Summary
Ensayo basado en células es un método ampliamente utilizado para detectar la inmunoglobulina del suero de anti-Acuaporina-4 G. Este método podría aplicarse a diagnóstico clínico y las investigaciones científicas de los trastornos del espectro óptico de Neuromielitis óptica.
Abstract
Anti-Acuaporina-4 (AQP4) inmunoglobulina G (IgG) es el biomarcador diagnóstico base para trastornos del espectro de Neuromielitis optica (NMOSD). El ensayo celular (CBA) es un método ampliamente utilizado para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano con alta sensibilidad y especificidad. Brevemente, suero IgG anti-AQP4 es captada por células transfected AQP4 que es fijo en el biochip entonces detectado por un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína. Microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar la fluorescencia, y la intensidad de fluorescencia es evaluada por al menos dos médicos experimentados. Puede hacer un diagnóstico definitivo de NMOSD basado en la combinación de resultados de detección de IgG anti-AQP4, manifestaciones clínicas y resultados neuroradiological. Según estudios previos, CBA es más sensible y específico que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4, y puede ser aplicado al diagnóstico clínico y estudios de NMOSD. El método tiene limitaciones; por ejemplo, todavía carece de una escala internacional para evaluar los títulos de IgG del suero anti-AQP4. Aquí, se describe un protocolo detallado para la detección de IgG anti-AQP4 suero humano utilizando CBA.
Introduction
Suero IgG de AQP4 es un biomarcador diagnóstico base para Neuromielitis optica espectro trastornos (NMOSD)1. El ensayo celular (CBA) es un método de detección de IgG anti-AQP4 ampliamente utilizado con alta sensibilidad y especificidad. Aquí, se presenta un protocolo detallado para el CBA.
AQP4, una proteína de canal de agua, tiene seis unidades que atraviesan la membrana y dos dominios helicoidales rodeando uno acuoso poro2. IgG anti-AQP4 es implicar en la patogenesia de NMOSD mediante el enlace a su objetivo de AQP4, que se encuentra principalmente en el endfeet de astrocitos3. Se ha demostrado que la IgG anti-AQP4 es positiva en aproximadamente dos tercios de NMOSD pacientes4. En los más recientes criterios de diagnóstico internacionales para NMOSD, IgG anti-AQP4 se considera un núcleo biomarcador diagnóstico5. En este sentido, es crucial para establecer un protocolo confiable para la detección de suero humano IgG anti-AQP4 y facilitar el diagnóstico clínico de NMOSD.
Actualmente, varios métodos de detección de IgG anti-AQP4 están disponibles, como CBA, análisis de tejidos, análisis enzima-ligado del inmunosorbente y flujo cytometry6,7. CBA emplea EU90 células, que son transfectadas con AQP4 humana, captar IgG anti-AQP4. La IgG anti-AQP4 capturado es detectada por anticuerpos fluorescentes de secundarios y posteriormente visualizada por microscopía. La acumulación de pruebas ha demostrado que la CBA es más sensible y específico que otros anti-AQP4 IgG detección métodos6,7. Según un meta-análisis, la sensibilidad y especificidad de la CBA se demostró que el 76% y 99%, que fueron superior a base de tejido y análisis de la enzima-ligado del inmunosorbente6. Además, una comparación multicéntrica de diagnóstico análisis de IgG anti-AQP4 fue llevado a cabo7. Un total de 193 estudio temas de 15 centros diagnóstico europeos fueron inscritos7. Se utilizaron cuatro métodos distintos para la detección de IgG del suero anti-AQP47. Se demostró que el CBA fue más sensible y específico que otros métodos7. AQP4 es expresada como dos isoformas principales (AQP4-M1 y AQP4 M23), celular de captura de IgG anti-AQP4 es transfected con AQP4-M1 o AQP4 M23. Sin embargo, qué tipo de célula de captura es mejor sigue siendo controvertido. Una investigación ha apoyado AQP4-M1 base CBA8, mientras que otros han indicado que AQP4 M23 basado en CBA es mejor7,9,10. Sin embargo, AQP4 M23 basado en CBA puede producir resultados falsos positivos debido a la no específica IgG enlace8. Jarius et al.. 11 informó que no hubo ninguna diferencia significativa en las tasas de detección de IgG anti-AQP4 entre M1 de AQP4 y AQP4 M23 basado en CAD.
En Resumen, suero anti-AQP4 IgG es un biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tiene mayor especificidad y sensibilidad que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4. Sigue siendo polémico si la AQP4-M1 o AQP4 M23-basado en CBA es mejor. En este artículo, se describe un protocolo detallado para CBA AQP4 M1-basada, que puede aplicar a diagnóstico clínico y estudios de NMOSD.
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Protocol
Este procedimiento fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad del primer Hospital de Jilin y se realizó en aproximadamente 1.500 temas.
1. paciente inscripción y recogida de muestras de sangre
- Aplicar la detección de laboratorio del suero de que IgG anti-AQP4 en pacientes de la clínica con las principales quejas y los síntomas enumerado a continuación. Realizar exámenes físicos también.
Neuritis óptica: pacientes sufren déficits visuales, tales como pérdida de campos visuales y reducción de la agudeza visual.
Mielitis aguda: los pacientes pueden presentar con parálisis, déficits sensoriales y disfunción autonómica.
Síndrome del área postrema: los pacientes pueden tener síntomas de hipo e inexplicable, náuseas o vómitos.
Síndrome de médula oblonga aguda: lesiones del médula oblonga pueden resultar en diferentes síntomas y signos dependiendo de la localización de las lesiones.
Narcolepsy sintomático o agudo diencefálico síndrome clínico con lesiones diencefálicas NMOSD típico del MRI.
Síndrome cerebral sintomático con NMOSD típicas lesiones cerebrales.
Nota: Según los criterios diagnósticos de consenso internacional para NMOSD5, se puede hacer un diagnóstico de NMOSD si el paciente es el suero anti-AQP4 IgG positivo y cuenta con al menos una de las características clínicas fundamentales mencionados anteriormente. Sin embargo, no recomendamos pruebas de IgG anti-AQP4 en pacientes con neuritis óptica solamente. -
Recogida de muestras de sangre
Nota: pacientes no es necesario ser ayuno.- Dibujar 2-3 mL de sangre venosa en un tubo de colección de sangre vacío de 4 mL.
- Permita que el suero coagule durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
Nota: Coagulación prolongado puede aumentar niveles séricos debido a la pérdida de plaquetas. - Centrífuga a 2100 x g por 5 min transferir cuidadosamente el suero a un tubo nuevo.
- Analizar el suero inmediatamente o alícuota y almacenar a -20 ó -80 º C.
Nota: Almacenamiento a-20 ° C es para el almacenamiento de meses, mientras que es de-80 ° C para almacenamiento de años.
2. anti-AQP4 detección del anticuerpo
PRECAUCIÓN: Las muestras y los reactivos del kit utilizado deben considerarse material infeccioso. Reactivos que contienen azida de sodio en el kit son tóxicos. Un diagrama de flujo del Protocolo se proporciona en la figura 1.
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Preparación
- Llevar el kit a RT antes del uso.
Nota: Guarde el juego a 2-8 ° C. - Preparar por lo menos 200 mL de tampón de lavado PBS que contenía 0,2% Tween 20. Vierta 100 mL de tampón de lavado en un vaso de precipitados de 500 mL.
- Diluir el suero muestras 10 x tampón de lavado. Preparar los controles positivos y negativos según las instrucciones del distribuidor.
- Llevar el kit a RT antes del uso.
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Incubación de la muestra
- Añadir 30 μL las muestras diluidas previamente control positivo y control negativo a los campos de reacción de la bandeja de reactivo (figura 2).
Nota: Evitar las burbujas de aire. - Retire la cubierta protectora en las diapositivas del biochip.
Nota: No toque los biochips para evitar el desprendimiento y la contaminación de las células fijas. Mantenga el lado a lado de la diapositiva antes de quitar la tapa. - La diapositiva del biochip se aplican a la bandeja de reactivo (figura 2). Iniciar una incubación de 30 min a TA.
Nota: Cada muestra debe ser una gota individual conectado al biochip correspondiente sin mezclar con otras gotitas. - Suavemente le enjuagar el portaobjetos biochip una vez con tampón de lavado. Sumerja el portaobjetos de biochips en el vaso de 500 mL con 100 mL de tampón de lavado durante al menos 5 min lugar el vaso en un agitador y si es posible.
- Sacar el portaobjetos de biochip del tampón de lavado. Cuidadosamente Limpie el tampón de lavado residual fuera de los campos de reacción con una toalla de papel. Exponga la diapositiva biochip aire libre 1-2 minutos que se evapore el tampón de lavado residual en el campo de la reacción.
Nota: No seque hacia fuera de los campos de reacción. No toque los biochips con toalla de papel.
- Añadir 30 μL las muestras diluidas previamente control positivo y control negativo a los campos de reacción de la bandeja de reactivo (figura 2).
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Incubación del anticuerpo secundario
- Preparar la solución de anticuerpo secundario según las instrucciones del distribuidor.
- Añada 25 μl del anticuerpo secundario fluorescente a los campos de reacción de una bandeja de reactivo limpio.
- La diapositiva del biochip se aplican a la bandeja de reactivo cargada con anticuerpo secundario. Incubar durante 30 min a TA.
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Montaje
- Derramar el tampón de lavado usado y añadir 100 mL de tampón de lavado fresco en el vaso. Repita el lavado como se describe en los pasos 2.2.4 y 2.2.5.
- Cuidadosamente añadir medio de inclusión a los campos de reacción en una diapositiva de biochip (una gota por campo de reacción). Sello de la diapositiva del biochip con una pieza de vidrio de cubierta. Evitar las burbujas de aire.
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Detección de fluorescencia
- Encender la lámpara fluorescente del microscopio y precalentamiento para elegir un filtro nm 488 a 15 minutos.
- Software de fotografía abierta. Tomar fotografías de zonas transfected y untransfected de todos los campos de reacción con diferentes aumentos. Primero, tome una foto con 4 aumentos para tener una visión general, luego tomar más fotografías con x 10 y 20 aumentos x.
Nota: El protocolo detallado se muestra en la tabla 1. Interpretación de los resultados se discute en la sección de resultados representativos.
3. diagnóstico de los pacientes
- Si el paciente es el suero anti-AQP4 IgG positivo y muestra al menos una característica clínica central de NMOSD (véase la sección discusión), diagnosticar al paciente con NMSOD5. Sin embargo, si el paciente es anti-AQP4 IgG negativo, una diagnosis de NMOSD puede no ser excluido.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento descrito aquí, IgG específica anti-AQP4 en suero es detectable. Durante el procedimiento, las muestras, un control positivo y control negativo fueron agregados a los campos de reacción, que contienen áreas transfected y untransfected (figura 2). Fluorescencia del control negativo en un área de transfected indica principalmente la Unión inespecífica del anticuerpo secundario a las células transfected en biochips (figura 3). Homogéneo débil fluorescencia fue visible (figura 3). En cuanto al control positivo, anticuerpos anti-AQP4 fue agregado en el campo de la reacción. Fuerte fluorescencia se observó en el área transfected, que indica la unión específica de IgG anti-AQP4 a M1 de AQP4 en las células transfected (figura 4). Fluorescencia del control positivo en una zona untransfected demostró consejos de Unión inespecífico de IgG anti-AQP4 células fijas en biochips (figura 4). 10 x las muestras diluidas, anti-AQP4 IgG negativo suero demostró un patrón fluorescente similar a la del control negativo, mientras que el suero positivo mostró un patrón similar del control positivo (figura 5). La intensidad de la fluorescencia se asoció con el título de IgG anti-AQP4. Ejemplos de diferente intensidad de la fluorescencia se presentan en la figura 5. Figura 5 A y 5B fueron de anti-AQP4 muestras de IgG negativo, mientras que figura 5C-H fueron de muestras de IgG positivo anti-AQP4. Como fluorescencia granular y heterogénea apareció en áreas transfected, la muestra se consideró anti-AQP4 IgG positivo, independientemente de la intensidad de la fluorescencia. Los criterios de diagnóstico para NMOSD, que se basa en el suero anti-AQP4 IgG, se describirán más en la sección de discusión.
En algunas muestras, sólo un pequeño número de células se tiñó fuertemente en áreas transfected, y era difícil determinar si el suero anti-AQP4 IgG positivo o negativo (figura 6). En este caso, puede indicarse "probable positivo". En casos más raros, la fluorescencia de una muestra en áreas transfected era homogéneo más fuerte que en áreas untransfected (figura 7). En este caso, la muestra debe considerarse como negativo IgG anti-AQP4. La alta intensidad de fluorescencia de fondo puede ser inespecífica. Para crear un informe confiable, todas las fotografías deben evaluarse ciegamente por al menos dos médicos. Los clínicos deben ser entrenados antes de la evaluación. En este protocolo, mostraron fotografías representativas de tipos diferentes de la muestra y fueron informados en cuanto a cómo evaluar los resultados. Luego, evaluaron fotografías junto con un médico experimentado. Por último, los clínicos entrenados trabajaban independientemente. En una situación ideal, debe ser siempre el mismo médicos que evaluación los resultados.
Figura 1 : Diagrama de flujo del Protocolo de detección de IgG anti-AQP4. AQP4-M1-transfected o untransfected UE 90 células se fijan en los biochips. Cuando se agrega suero de biochips, IgG anti-AQP4 en suero es captada por las células transfected fijadas. Entonces, el anticuerpo secundario marcado con fluoresceína se aplica para la detección de IgG anti-AQP4. La fluorescencia puede visualizarse por microscopía con diferentes aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Incubación de la muestra. (A) vista superior de la bandeja de reactivos. Cada bandeja de reactivo contiene cinco campos de reacción individual. El control negativo, control positivo y las muestras se deben agregar a los campos de reacción independientes. (B) vista superior de la diapositiva del biochip. Cada diapositiva de biochip contiene cinco campos de reacción, que tienen dos subdivisiones. La subsección transfected contiene fijadas AQP4-M1-transfected las células, mientras que la subsección untransfected contiene células untransfected. Vista frontal de (C) de la bandeja y biochips diapositiva de reactivo. Campos de reacción en la corredera de la bandeja y biochips de reactivo se aparean entre sí. La muestra de agregado en el campo de la reacción en la bandeja de reactivos debe conectarse en el campo correspondiente de la reacción de la diapositiva del biochip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Figuras representativas para control negativo. (A) un resumen de la zona transfected del control negativo se obtuvo por 4 x microscopio de aumento. Se observó fluorescencia homogéneo débil en toda la zona. (B, C) Más detalles se observaron en 10 x (B) y x (C) fotografías de aumento. Generalmente, la membrana de la célula y el plasma fueron ligeramente manchados, y el núcleo de la célula era sin mancha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Figuras representativas para control positivo. (A, B) Se muestran transfected (A) y (B) untransfected de control positivo. Homogéneo débil fluorescencia fue observada en áreas untransfected, indicando la Unión inespecífica de IgG anti-AQP4 células fijas. Por el contrario, fluorescencia fuerte heterogénea se observó en zonas transfected, indicando la unión específica de IgG anti-AQP4 en AQP4-M1 presentes en las células fijas. (C-F) Se observan más detalles de transfected (C, E) y untransfected (D, F) zonas con 10 x (C, D) o 20 x aumentos (E, F). Fluorescencia débil e incluso apareció en áreas untransfected. Sin embargo, un gran porcentaje de células en áreas transfected demostró intensa fluorescencia. En el plasma de células fuertemente, IgG anti-AQP4 demostró fluorescencia granular y lisa. El núcleo de la célula fue sin mancha o ligeramente teñido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Figuras representativas para las muestras de negativos o positivos de anticuerpos anti-AQP4. Las muestras fueron 10 x diluido, y todas las figuras que se muestran fueron tomadas con un objetivo de 10 x. (A, B) Muestra negativa de fluorescencia: la fluorescencia fue homogéneo débil en ambos (A) transfectadas y (B) untransfected áreas. (C, D) Muestra fluorescencia débil: en comparación con áreas untransfected (D), una pequeña cantidad de células (aproximadamente 25% a 50%) en zonas de transfected (C) demostradas fluorescencia más intensa. (E, F) Muestra fluorescencia moderada: en áreas transfected (E), se observó fuerte fluorescencia granular en una cantidad media de las células (aproximadamente 50% a 75%). (G, H) Muestra fluorescencia fuerte: células en áreas untransfected (H) débil fueron manchadas. Sin embargo, en áreas transfected (G), fluorescencia granular con de intensidad alta apareció en un gran número de células (aproximadamente más del 75%). En general, a medida que aumenta la concentración de IgG anti-AQP4, intensidad de fluorescencia y el porcentaje de células fuertemente elevan correspondientemente. La fluorescencia de áreas untransfected siempre fue homogéneamente débil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Figuras representativas para las muestras de "probable positivo" de anticuerpos anti-AQP4. (A, B) No hubo diferencias significativas en los patrones de fluorescencia se observaron entre transfected (A) y (B) untransfected con 4 aumentos. (C-E) Con 10 x (C, D) o 20 x (E, F) aumento, algunas células en áreas transfected (C, E) demostradas fuerte fluorescencia granular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Ejemplo de anti-AQP4 atípico IgG negativo muestra. Transfected (A) y untransfected (B) áreas homogéneamente fueron manchadas. Sin embargo, la fluorescencia en áreas transfected era más fuerte que en las zonas untransfected. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ampliación | Zona transfected | Zona untransfected |
| 4 x | 1 cuadro | 1 cuadro |
| 10 x | 4 cuadros | 1 cuadro |
| 20 x | 5 fotografías | 1 cuadro |
Tabla 1: microscopía de fluorescencia. Se recomienda utilizar 4 x, 10 x y 20 x objetivos para la proyección de imagen de transfected y untransfected.
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Discussion
Hemos descrito un método ampliamente accesible para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano. IgG anti-AQP4 se relaciona estrechamente con NMOSD y establecer un método de detección de IgG anti-AQP4 confiable es crucial para el diagnóstico clínico de NMOSD. En primer lugar, la IgG anti-AQP4 es específico para NMOSD. Esclerosis múltiple es una enfermedad mediada inmune del sistema nervioso central y comparte muchas similitudes con NMOSD12. Sin embargo, IgG anti-AQP4 es sólo positiva en NMOSD13. En segundo lugar, es común entre los pacientes NMOSD IgG anti-AQP4. Aproximadamente dos tercios de los pacientes NMOSD son suero anti-AQP4 IgG positivo4. En tercer lugar, los criterios de diagnóstico más reciente para NMOSD está basado en suero de anti-AQP4 IgG prueba5. Tomados en conjunto, la detección de IgG de suero anti-AQP4 podría facilitar el diagnóstico clínico de NMOSD.
Entre varios métodos de detección de IgG anti-AQP4, CBA es ampliamente utilizado para el diagnóstico clínico debido a su alta sensibilidad y especificidad6,7. Aunque la CBA es un método rápido y sencillo, deben abordar algunos puntos clave. En primer lugar, experimentadores se deben tener cuidadosos cuando se trabaja con biochips, como untransfected y AQP4-M1-transfected las células se fijan en los biochips. Durante todo el procedimiento, biochips no ser tocados con la mano o desecados. Además, diapositivas con biochips deben manipularse con cuidado, de lo contrario las células fijas de los biochips pueden caer o contaminadas, que puede resultar en zonas defectuosas de la fluorescencia o un fondo fluorescente alta. En segundo lugar, al añadir las muestras a los campos de reacción en la bandeja del reactivo, los investigadores deben asegurarse de que las gotas de las muestras no se mezclan entre sí. Deben evitarse las burbujas de aire entre las muestras y los biochips.
Este método tiene limitaciones; por ejemplo, cuando se utiliza CBA para detectar IgG anti-AQP4, es difícil de cuantificar la intensidad de fluorescencia y describir el título de IgG anti-AQP4 en el suero. Actualmente, en nuestro centro de diagnóstico, la intensidad de fluorescencia subjetivamente divulga por dos clínicos después de comparar fotografías de controles de muestras vs. . En la mayoría de los casos, no es difícil determinar si el suero anti-AQP4 IgG positivo o negativo. Sin embargo, en casos raros, la fluorescencia de las muestras puede parecer sólo un poco más fuerte que el control negativo, y la muestra se considera "probable positivo". En esta situación, los clínicos deben ser más cuidadosos en la elaboración de un diagnóstico. Otra posible solución es repetir la CBA. Un método más preciso para cuantificar la intensidad de fluorescencia y una definición internacional de "Anti-AQP4 IgG positivo" está garantizado. En particular, la tasa positiva de IgG anti-AQP4 en líquido cerebroespinal es mucho menor que en el suero y la prueba para IgG anti-AQP4 en líquido cerebroespinal no es informativo14,15.
CBA se puede aplicar a diagnóstico clínico y los estudios científicos de NMOSD. Diagnóstico clínico de NMOSD se hace basado en la combinación de manifestaciones clínicas, suero IgG anti-AQP4 y resultados neuroradiological. Suero anti-AQP4 IgG-pacientes positivos y con al menos una base clínica NMOSD pueden ser diagnosticados con NMOSD5; sin embargo, si el paciente es anti-AQP4 IgG negativo, una diagnosis de NMOSD no debe ser excluido5, y los clínicos deben evaluar las manifestaciones clínicas y resultados neuroradiological5,16,17 . Anticuerpo del suero del myelin oligodendrocyte glicoproteína puede detectarse para asistir a la diagnosis18,19,20. En particular, aunque el título de IgG del suero anti-AQP4 se puede cambiar con rituximab tratamiento21, no es predictivo del curso de la enfermedad y la respuesta a la inmunoterapia22,23. CBA es también ampliamente utilizado para la investigación científica. Por ejemplo, Yang et al.24 se describen las características clínicas de pacientes IgG positivo NMOSD de anti-AQP4. Adicionalmente, Kitley et al25 analizó los factores pronósticos para anti-AQP4 IgG positivo NMOSD pacientes25. Ambos estudios utilizaron CBA para detectar suero IgG anti-AQP4.
En Resumen, el CBA es un método ampliamente utilizado para la detección de IgG anti-AQP4 y se puede aplicar a diagnóstico clínico y la investigación científica de NMOSD.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecemos el apoyo de becas de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 31600820), la salud y la Comisión de planificación familiar de la provincia de Jilin (no. 2016Q036) y la ciencia y tecnología de planificación de proyecto de la provincia de Jilin (Nº 20180520110JH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. |
| CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A | photograph software |
| Gel & clot activator tube | Improve medical | 623040202 | From a local Chinese company |
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