Summary
सेल आधारित परख एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि सीरम विरोधी का पता लगाने के लिए है aquaporin-4 इम्युनस्टोबुलिन जी । इस विधि नैदानिक निदान और neuromyelitis ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम विकारों के वैज्ञानिक शोध करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
एंटी-एक्पोराइन-4 (AQP4) इम्युनोग्ब्युलिन जी (IgG) न्यूरोमाइलाइटिस ऑप्टिका स्पेक्ट्रम विकारों (NMOSD) के लिए कोर डायग्नोस्टिक बायोमरकर है । सेल आधारित परख (CBA) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ मानव सीरम में विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने के लिए है । संक्षेप में, सीरम विरोधी AQP4 IgG AQP4 द्वारा कब्जा कर लिया है-transfected कोशिका है कि biochip पर तय की है तो एक fluorescein-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रतिदीप्ति की कल्पना करने के लिए किया जाता है, और प्रतिदीप्ति की तीव्रता का मूल्यांकन कम से दो अनुभवी चिकित्सकों द्वारा होता है । NMOSD का एक अंतिम निदान विरोधी के संयोजन के आधार पर बनाया जा सकता है-AQP4 IgG का पता लगाने के परिणाम, नैदानिक अभिव्यक्तियाँ, और neuroradiological निष्कर्षों. पिछले अध्ययनों के अनुसार, CBA अधिक संवेदनशील और अंय विरोधी AQP4 IgG पता लगाने के तरीकों की तुलना में विशिष्ट है, और यह दोनों नैदानिक निदान और NMOSD के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है । विधि की सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, एक अंतरराष्ट्रीय पैमाने पर सीरम विरोधी AQP4 IgG titers का मूल्यांकन करने के लिए अभी भी कमी है । यहां, मानव सीरम विरोधी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल-AQP4 IgG जांच CBA का उपयोग कर वर्णित है ।
Introduction
सीरम AQP4 igg न्यूरोमाइलाइटिस optica स्पेक्ट्रम विकारों (nmosd)1के लिए एक कोर नैदानिक बायोमार्कर है । सेल आधारित परख (CBA) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विरोधी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ AQP4 IgG खोज विधि है । यहां, CBA के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश किया है ।
AQP4, एक पानी चैनल प्रोटीन, छह झिल्ली-फैले इकाइयों और दो कुंडलिनी एक जलीय पोरे2आसपास के डोमेन है । Anti-AQP4 IgG अपने लक्ष्य AQP4 है, जो मुख्य रूप से3astrocytes के endfeet पर स्थित है के लिए बाध्यकारी के माध्यम से NMOSD के रोगजनन में शामिल है । यह दिखाया गया है कि विरोधी AQP4 IgG NMOSD रोगियों के लगभग दो तिहाई में सकारात्मक है4. Nmosd के लिए सबसे हाल ही में अंतरराष्ट्रीय नैदानिक मानदंडों में, विरोधी AQP4 igg एक कोर नैदानिक बायोमार्कर5माना जाता है. इस संबंध में, यह मानव सीरम विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने और NMOSD के नैदानिक निदान की सुविधा के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
वर्तमान में, विभिंन विरोधी AQP4 igg का पता लगाने के तरीकों ऐसे cba, ऊतक के रूप में उपलब्ध हैं, परख आधारित, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख, और प्रवाह cytometry6,7। CBA EU90 कोशिकाओं को रोजगार, जो मानव AQP4 के साथ transfected हैं, विरोधी AQP4 IgG कब्जा करने के लिए । कब्जा कर लिया anti-AQP4 igg प्रतिदीप्त माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया है और बाद में माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना । सबूत जमा पता चला है कि cba और अधिक संवेदनशील है और अंय विरोधी से विशिष्ट AQP4 igg जांच विधियों6,7। एक मेटा-विश्लेषण के अनुसार, CBA की संवेदनशीलता और विशिष्टता को ७६% और ९९% दर्शाया गया था, जो ऊतक आधारित और एंजाइम से जुड़े इम्योनोसोरंट असेस6से अधिक थे । इसके अलावा, एंटी-AQP4 IgG के नैदानिक assays की एक मल्टीसेंटर तुलना7आयोजित किया गया था । 15 यूरोपीय नैदानिक केंद्रों से कुल १९३ अध्ययन विषयों में से7दाखिल किए गए । चार विभिंन तरीकों सीरम विरोधी का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया AQP4 IgG7। यह प्रदर्शन किया गया था कि CBA और अधिक संवेदनशील और अंय विधियों7से विशिष्ट था । AQP4 के रूप में दो प्रमुख isoforms (AQP4-M1 और AQP4-M23) के रूप में व्यक्त की है, विरोधी AQP4 IgG कैप्चर सेल या तो AQP4-M1 या AQP4-M23 के साथ transfected है । हालांकि, कब्जा सेल के किस प्रकार के बेहतर है विवादास्पद रहता है । एक जांच AQP4-M1 आधारित cba8का समर्थन किया है, जबकि अंय संकेत दिया है कि AQP4-M23 आधारित cba बेहतर है7,9,10। हालांकि, AQP4-M23-आधारित CBA गलत सकारात्मक परिणाम अविशिष्ट IgG बाइंडिंग8के कारण उपज सकता है । जरीअस एट अल. 11 ने बताया कि AQP4-M1 और AQP4-M23-आधारित cbas के बीच एंटी-AQP4 igg डिटेक्शन दरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था ।
सारांश में, सीरम विरोधी AQP4 igg nmosd के लिए एक कोर बायोमार्कर है. CBA उच्च विशिष्टता और अंय विरोधी AQP4 IgG पता लगाने के तरीकों की तुलना में संवेदनशीलता है । यह विवादास्पद रहता है कि AQP4-M1-या AQP4-M23-आधारित CBA बेहतर है । इस आलेख में, AQP4-M1-आधारित CBA के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है, जो नैदानिक निदान और NMOSD के अध्ययनों पर लागू कर सकते हैं ।
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Protocol
इस प्रक्रिया को जिलइन यूनिवर्सिटी के पहले अस्पताल की एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी और लगभग १,५०० विषयों पर प्रदर्शन किया गया था.
1. रोगी नामांकन और रक्त नमूना संग्रह
- मुख्य शिकायतों और नीचे सूचीबद्ध लक्षणों के साथ क्लिनिक रोगियों को सीरम विरोधी AQP4 IgG की प्रयोगशाला का पता लगाने लागू होते हैं । शारीरिक परीक्षाओं का भी निष्पादन करें ।
ऑप्टिक तंत्रिकाशोथ: रोगियों दृश्य के क्षेत्र की हानि और दृश्य तीक्ष्णता की कमी के रूप में इस तरह के दृष्टि घाटे के साथ पीड़ित हैं ।
एक्यूट मेलाइटिस: रोगियों पक्षाघात, संवेदी घाटा और स्वायत्त रोग के साथ मौजूद हो सकता है ।
एरिया पोस्ट्रीमा सिंड्रोम: मरीजों में असमझाया हिचकी, मतली या उल्टी के लक्षण हो सकते हैं ।
एक्यूट ब्रेन्यूम सिंड्रोम: ब्रेन्स घावों घावों के स्थान के आधार पर विभिन्न लक्षणों और शारीरिक संकेतों में परिणाम हो सकता है ।
रोगसूचक नार्माफेल्प्सी या तीव्र diencephalic NMOSD के साथ नैदानिक सिंड्रोम-ठेठ diencephalic एमआरआई घावों ।
NMOSD-ठेठ मस्तिष्क घावों के साथ रोगसूचक मस्तिष्क सिंड्रोम ।
नोट: NMOSD5के लिए अंतरराष्ट्रीय सहमति नैदानिक मानदंडों के अनुसार, nmosd का निदान किया जा सकता है अगर रोगी सीरम विरोधी AQP4 igg-सकारात्मक है और कोर नैदानिक ऊपर उल्लेख किया विशेषताओं में से एक है । हालांकि, हम विरोधी के परीक्षण की सिफारिश नहीं AQP4 IgG ऑप्टिक तंत्रिका शोथ के साथ रोगियों में ही । -
रक्त नमूना संग्रह
नोट: मरीजों को उपवास करने की जरूरत नहीं है ।- एक 4 मिलीलीटर वैक्यूम रक्त संग्रह ट्यूब में शिरापरक रक्त की 2-3 मिलीलीटर ड्रा ।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए सीरम को थक्का करने की अनुमति दें ।
नोट: लंबे समय तक थक्के प्लेटलेट्स से रिसाव के कारण सीरम का स्तर बढ़ा सकते हैं । - 5 मिनट के लिए २१०० x g पर सेंट्रीफ्यूज ध्यान से सीरम एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
- सीरम तुरंत या aliquot का विश्लेषण करें और-20 या-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण महीनों के भंडारण के लिए है, जबकि-८० डिग्री सेल्सियस वर्षों के भंडारण के लिए है ।
2. एंटी-AQP4 एंटीबॉडी डिटेक्शन
चेतावनी: रोगी के नमूनों और प्रयुक्त किट अभिकर्मकों को संक्रामक सामग्री माना जाना चाहिए. किट में सोडियम एजाइड युक्त अभिकर्मकों को विषाक्त किया जाता है । प्रोटोकॉल का एक प्रवाह चार्ट चित्रा 1में प्रदान की जाती है ।
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तैयारी
- उपयोग करने से पहले RT करने के लिए किट लाओ ।
नोट: 2-8 डिग्री सेल्सियस पर किट स्टोर । - ०.२% के बीच 20 से कम २०० मिलीलीटर पीबीएस वॉश बफर की तैयारी करें । ५०० मिलीलीटर बीकर में १०० मिलीलीटर वॉश बफर की डालें ।
- सीरम नमूने धो बफर के साथ 10x पतला । वितरक के निर्देशों के अनुसार सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें ।
- उपयोग करने से पहले RT करने के लिए किट लाओ ।
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प्रतिदर्श ऊष्मायन
- अभिकर्मक ट्रे (चित्रा 2) की प्रतिक्रिया क्षेत्रों के लिए पूर्व पतला नमूने, सकारात्मक नियंत्रण, या नकारात्मक नियंत्रण के 30 Μl जोड़ें ।
नोट: हवाई बुलबुले से बचें । - Biochip स्लाइड पर सुरक्षात्मक कवर निकालें ।
नोट: की टुकड़ी और स्थिर कोशिकाओं के संदूषण से बचने के लिए biochips स्पर्श न करें । कवर को निकालने से पहले स्लाइड को साथ-साथ रखें । - अभिकर्मक ट्रे (चित्रा 2) के लिए biochip स्लाइड लागू करें । RT पर एक 30 मिनट ऊष्मायन शुरू करो ।
नोट: हर नमूना अन्य बूंदों के साथ मिश्रण के बिना इसी biochip से जुड़ा एक व्यक्ति की छोटी बूंद होना चाहिए. - धीरे से धोने बफर के साथ biochip स्लाइड एक बार कुल्ला । ५०० मिलीलीटर बीकर में बायोचिप स्लाइड में विसर्जित कर दिया धोने के बफर के १०० मिलीलीटर के साथ कम से 5 मिनट के लिए भरा । यदि संभव हो तो एक शेखर पर बीकर प्लेस ।
- बाहर धोने बफर से biochip स्लाइड ले लो । ध्यान से दूर अवशिष्ट धोने बफर एक कागज तौलिया के साथ प्रतिक्रिया क्षेत्रों के बाहर पोंछ । 1-2 मिनट के लिए खुली हवा में biochip स्लाइड बेनकाब करने के लिए प्रतिक्रिया क्षेत्र पर अवशिष्ट धोने बफर लुप्त हो जाना ।
नोट: प्रतिक्रिया क्षेत्रों सूख नहीं है । कागज तौलिया के साथ biochips स्पर्श मत करो ।
- अभिकर्मक ट्रे (चित्रा 2) की प्रतिक्रिया क्षेत्रों के लिए पूर्व पतला नमूने, सकारात्मक नियंत्रण, या नकारात्मक नियंत्रण के 30 Μl जोड़ें ।
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द्वितीयक एंटीबॉडी ऊष्मायन
- वितरक के निर्देशों के अनुसार द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ।
- एक साफ अभिकर्मक ट्रे की प्रतिक्रिया क्षेत्रों के लिए फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के 25 μL जोड़ें ।
- द्वितीयक एंटीबॉडी से भरी हुई अभिकर्मक ट्रे में बायोचिप स्लाइड लागू करें । आरटी में 30 मिनट के लिए इनसेबेट ।
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बढ़ते
- बाहर इस्तेमाल किया धोने बफर डालो और beaker में ताजा धोने बफर के १०० मिलीलीटर जोड़ें । कदम 2.2.4 और 2.2.5 में वर्णित के रूप में धोने दोहराएं ।
- सावधानी से एक biochip स्लाइड पर प्रतिक्रिया क्षेत्रों (प्रतिक्रिया क्षेत्र प्रति एक बूंद) के माध्यम embedding जोड़ें । कवर ग्लास के एक टुकड़े के साथ biochip स्लाइड सील । हवाई बुलबुले से बचें ।
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प्रतिदीप्ति संसूचन
- 15 मिनट के लिए खुर्दबीन और पूर्व गर्मी के फ्लोरोसेंट लैंप पर बारी. एक ४८८ एनएम फिल्टर चुनें ।
- ओपन फोटोग्राफ सॉफ्टवेयर । विभिन्न भव्यता के साथ सभी प्रतिक्रिया क्षेत्रों के transfected और अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों से तस्वीरें ले लो । सबसे पहले, 4x एक सिंहावलोकन के लिए आवर्धन के साथ एक तस्वीर ले लो, तो 10x और 20x भव्यता के साथ और अधिक तस्वीरें ले लो ।
नोट: विस्तृत प्रोटोकॉल तालिका 1में दिखाया गया है । परिणामों की व्याख्या प्रतिनिधि परिणाम खंड में चर्चा की है ।
3. रोगियों का निदान
- यदि रोगी सीरम विरोधी AQP4 IgG-सकारात्मक और कम से पता चलता है NMOSD के एक कोर नैदानिक विशेषता (चर्चा अनुभाग देखें), NMSOD5के साथ रोगी का निदान । हालांकि, अगर रोगी विरोधी AQP4 IgG-नकारात्मक है, NMOSD का निदान बाहर नहीं किया जा सकता है.
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Representative Results
यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करना, विशिष्ट विरोधी AQP4 IgG सीरम में detectable है । प्रक्रिया के दौरान, पूर्व-पतला नमूनों, एक सकारात्मक नियंत्रण, और एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया क्षेत्रों में जोड़ा गया है, जो transfected और अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों (चित्रा 2) होते हैं । एक transfected क्षेत्र में नकारात्मक नियंत्रण के प्रतिदीप्ति मुख्य रूप से biochips पर transfected कोशिकाओं को माध्यमिक एंटीबॉडी के अविशिष्ट बंधन संकेत दिया (चित्रा 3) । समाक्षण दुर्बल प्रतिदीप्ति दिखाई दे रही थी (चित्र 3) । सकारात्मक नियंत्रण के लिए के रूप में, विरोधी AQP4 एंटीबॉडी प्रतिक्रिया क्षेत्र में जोड़ा गया था । Transfected क्षेत्र में मजबूत प्रतिदीप्ति देखा गया था, जो विरोधी AQP4 IgG के विशिष्ट बंधन transfected कोशिकाओं में AQP4-M1 करने के लिए संकेत दिया (चित्रा 4). एक अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्र में सकारात्मक नियंत्रण के प्रतिदीप्ति विरोधी AQP4 IgG के अविशिष्ट बंधन के संकेत biochips पर स्थिर कोशिकाओं को दिखाया (चित्रा 4) । 10x पतला नमूनों के लिए, विरोधी AQP4 IgG-नकारात्मक सीरम एक फ्लोरोसेंट नकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाया, जबकि सकारात्मक सीरम एक सकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाया (चित्रा 5). प्रतिदीप्ति की तीव्रता विरोधी AQP4 IgG titer के साथ जुड़ा हुआ था । प्रतिदीप्ति की विभिन्न तीव्रता के उदाहरण चित्र 5में प्रस्तुत किए गए हैं । चित्रा 5 A और 5B Anti-AQP4 igg-नकारात्मक नमूनों से थे, जबकि चित्र 5C-H एंटी-AQP4 igg-positive नमूनों से थे । जब तक विषमांगी और दानेदार प्रतिदीप्ति के रूप में transfected क्षेत्रों में दिखाई दिया, नमूना विरोधी माना जाता था AQP4 IgG-सकारात्मक, प्रतिदीप्ति की शक्ति की परवाह किए बिना. NMOSD के लिए नैदानिक मानदंड, जो सीरम विरोधी AQP4 IgG पर आधारित है, आगे चर्चा अनुभाग में वर्णित किया जाएगा ।
कुछ नमूनों में, केवल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या दृढ़ता से transfected क्षेत्रों में दाग था, और यह निर्धारित करना मुश्किल था कि क्या सीरम विरोधी AQP4 IgG-सकारात्मक या नकारात्मक (चित्रा 6) था । इस मामले में, "संभावित सकारात्मक" रिपोर्ट किया जा सकता है । दुर्लभ मामलों में, एक नमूना के प्रतिदीप्ति क्षेत्रों में transfected था समरूप क्षेत्रों की तुलना में मजबूत (चित्रा 7) । इस मामले में, नमूना विरोधी AQP4 IgG-नकारात्मक के रूप में माना जाना चाहिए. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की उच्च तीव्रता गैर विशिष्ट हो सकता है । एक विश्वसनीय रिपोर्ट बनाने के लिए, सभी तस्वीरों को आंख बंद करके मूल्यांकन किया जाना चाहिए कम से दो चिकित्सकों द्वारा । नैदानिक विशेषज्ञों को मूल्यांकन से पहले प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में, वे विभिंन नमूना प्रकार के प्रतिनिधि तस्वीरें दिखाए गए थे और कैसे परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए के रूप में सूचित किया गया । फिर, वे एक अनुभवी चिकित्सक के साथ एक साथ तस्वीरों का मूल्यांकन किया । अंत में, प्रशिक्षित चिकित्सकों स्वतंत्र रूप से काम किया । एक आदर्श स्थिति में, यह हमेशा एक ही चिकित्सकों जो परिणाम का मूल्यांकन होना चाहिए ।
चित्रा 1 : एंटी-AQP4 IgG डिटेक्शन प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट । AQP4-M1-transfected या अनट्रांसफेक्टेड यूरोपीय संघ ९० कोशिकाओं biochips पर तय कर रहे हैं । जब biochips करने के लिए सीरम जोड़ने, विरोधी AQP4 IgG सीरम में तय transfected कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया है । फिर, fluorescein-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने के लिए लागू किया जाता है । प्रतिदीप्ति विभिन्न भव्यता के साथ माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : नमूना ऊष्मायन । (क) अभिकर्मक ट्रे का शीर्ष दृश्य । हर अभिकर्मक ट्रे पांच व्यक्तिगत प्रतिक्रिया क्षेत्रों में शामिल हैं । धनात्मक नियंत्रण, नमूने, और ऋणात्मक नियंत्रण अलग प्रतिक्रिया फ़ील्ड में जोड़ा जाना चाहिए । (ख) बायोचिप स्लाइड का शीर्ष दृश्य । हर बायोचिप स्लाइड में पांच रिएक्शन फील्ड्स होते हैं, जिनमें दो उपसेक्शन होते हैं । ट्रांसफेक्टेड उप-खंड में स्थिर AQP4-M1-transfected कक्ष होते हैं, जबकि अनट्रांसफेक्टेड उप-खंड में अनट्रांसफेक्टेड कक्ष होते हैं. (ग) अभिकर्मक ट्रे और बायोचिप स्लाइड का फ्रंट व्यू । अभिकर्मक ट्रे और biochip स्लाइड पर प्रतिक्रिया क्षेत्रों एक दूसरे के साथ बनती हैं । नमूना अभिकर्मक ट्रे पर प्रतिक्रिया क्षेत्र के लिए जोड़ा biochip स्लाइड पर इसी प्रतिक्रिया क्षेत्र से जुड़ा होना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि आंकड़े । (ं) 4x आवर्धन माइक्रोस्कोपी द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के transfected क्षेत्र का अवलोकन प्राप्त किया गया था । पूरे क्षेत्र में समाक्षण दुर्बल प्रतिदीप्ति देखी गई । (ख, ग) 10x (B) और x (C) आवर्धन फोटोग्राफ में अधिक विवरण देखे गए । सामान्यतः कोशिका झिल्ली और प्लाज्मा में थोड़ा दाग होता था और कोशिका का नाभिक अनसना होता था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि आंकड़े । (क, ख) Transfected (क) और अनट्रांसफेक्टेड (ख) धनात्मक नियंत्रण के क्षेत्र दर्शाए गए हैं । समरूप कमजोर प्रतिदीप्ति को अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों में पाया गया, जो स्थिर कोशिकाओं के लिए anti-AQP4 IgG के अविशिष्ट बाइंडिंग का संकेत देता है । इसके विपरीत, विषमजातीय मजबूत प्रतिदीप्ति को transfected क्षेत्रों में मनाया गया, AQP4 IgG के विशिष्ट बाध्यकारी AQP4-M1 निश्चित कोशिकाओं पर व्यक्त करने के लिए संकेत । (ग-च) (ग, ङ) और अनट्रांसफेक्टेड (डी, एफ) क्षेत्रों का अधिक विवरण 10X (c, d) या 20x (E, f) आवर्धन के साथ मनाया जाता है । कमजोर और यहां तक कि प्रतिदीप्ति भी अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों में दिखाई दिया । हालांकि, transfected क्षेत्रों में कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत तीव्र प्रतिदीप्ति दिखाया । दृढ़ता से दाग कोशिकाओं के प्लाज्मा में, विरोधी AQP4 IgG चिकनी और दानेदार प्रतिदीप्ति दिखाया । कोशिका केंद्रक अनसना या थोड़ा दाग था. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : विरोधी AQP4 एंटीबॉडी नकारात्मक या सकारात्मक नमूनों के लिए प्रतिनिधि आंकड़े । नमूनों 10x पतला थे, और सभी दिखाया आंकड़े एक 10x उद्देश्य के साथ ले जाया गया । (क, ख) ऋणात्मक प्रतिदीप्ति प्रतिदर्श: प्रतिदीप्ति, दोनों में (ं) अनुपादी तथा(इ) अपरिरूपी क्षेत्रों में समाक्षण रूप से दुर्बल थी । (ग, घ) कमजोर प्रतिदीप्ति नमूना: जब अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों (डी) के साथ तुलना में, कोशिकाओं की एक छोटी राशि (लगभग 25% से ५०%) transfected क्षेत्रों में (ग) और अधिक तीव्र प्रतिदीप्ति दिखाया । (ङ, च) मॉडरेट प्रतिदीप्ति प्रतिदर्श: प्रतिसंक्रामक क्षेत्रों में (इ), मजबूत दानेदार प्रतिदीप्ति कोशिकाओं की मध्यम मात्रा में पाई गई (लगभग ५०% से ७५%) । (छ, ज) मजबूत प्रतिदीप्ति नमूना: अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों (एच) में कोशिकाओं को कमजोर दाग थे । हालांकि, transfected क्षेत्रों (जी) में, उच्च तीव्रता के साथ दानेदार प्रतिदीप्ति (लगभग ७५% से अधिक) कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में दिखाई दिया । आम तौर पर, विरोधी AQP4 igg के अनुमापांक के रूप में वृद्धि हुई, दोनों प्रतिदीप्ति तीव्रता और दृढ़ता से दाग कोशिकाओं के प्रतिशत तदनुसार ऊंचा उठाया । अनिविष् टेड क्षेत्रों की प्रतिदीप्ति हमेशा ही कमजोर थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 : विरोधी के लिए प्रतिनिधि आंकड़े AQP4 एंटीबॉडी "संभावित सकारात्मक" नमूने । (क, ख) प्रतिदीप्ति पैटर्न में कोई महत्वपूर्ण अंतर transfected (एक) और अनट्रांसफेक्टेड (ख) क्षेत्रों 4x आवर्धन के बीच देखा गया । (सी-ई) 10x (c, D) या 20X (E, F) आवर्धन के साथ, transfected क्षेत्रों में कुछ कोशिकाओं (सी, ई) मजबूत दानेदार प्रतिदीप्ति दिखाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7 : Untypical विरोधी AQP4 IgG-नकारात्मक नमूना का उदाहरण । दोनों transfected (एक) और अनट्रांसफेक्टेड (ख) क्षेत्रों homogeneously दाग थे । हालांकि, transfected क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों की तुलना में मजबूत था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| आवर्धन | प्रतिफेस्टेड क्षेत्र | अपरिविष् टेड क्षेत्र |
| 4x | 1 चित्र | 1 चित्र |
| 10x | 4 चित्र | 1 चित्र |
| 00: | 5 चित्र | 1 चित्र |
तालिका 1: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । यह 4x, 10x का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, और transfected और अनट्रांसफेक्टेड क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए 20x उद्देश्यों ।
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Discussion
हम मानव सीरम में विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ विधि का वर्णन किया है । Anti-AQP4 IgG बारीकी से NMOSD से संबंधित है, और एक विश्वसनीय विरोधी AQP4 IgG डिटेक्शन विधि की स्थापना NMOSD के नैदानिक निदान के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे पहले, विरोधी AQP4 IgG NMOSD के लिए विशिष्ट है । मल्टीपल स्क्लेरोसिस भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोग है और NMOSD12के साथ कई समानताएं साझा करता है । हालांकि, विरोधी AQP4 IgG केवल NMOSD13में सकारात्मक है । दूसरा, विरोधी AQP4 IgG NMOSD रोगियों के बीच आम है । NMOSD रोगियों के लगभग दो तिहाई सीरम विरोधी AQP4 IgG-सकारात्मक4हैं । तीसरा, NMOSD के लिए सबसे हाल ही में निदान मापदंड सीरम विरोधी AQP4 IgG परीक्षण5पर आधारित है । एक साथ लिया, सीरम विरोधी AQP4 IgG पता लगाने NMOSD के नैदानिक निदान की सुविधा सकता है.
विभिंन विरोधी AQP4 igg का पता लगाने के तरीकों में, cba व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता6,7के कारण नैदानिक निदान के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि CBA एक त्वरित और सरल तरीका है, कुछ प्रमुख बिंदुओं को संबोधित किया जाना चाहिए । पहले, experimenters सावधान किया जाना चाहिए जब biochips के साथ काम कर रहा है, के रूप में AQP4-M1-transfected और अनट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं biochips पर तय कर रहे हैं । पूरी प्रक्रिया के दौरान, biochips हाथ से छुआ या बाहर सूख नहीं होना चाहिए । इसके अतिरिक्त, biochips के साथ स्लाइड धीरे संभाला जाना चाहिए, अंयथा biochips पर निश्चित कोशिकाओं नीचे गिर या दूषित हो सकता है, जो प्रतिदीप्ति दोषपूर्ण क्षेत्रों या एक उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि में परिणाम हो सकता है । दूसरा, जब अभिकर्मक ट्रे पर प्रतिक्रिया क्षेत्रों के लिए नमूने जोड़ने, शोधकर्ताओं ने यह सुनिश्चित करना चाहिए कि नमूनों की बूंदों एक दूसरे के साथ मिश्रित नहीं कर रहे हैं । नमूनों और biochips के बीच हवा बुलबुले से बचना चाहिए ।
इस विधि की सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, विरोधी AQP4 igg का पता लगाने के लिए cba का उपयोग करते समय, यह प्रतिदीप्ति तीव्रता यों तो और सीरम में विरोधी AQP4 igg अनुमापांक का वर्णन करने के लिए कठिन है. वर्तमान में, हमारे नैदानिक केंद्र में, प्रतिदीप्ति की तीव्रता व्यक्तिपरक नमूनों बनाम नियंत्रण की तस्वीरों की तुलना के बाद दो चिकित्सकों द्वारा सूचित किया जाता है । ज्यादातर मामलों में, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सीरम विरोधी AQP4 IgG-सकारात्मक या नकारात्मक है मुश्किल नहीं है । हालांकि, दुर्लभ मामलों में, नमूनों से प्रतिदीप्ति नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में केवल थोड़ा मजबूत लग सकता है, और नमूना "संभावित सकारात्मक" माना जाता है । इस स्थिति में, चिकित्सकों निदान करने में अधिक सावधान रहना चाहिए । एक और संभव समाधान CBA दोहरा रहा है । प्रतिदीप्ति की तीव्रता और "एंटी-AQP4 IgG-positive" की एक अंतरराष्ट्रीय परिभाषा को निर्धारित करने के लिए एक अधिक सटीक विधि warranted रहे हैं । विशेष रूप से, मस्तिष्कमेरु द्रव में anti-AQP4 igg की सकारात्मक दर सीरम की तुलना में बहुत कम है, और मस्तिष्कमेरु द्रव में विरोधी AQP4 igg के लिए परीक्षण जानकारीपूर्ण नहीं है14,15.
CBA दोनों नैदानिक निदान और NMOSD के वैज्ञानिक अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है । NMOSD के नैदानिक निदान नैदानिक अभिव्यक्तियाँ, सीरम विरोधी AQP4 IgG, और neuroradiological निष्कर्षों के संयोजन के आधार पर किया जाता है. सीरम anti-AQP4 IgG-NMOSD के कम से एक कोर नैदानिक विशेषता के साथ सकारात्मक रोगियों NMOSD5के साथ का निदान किया जा सकता है; हालांकि, अगर रोगी विरोधी AQP4 igg-नकारात्मक, nmosd का निदान5बाहर नहीं किया जाना चाहिए, और चिकित्सकों आगे नैदानिक अभिव्यक्तियाँ और neuroradiological निष्कर्षों का मूल्यांकन करना चाहिए5,16,17 . सीरम myelin ओलिगोडेन्ट्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन एंटीबॉडी निदान18,19,20की सहायता करने के लिए पाया जा सकता है । विशेष रूप से, हालांकि सीरम विरोधी AQP4 igg अनुमापांक रित्क्षीब उपचार21के साथ बदला जा सकता है, यह रोग पाठ्यक्रम और प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी नहीं है22,23immunotherapy. CBA भी व्यापक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, यांग एट अल24 विरोधी AQP4 igg-सकारात्मक NMOSD रोगियों की नैदानिक सुविधाओं का वर्णन किया । इसके अतिरिक्त, kitley एट अल.25 विरोधी AQP4 igg-सकारात्मक nmosd रोगियों के लिए25शकुन कारकों का विश्लेषण किया । दोनों अध्ययनों CBA सीरम विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया ।
सारांश में, CBA एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि विरोधी AQP4 IgG का पता लगाने और नैदानिक निदान और NMOSD के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (no. ३१६००८२०), जिलइन प्रांत के स्वास्थ्य और परिवार नियोजन आयोग (no. 2016Q036) से अनुदान से सहायता के लिए आभारी हैं, और जिलइन प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (सं. 20180520110JH) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. |
| CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A | photograph software |
| Gel & clot activator tube | Improve medical | 623040202 | From a local Chinese company |
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