Summary
細胞に基づく試金は広く使用されている血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン g. を検出方法です。このメソッドは、臨床診断や視神経脊髄炎光スペクトラム障害の科学的研究に適用でした。
Abstract
アンチ-アクアポリン-4 (AQP4) 免疫グロブリン G (IgG) は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD) のコアの診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性を持つひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出するため広く使用されている方法です。簡単に、血清 IgG 抗 AQP4 は、バイオチップに固定し、フルオレセイン標識二次抗体で検出された AQP4 を発現させた細胞によってキャプチャされます。蛍光顕微鏡を利用して、蛍光を可視化するし、少なくとも 2 つの経験豊富な臨床医によって蛍光の強度を評価します。NMOSD の最終的な診断は、抗 AQP4 IgG の検出結果、臨床症状および画像所見の組み合わせに基づいて行うことが。以前の研究によると CBA はより敏感でありその他抗 AQP4 IgG の検出法よりも特定と臨床診断と NMOSD の研究に適用することができます。メソッドには制限があります。たとえば、血清 IgG 抗体は抗 AQP4 を評価する国際的な規模はまだ欠けています。ここでは、CBA を用いたひと血清抗 AQP4 igg 抗体検出のための詳しいプロトコルを説明します。
Introduction
血中 AQP4 IgG は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD)1のコア診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性で広く使用されている抗 AQP4 igg 抗体検出法です。ここでは、CBA のための詳しいプロトコルを導入します。
AQP4、水チャネル蛋白質が膜貫通の六つのユニットと周囲の水溶液のいずれか 2 つのヘリカル ドメイン間隙2。IgG 抗 AQP4 は、目標3アストロ サイト終足に主にある AQP4 へのバインディングを介して NMOSD の病因に関与しています。それは抗 AQP4 IgG が陽性 NMOSD 患者4の約 3 分の 2 で示されています。最新国際診断基準 NMOSD のため、IgG 抗 AQP4 は、5コア診断バイオ マーカーと見なされます。この点では、それはひと血清を検出するための信頼性の高いプロトコルを確立する重要な抗 AQP4 IgG と NMOSD の臨床診断を容易にします。
現在、様々 な抗 AQP4 IgG の検出方法は、CBA、組織ベースのアッセイ、酵素抗体法、流れ cytometry6,7など、使用できます。CBA は抗 AQP4 IgG をキャプチャする、人間の AQP4 が発現する EU90 細胞を採用しています。キャプチャされた抗 AQP4 IgG は二次抗体を蛍光で検出され、顕微鏡による可視化しました。証拠の蓄積は CBA はより敏感なよりその他抗 AQP4 IgG の検出の方法6,7特定を示しています。メタ分析によると感度と特異度 CBA の 76% と 99% で、組織ベースよりも高かったことが示された、試金の酵素免疫6。さらに、igg 抗 AQP4 抗体の診断アッセイの多施設比較は実施7だった。193 研究被験者 15 ヨーロッパ診断センターからの合計では、7が在籍しています。7血清抗 AQP4 の igg 抗体を検出する方法は 4 種類活かされています。CBA がより敏感より他の方法7特定だったことを示した。AQP4 は 2 つの主要なアイソ フォーム (AQP4 M1 と AQP4 M23) として表した、抗 AQP4 IgG キャプチャ セルは AQP4 M1 または AQP4 M23 をトランスフェクトしました。ただし、キャプチャ セルのタイプは良いまま論争です。1 つの調査は AQP4 M1 ベースをサポートして CBA8、他人は AQP4 M23 基づく CBA であることが示されている間は良い7,9,10。ただし、AQP4 ベース M23 CBA は、非特異的 IgG 結合8のための偽肯定的な結果をもたらす可能性があります。会堂 et al.11は、AQP4 M1 と AQP4 ベース M23 CBAs 間抗 AQP4 igg 抗体検出率に有意差はなかったことを報告しました。
要約すると、血清抗 AQP4 の IgG は NMOSD コア マーカー。CBA は、高い特異性と他の抗 AQP4 の igg 抗体の検出法よりも感度をが。それは残る AQP4 M1 または AQP4 M23-ベース CBA が良いかどうか物議を醸す。この記事では AQP4 ベース M1 CBA のための詳しいプロトコルは説明した、NMOSD の臨床診断学に適用することができます。
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Protocol
この手順は、最初病院の吉林大学の倫理委員会によって承認された、約 1500 のテーマで行われました。
1. 患者登録や血液検体の採取
- 以下にクリニック患者主訴や症状に抗 AQP4 IgG 血清の研究室検出を適用します。同様の物理的な検査を実行します。
視神経炎: 視野の損失や視力の低下などの視覚障害を持つ患者は苦しみます。
急性脊髄炎: 患者は麻痺、感覚障害、自律神経機能障害を呈することがあります。
エリア後野症候群: 患者が原因不明のしゃっくり、吐き気や嘔吐の症状があります。
急性脳幹症候群: 脳幹部病変は、さまざまな症状と病変の位置によっては身体的な徴候にされる可能性があります。
症候性ナルコレプシーや間脳 MRI 病変 NMOSD 典型的な急性の間脳臨床症候群。
NMOSD 典型的な脳の病変を有する症候性脳症候群。
注:NMOSD5の国際コンセンサス診断基準によると患者は血清抗 AQP4 場合 NMOSD の診断は行うことが IgG 陽性はコアの臨床的特徴の少なくとも 1 つは上記記載されています。ただし、視神経炎だけ患者における抗 AQP4 IgG のテストはお勧めできません。 -
血液検体の採取
注:患者が絶食する必要はありません。- 4 mL 真空の血のコレクションの管に 2-3 mL の静脈血を描画します。
- 30 分間室温 (RT) の凝固する血清を許可します。
注:長期にわたる凝固血小板からの漏出による血清レベルを増やすことができます。 - 2100 x gで 5 分間遠心は慎重に新しい管へ血清を転送します。
- すぐに血清または因数を分析し、-20、保管または-80 ° C
注:-20 ° C でストレージは、-80 ° C は保管年数ヶ月の貯蔵のためです。
2. 抗 AQP4 抗体の検出
注意:患者検体と試薬使用キットは伝染性材料を考慮されなければなりません。ナトリウムのアジ化物を含む試薬キットには有毒です。プロトコルのフロー チャートは、図 1で提供しています。
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準備
- 使用する前に RT にキットを持って来る。
注: ストア 2-8 ° C でキット - 少なくとも 200 ml 0.2% を含む PBS 洗浄バッファーのトゥイーン 20。洗浄バッファーの 100 mL を 500 mL ビーカーに注ぎ。
- 血清サンプル洗浄バッファーで 10 倍希釈。ディストリビューターの指示に従って正と負のコントロールを準備します。
- 使用する前に RT にキットを持って来る。
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サンプル インキュベーション
- 試薬トレイ (図 2) の反応場に 30 μ L の希釈サンプル、肯定的な制御または否定的なコントロールを追加します。
注:空気の泡を避けるため。 - バイオチップのスライドで保護カバーを取り外します。
注:剥離と固定セルの汚染を避けるためにバイオチップを触れないでください。カバーを取り外す前に、スライドに並べてを保持します。 - バイオチップ スライドを試薬トレイ (図 2) に適用します。室温 30 分インキュベーションを開始します。
注:すべてのサンプルは、他の液滴混合することがなく対応するバイオチップに接続されている個々 の液滴をする必要があります。 - 洗浄バッファーで一度バイオチップ スライドを軽くすすいでください。少なくとも 5 分位できればシェーカーのビーカーの洗浄バッファーの 100 mL で 500 mL のビーカーにバイオチップ スライドを浸します。
- 洗浄バッファーからバイオチップ スライドを取る。ペーパー タオルで反応場の外の残留洗浄バッファーを丁寧にぬぐいます。蒸発反応場の残留洗浄バッファーに 1-2 分のオープンエアのバイオチップのスライドを公開します。
注:反応場を乾燥しないでください。ペーパー タオルでバイオチップを触れないでください。
- 試薬トレイ (図 2) の反応場に 30 μ L の希釈サンプル、肯定的な制御または否定的なコントロールを追加します。
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二次抗体の孵化
- ディストリビューターの指示に従って二次抗体溶液を準備します。
- きれいな試薬トレイの反応場に二次抗体を蛍光の 25 μ L を追加します。
- 二次抗体と試薬カセットにバイオチップのスライドを適用します。室温 30 分間インキュベートします。
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取付
- 使用される洗浄バッファーを注ぐし、ビーカーに 100 mL の新鮮な洗浄バッファーを追加します。2.2.4 と 2.2.5 の手順で説明するように洗浄を繰り返します。
- 慎重にバイオチップ スライド (反応フィールドごとに 1 つのドロップ) を反応場に埋め込む媒体を追加します。カバーのガラスの 1 枚でバイオチップ スライドをシールします。空気の泡を避けるため。
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蛍光検出
- 顕微鏡と予熱 15 分選択フィルターの 488 nm の蛍光ランプをオンにします。
- オープン写真ソフトウェア。異なる倍率ですべて反応場の transfected 融合領域から写真を撮る。まず、概要については、4 倍の倍率で 1 つの写真を撮るし、10 x、20 x の倍率でより多くの写真を撮る。
注:詳細なプロトコルを表 1に示します。結果の解釈は、代表的な結果のセクションで説明します。
3. 患者の診断
- 患者は血清抗 AQP4 場合 IgG 陽性、NMOSD のコア臨床特性の少なくとも 1 つを示しています (ディスカッション セクションを参照)、NMSOD5症例を診断。しかし、患者は抗 AQP4 場合、IgG 陰性、NMOSD の診断は除外されません可能性があります。
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Representative Results
ここで説明する手順を使用して、特定の抗 AQP4 血清中 IgG は検出です。中には、希釈サンプル、陽性対照および陰性対照が transfected と融合領域 (図 2) を含む反応のフィールドに追加されました。Transfected 領域で負の制御の蛍光は主にバイオチップ (図 3) に transfected セルに二次抗体の非特異的結合を示されました。均一弱い蛍光が表示されます (図 3)。肯定的な制御は抗 AQP4 抗体は反応場に追加されました。強い蛍光が transfected セル (図 4) の AQP4 m1 抗 AQP4 IgG の特定の結合を示した transfected 領域で観察されました。蛍光融合領域で肯定的な制御のバイオチップ (図 4) 固定セルに抗 AQP4 IgG の非特異的結合ヒントを示した。希釈サンプル x 10、抗 AQP4 IgG 陰性血清を示した蛍光パターン陰性対照のよう肯定的な血清陽性コントロール (図 5) に似たパターンを示した。蛍光の強度は、抗 AQP4 抗体 igg 抗体価に関連付けられていた。蛍光性の異なる強度の例としては、図 5に掲載されています。図 5Aと5 bであった抗 AQP4 IgG 陰性試料から図 5C H抗 AQP4 IgG 陽性検体から。サンプルが抗 AQP4 が考慮された限り transfected エリアで登場した異種と粒状蛍光、蛍光の強さに関係なく、IgG 陽性。血清抗 AQP4 に基づいている NMOSD の診断基準は IgG、ディスカッション セクションでさらに説明されます。
いくつかのサンプルの細胞の数が少ないが transfected エリアの強く染まったし、血清抗 AQP4 IgG 陽性または負 (図 6) であったかどうか判断することが難しかった。この場合は、「考えられるポジティブ」を報告できます。稀なケースで transfected エリアのサンプルの蛍光均一より強かった融合地区 (図 7)。この場合、サンプルは抗 AQP4 IgG 陰性とみなす必要があります。背景の蛍光性の強度は、非特異的な可能性があります。信頼性の高いレポートを作成するには、すべての写真は、少なくとも 2 つの臨床医によって盲目的に評価されなければなりません。臨床医は、評価の前に訓練する必要があります。このプロトコルでは彼らは別のサンプル タイプの代表的な写真を示されたし、結果を評価する方法として知らされました。その後、彼らは写真を経験豊富な臨床医と一緒にを評価されます。最後に、訓練された臨床医働いて独立しています。理想的な状況で、それは常に同じ臨床結果を評価をする必要があります。
図 1: 抗 AQP4 igg 抗体検出プロトコルのフロー チャート。AQP4 M1 transfected または融合の EU 90 セルは、バイオチップに固定されます。血清をバイオチップに追加する場合は、血清中抗 AQP4 IgG が固定 transfected セルによってキャプチャされます。その後、蛍光標識二次抗体は igg 抗 AQP4 抗体を検出に適用されます。様々 な倍率での顕微鏡による蛍光を視覚化できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サンプル ・ インキュベーションします。(A) 試薬トレイの平面図です。すべての試薬のトレイには、個々 の反応の 5 つのフィールドが含まれています。肯定的な制御、サンプル、および否定的な制御は、別の反応フィールドに追加する必要があります。(B) バイオチップ スライドの平面図です。バイオチップのすべてのスライドには、5 つの反応場持つ 2 つのサブセクションにはが含まれています。トランスフェクションの記載では固定の AQP4 M1 transfected セル融合の記載は、融合細胞。(C) 正面試薬トレイとバイオチップ スライドの。試薬トレイとバイオチップのスライドの反応の場は、お互いペアになっています。試薬トレイの反応場に追加されたサンプルは、バイオチップのスライドに対応する反応場に接続必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 陰性対照の代表的な数値です。(A) ネガティブ コントロールの transfected 領域の概要は倍率顕微鏡 x 4 によって得られました。地域全体で均一弱い蛍光が観察されました。(B、C)10 で詳細がみ x の (B) および (C) 拡大写真。一般的に、細胞膜とプラズマにわずかに染色されたと細胞の核が染色。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 肯定的な制御の代表的な数値です。(A, B)トランスフェクション (A) および肯定的な制御の融合 (B) 領域が表示されます。均一弱い蛍光融合領域固定セルに抗 AQP4 IgG の非特異的結合を示す観察されました。逆に、異種の強い蛍光が AQP4 M1 固定細胞に発現する抗 AQP4 IgG の特異的結合を示す transfected エリアの観察されました。(C F)10 と transfected (C、E)、融合 (D, F) エリアの詳細が観測される x (C, D) または (E, F) 倍率 × 20。弱いとも蛍光融合分野で登場。しかし、transfected エリア内のセルの大部分は、強烈な蛍光を示した。強く陽性細胞のプラズマ IgG 抗 AQP4 は滑らかで、細分化された蛍光を示した。細胞核は無染色またはわずかに染色します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 抗 AQP4 抗体の正または負のサンプルの値の代表例です。試料の 10 倍希釈と示されているすべての数字が 10 × 対物で撮影されました。(A, B)否定的な蛍光サンプル: (A) に蛍光が弱かった均一トランスフェクションと (B) 融合領域。(C, D)弱い蛍光サンプル: 融合領域 (D)、少量の細胞 (約 25% から 50%) と比較するとtransfected 地域 (C) より強い蛍光を示した.(E, F)適度な蛍光サンプル: transfected エリア (E)、強い粒状蛍光細胞 (約 50% 〜 75%) の中程度の量で観察されました。(G, H)強い蛍光サンプル: 融合領域 (H) のセルが弱くステンド グラスします。ただし、transfected エリア (G)、粒状蛍光強度のある多数のセル (約 75%) に登場。一般的には、igg 抗 AQP4 抗体価の増加と共に、蛍光強度と強く陽性細胞の割合がそれに応じて昇格。融合領域の蛍光常に均一弱かった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:抗 AQP4 抗体「考えられるポジティブ」サンプルの代表的な数値です。(A, B)蛍光パターンに有意差は認められなかった transfected (A) と 4 倍の倍率で融合 (B) 地域間。(C E)10 x (C, D) または 20 (E, F) の x 倍率、強い粒状蛍光を示した transfected エリア (C, E) の少数の細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 典型的でない抗 AQP4 IgG 陰性サンプルの例です。トランスフェクション (A) と (B) の融合エリア均一染色.ただし、transfected エリアの蛍光は、融合領域よりも強かった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 倍率 | Transfected エリア | 融合領域 |
| 4 x | 1 枚の写真 | 1 枚の写真 |
| 10 倍 | 写真 4 枚 | 1 枚の写真 |
| 20 倍 | 5 写真 | 1 枚の写真 |
表 1: 蛍光顕微鏡。トランスフェクションと融合領域の画像に 4 x、10 x、20 x の目標を使用することをお勧めします。
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Discussion
ひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出する広くアクセス可能なメソッドを説明しました。NMOSD、密接に関連 IgG 抗 AQP4 と信頼性の高い抗 AQP4 igg 抗体検出法の確立 NMOSD の臨床診断のため非常に重要です。まず、IgG 抗 AQP4 は、NMOSD の特定です。多発性硬化症は中枢神経系の免疫介在性疾患ではまた、NMOSD12と多くの類似点を共有します。ただし、抗 AQP4 IgG のみ陽性 NMOSD13でです。第二に、IgG 抗 AQP4 は NMOSD 患者の間で一般的です。NMOSD 患者の約 3 分の 2 は、血清抗 AQP4 IgG 陽性4です。第三に、最も最近の診断基準血清抗 AQP4 に基づいて NMOSD IgG 検査5。一緒に取られて、血清抗 AQP4 の igg 抗体の検出は、NMOSD の臨床診断を促進できます。
様々 な抗 AQP4 igg 抗体検出法、CBA は臨床診断、高い感度と特異性6、7のために広く使用されます。CBA は、迅速かつ簡単な方法は、いくつかのキーポイントを対処すべき。まず、実験者と、AQP4 M1 transfected 融合細胞は、バイオチップに固定する必要がありますバイオチップを操作するときは注意してくださかった。全体の手順中にバイオチップまたはしてはいけない手で触れて乾いています。また、バイオチップを持つスライドを優しく扱う必要があります、それ以外の場合、バイオチップの固定セルに落ちる可能性がありますまたは汚れて蛍光欠陥ゾーンまたは高い蛍光バック グラウンドがあります。第二に、試料を試薬トレイ上の反応のフィールドに追加する場合、サンプルの滴が相互に混合されておらず研究者する必要がありますを確認します。サンプルとバイオチップの気泡は避けるべきであります。
このメソッドには制限があります。たとえば、CBA で igg 抗 AQP4 抗体を検出する場合は、蛍光強度を定量化し、血清中に抗 AQP4 IgG 抗体価を説明するは難しいです。現在、診断センター、蛍光強度の主観的によって報告されます 2 つの臨床医サンプル対.コントロールの写真を比較しました。ほとんどの場合、血清が抗 AQP4 IgG 陽性または陰性であるかどうかを判断するは難しいはないです。しかし、まれに、試料からの蛍光はネガティブ コントロールよりわずかに高いだけに見えるかもしれませんが、サンプルは、「考えられるポジティブ」と見なされます。このような状況で臨床医は診断を下すにはもっと注意する必要があります。別の解決策は、CBA を繰り返しています。蛍光の強度との国際的な定義を定量化するより正確な方法「抗 AQP4 IgG 陽性」が保証されます。特に、脳脊髄液中の抗 AQP4 の igg 抗体の陽性率は血清中よりもはるかに低いと脳脊髄液中抗 AQP4 IgG のテストは有益な14,15ではありません。
CBA は、臨床診断と NMOSD の科学的研究の両方に適用できます。NMOSD の臨床診断、臨床症状、血清の組み合わせに基づいて行われます抗 AQP4 IgG および画像所見。NMOSD5の NMOSD の少なくとも 1 つのコアの臨床特性と血清抗 AQP4 IgG 陽性患者を診断できます。ただし、患者が抗 AQP4 場合 IgG 陰性、NMOSD の診断に除外5、べきではないと臨床医が臨床症状および画像所見5,16,17 評価さらに.診断18,19,20を支援するミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質抗体を検出があります。特に、血清抗 AQP4 の IgG 抗体価は、リツキシマブ治療21に変更可能性がありますがない、もちろん病気と免疫療法22,23応答の予測です。CBA は科学的な研究にも広く使用されます。たとえば、Yang ら24は抗 AQP4 NMOSD IgG 陽性患者の臨床的特徴を説明します。さらに、頂いてら25は抗 AQP4 IgG 陽性 NMOSD 患者25の因子を分析しました。両方の研究は血清の検出に CBA を使用抗 AQP4 IgG。
要約すると、CBA は igg 抗 AQP4 抗体を検出するため広く使用されている方法で、臨床診断、NMOSD の科学研究に適用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は国立科学財団の中国 (第 31600820)、健康と家族計画の吉林省委員会 (ナンバー 2016Q036) と科学と技術計画プロジェクトの吉林省号からの助成金からのサポートに感謝20180520110JH)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. |
| CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A | photograph software |
| Gel & clot activator tube | Improve medical | 623040202 | From a local Chinese company |
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