaixo de 10 mHz. - Grave o tamanho da bicamada lipídica interfacial medindo o diâmetro da membrana lipídica no computador, ou gravando a amplitude de corrente de pico-a-pico resultantes a 10 Hz, onda triangular de 10 mV. A amplitude atual é proporcional a capacitância de membrana, que por sua vez é proporcional à área da membrana.
- Remova as gotículas que não contêm nenhuma alamethicin.
- Adicionar novas gotas aquosas usando solução "C" e formam uma bicamada lipídica.
- Use os Micromanipuladores para ajustar contato entre as gotas tal que a BICAMADA tem uma área semelhante (diâmetro ou onda quadrada de amplitude atual) como a um formado anteriormente.
- Repita as etapas 14.2.1 e 14.2.2.
- Subtrai a etapa atual gravada em 14.2.2 do atual registrados na etapa 14.2.7.
- Traça a corrente induzida contra tensão aplicada para cada frequência e forma de onda para obter a resposta de memristive "histerese comprimido".
- Experiências pulso
- Usando um software de programação personalizado e fonte de tensão analógica, gere pulsos de tensão com amplitudes específicas de altas e baixas, a tempo e fora de tempo.
Nota: Isto não é necessário se os pulsos de tensão podem ser gerados usando um gerador de função comercial. - Recorde a corrente em resposta a impulsos aplicados.
- Devido à natureza capacitiva do memristor, picos capacitivos serão gravados. Remova picos aplicando um filtro passa-baixo com banda passante apropriado.
- Usando um software de programação personalizado e fonte de tensão analógica, gere pulsos de tensão com amplitudes específicas de altas e baixas, a tempo e fora de tempo.
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Representative Results
Figura 1 exibe a configuração experimental usada para montar e caracterizar o memristor biomolecular. Reduzir as extremidades livres dos eletrodos para o fundo do reservatório de óleo, como mostrado na Figura 1b, foi encontrado útil para minimizar as vibrações dos eletrodos e gotículas que podem resultar em variações na área atual e bicapa medida, especialmente em casos onde o óleo de aquecimento pode gerar fluxo convectivo no óleo. A Figura 2 mostra o procedimento e o resultado da montagem o Ag/AgCl fios capilares de classe e suportes para eletrodo e micropipeta. A instalação está alojada dentro de uma gaiola de Faraday devidamente aterrada (Figura 3) para minimizar a interferência eletromagnética.
É imperativo para dar forma a um estábulo, isolante lipídica para este estudo. Neste protocolo, uma monocamada de lipídios monta para as interfaces de óleo/água das gotas aquosas imergidas em óleo. Em cima do contato entre as gotas, o excesso de óleo é excluído, e as adversária monocamadas lipídicas fina para uma lipídica espessa de 5 nm. A técnica mais comum utilizada em eletrofisiologia BICAMADA é tensão-braçadeira, onde a tensão através da bicamada é controlada e a corrente induzida é medida. Figura 4a retrata a corrente capacitiva de onda quadrada induzida por um 10 mV, 10 Hz tensão durante a formação da bicamada. Enquanto a amplitude aumenta após o início BICAMADA afinamento e subsequente expansão radial da membrana diluída, a forma de onda permanece quadrada. Usando a estado estacionário a amplitude da onda quadrada atual, a área nominal da bicamada lipídica pode ser calculada usando um valor pré-determinado de capacitância de membrana específicos para um de BICAMADA DPhPC21. Também, a área de BICAMADA pode ser avaliada visualmente pela medição do diâmetro da bicamada de uma imagem tirada com o microscópio figura 4b. Para cálculos de área de bicamada lipídica precisos, o leitor deverá consultar Taylor, et al.21. A área da bicamada lipídica pode ser ajustada alterando a posição relativa das gotículas21,31.
A pedido de um viés de tensão para um livre alamethicin lipídica, a resposta atual irá variar com base na frequência da tensão de entrada. A baixas frequências (< 10-50 mHz), onde a resistência da bicamada domina a impedância complexa, a resposta atual ôhmica é insignificante, porque a resistência nominal de membrana é normalmente maior que 10 GΩ. À medida que aumenta a frequência de entrada, capacitância de membrana contribui mais para a impedância do sistema, resultando na não-zero resposta atual exibida no enredo de corrente versus tensão na Figura 5a. Quando a mesma forma de onda da tensão de entrada (150 mV) é aplicado a uma resposta biomolecular, consistindo de uma membrana lipídica dopados com alamethicin, e quando a amplitude de tensão ultrapassa um limite crítico de inserção (~ 100 mV para uma membrana de DPhPC à temperatura ambiente), alamethicin peptídeos que residem na superfície da bicamada lipídica a inserir a membrana e agregam-se poros condutora de formulário. Formação de canais iônicos dependentes de limiar resulta em uma resposta atual macroscópica não-linear, com aumentando exponencialmente as correntes em tensões superiores ao limiar de inserção (Figura 5b). Enquanto alamethicin peptídeos são conhecidos para formar canais iônicos apenas com tensões suficientemente positivas de rectificação, a natureza simétrica dessas respostas atuais em ambas as polaridades é devido à inserção e agregação de populações isoladas de peptídeos, cada um de lados da membrana opostos. Dependendo da frequência da tensão aplicada, a resposta de corrente induzida também pode conter contribuições da corrente capacitiva. Portanto, a corrente capacitiva na Figura 5a deve ser subtraída o total atual exibido na Figura 5b para obter apenas a memristive beliscado histerese corrente-tensão resposta, exibida na Figura 5C, d.
A Figura 6 mostra a resposta de comutação dinâmica de um memristor biomolecular induzida por um trem de pulso de tensão (130 mV (alta), 20 mV (baixo), 100 ms (ON), 20 ms (OFF)). A tensão OFF é escolhida para ser 20 mV para diferenciar o retorno do dispositivo para um estado de isolamento, como canais de alamethicin partem a BICAMADA bastante atual simplesmente desaparecer no zero-tensão de entrada. O aumento cumulativo ON-estado corrente durante pulsos de tensão sucessivos representa facilitação emparelhado-pulsado, uma plasticidade que memristors biomolecular voláteis são capazes de expor12.
Figura 1: Instalação experimental e partes principais. (uma) estação de trabalho padrão para montagem e caracterizando o memristor biomolecular inclui um microscópio invertido, 3 eixos Micromanipuladores, uma câmera digital, uma tabela de isolamento de vibração, um eléctrodo, um suporte de micropipeta de vidro, um amplificador atual, um gerador de função e um reservatório de óleo. A instalação é montada no palco do microscópio como descrito nos passos 11-13. (b) uma zoom-in fotografia da instalação mostrando as pontas dos fios Ag/AgCl tocar no fundo do reservatório de óleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de preparação do eléctrodo. Fotografias mostrando: (a) a prata fios de molho em água sanitária; (b) um eléctrodo; (c) um 5cm longo capilar de vidro conectado ao titular do eletrodo; (d) um Ag/AgCl eletrodo alimentado através do vidro capilar; (e), um suporte de micropipeta de vidro; e (f) a totalmente montados eletrodos e titulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento de aterramento. Fotografias mostrando: (a) um parafuso de rosca na superfície da mesa de isolamento de vibração para criar uma barra quando conectado à terra; e (b) um Faraday laboratório-feita gaiola cobrindo a instalação de reservatório e eletrodo de óleo para proteger a medição de interferência eletromagnética. A gaiola e o microscópio de fase estão ligados ao chão de ônibus via cabos I e II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medições em tempo real atuais mostram crescimento de areal e desbaste inicial BICAMADA. (um) atual medido (topo) durante a formação espontânea de BICAMADA entre gotículas revestidos de lipídeos em resposta a uma tensão de forma de onda triangular. A magnitude da corrente medida é diretamente proporcional a capacitância da interface e, portanto, a área da bicamada. A área da interface pode ser variada, alterando a distância entre os dois eletrodos da gota-rolamento. (b) uma imagem adquirida através da microscópio invertido mostra uma vista inferior e dimensões de um memristor biomoleculares típicos baseados em membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Relação de corrente-tensão e histerese pinçado. (um) a corrente-tensão respostas de uma alamethicin-livre DPhPC lipídica. Uma membrana lipídica somente é altamente isolante (10 ~ GΩ), o que explica a baixa resposta atual ôhmica a 0,017 Hz, uma frequência onde a impedância é dominada pela resistência da membrana. Em frequências mais altas, a capacitância de membrana contribui mais significativamente a impedância total da interface, resultando em uma corrente capacitiva induzida de diferente de zero. (b) as relações de corrente-tensão dinâmicas versus frequência de uma bicapa lipídica formam entre duas gotas contendo peptídeos de alamethicin (obtidos com uma onda triangular de entrada). (c) o memristive, pinçada histerético resposta atual do dispositivo é obtida subtraindo-se a corrente capacitiva exibida em da corrente total exibido em b. (d) zoom-in para destacar as diferenças entre o total e as correntes de memristive. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resposta dos memristors biomolecular para pulsos de tensão retangular e plasticidade. O dispositivo responde a impulsos de tensão subsequentes com um aumento na condutância durante o tempo ON, apesar de intermitentemente, restaurar um estado de isolamento durante cada tempo OFF. O aumento da corrente de pulso a pulso mostra que a condutância instantânea do dispositivo é uma função do estímulo presente e estímulos prévios, análogos à plasticidade de curto prazo em bio-sinapses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho apresenta um protocolo para montagem e caracterização biomolecular memristors baseado no íon biomembranas sintético dopado com canal formadas entre duas gotas de água em óleo. O dispositivo macio-matéria, dois terminais é concebido e estudado para: 1) superar as restrições que estão associadas com a tecnologia de estado sólida, tais como ruído elevado, elevado consumo de energia e alta comutação de tensões, imitam 2) mais de perto a composição, estruturam comutação de mecanismos de sinapses biológicas e 3) explorar os mecanismos e características de plasticidade de bio-sinapse que não são expostas por dispositivos de estado sólidos.
A gota interface BICAMADA técnica21, que representa o bloco de construção do actual tecnologia12, é uma abordagem simples e modular para montagem de membrana que tem sido extensivamente usada para o estudo de Biofísica membrana21, proteínas22, íon canais29e outras biomoléculas32. Oferece vantagens específicas para precisamente controlando e interrogar as membranas modelo e representa um bloco de construção para autônomos e responsivo a estímulos materiais26. Vários métodos têm sido desenvolvidos para montar bilayers de interface da gota, incluindo o enforcamento soltar método21 , que foi adaptado como o método principal para desenvolver e caracterizar o memristor biomolecular. Embora essa técnica de montagem de membrana foi usada em estudos anteriores, aqui apresentamos um protocolo completo que permite que os pesquisadores recriar e estudar memristive bilayers de interface da gota em seus próprios laboratórios. O protocolo é escrito especificamente de modo a permitir que os investigadores em áreas não-membrana biologia, como a comunidade de neuromorphic, para compreender e recriar esses procedimentos.
Em sua forma mais simples, o protocolo que descrevemos aqui para avaliar as funcionalidades do memristive de um biomembrane pode ser replicado com equipamentos básicos de laboratório como um gerador de função, um microscópio e um sistema de medição atual. O dispositivo montado é eletricamente equivalente a um resistor (~ 10 GΩ) e um capacitor ligados em paralelo. Na presença de peptídeos, tais como alamethicin, que são capazes de formar poros dependente da tensão na membrana, a resistência de membrana cai significativamente e resistiva corrente pode ser detectado em resposta a sinais de tensão (DC ou AC) de entrada. No entanto, a membrana de grande resistência e dependente da frequência de impedância elétrica do dispositivo significam que: 1) induzido por correntes são pequenas (pA-nA) e sujeito às interferências electromagnéticas; e 2) deve ter cuidado com precisão induzir e medir as propriedades desejadas memristive separadas de respostas de membrana capacitiva, respectivamente. Em resposta a uma tensão alternada e dependendo da frequência do sinal, o atual gravado irá conter componentes capacitivos e resistivos. Para alcançar a histerese de comprimido, que é uma assinatura de memristive dispositivo, deve-se seguir o protocolo descrito na etapa 14. Os fios de suspensão são suscetíveis às vibrações, o que podem resultar em respostas artefactual como oscilações erroneamente atribuídas a dinâmica real do dispositivo. Posicionamento dos fios na parte inferior do reservatório de óleo melhora esse comportamento.
O memristor biomolecular com sua estrutura atual e design emula a plasticidade sináptica a curto prazo que ocorre no terminal pré-sináptica. Ele também imita alguns dos mecanismos que causam a facilitação pré-sináptica de pulsado emparelhada no cérebro devido a acumulação e o esgotamento das vesículas de neurotransmissores no neurônio pré-sináptica. Esta metodologia de montagem imita sináptica permite o estudo e a validação dos processos de biomimetic responsáveis por muitos tipos de plasticidade a curto prazo e a otimização de modularidade e escalabilidade não é possível com outras tecnologias de33. Imprevistas de funcionalidade pode ser descoberta modificando a composição da membrana, os tipos de canais iônicos que são incorporadas à membrana e mesmo o número de gotículas conectadas e interfaciais membranas que constituem cada dois-terminal dispositivo. Como exemplo, temos demonstrado recentemente os recursos de aprendizagem on-line do memristor biomolecular por meu relacionamento com um neurônio Solid-State34.
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Disclosures
Este manuscrito foi criado pela UT-Battelle, LLC, sob contrato n º DE-AC0500OR22725 com o departamento de energia dos EUA. O governo dos Estados Unidos mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos Estados Unidos mantém uma licença não-exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado de Este manuscrito, ou permitir que outros o façam, para os fins do governo dos Estados Unidos.
Acknowledgments
Apoio financeiro foi fornecido pela nacional Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Pesquisa para G.J.T., C.D.S., A.B., e C.P.C foi parcialmente patrocinado pelo laboratório dirigido a pesquisa e desenvolvimento programa de Oak Ridge National Laboratory, geridos pela UT-Battelle, LLC, para o departamento de energia dos EUA. Uma parte desta pesquisa foi realizada no centro para Nanophase Ciências dos materiais, que é uma facilidade do DOE escritório de ciência usuário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
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