Summary
تحليل يستند إلى الخلية أسلوب مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن مصل الغلوبولين المناعي المضادة-أكوابورين-4 غ. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب للتشخيص السريري والأبحاث العلمية من اضطرابات الطيف البصري المياليني.
Abstract
غلوبيولين مناعي المضادة-أكوابورين-4 (AQP4) ز (IgG) هو العلامات البيولوجية الأساسية التشخيصية لاضطرابات الطيف البصري المياليني (نموسد). تحليل يستند إلى الخلية (CBA) أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لكشف مفتش مكافحة AQP4 في مصل الدم البشري مع حساسية عالية وخصوصية. بإيجاز، المصل مفتش مكافحة AQP4 يتم التقاطها بواسطة الخلية AQP4 transfected ثابتة على biochip ثم الكشف عنها بواسطة جسم ثانوي المسمى فلوريسسين. يستخدم مجهر الأسفار لتصور الأسفار، وشدة الأسفار يتم تقييمها من قبل اثنين على الأقل من الأطباء ذوي الخبرة. يمكن إجراء تشخيص نهائي من نموسد تقوم على المزيج من AQP4 المضادة IgG الكشف عن النتائج والمظاهر السريرية والنتائج نيوروراديولوجيكال. ووفقا للدراسات السابقة، CBA أكثر حساسية وتحديداً من أساليب الكشف عن مفتش مكافحة AQP4 أخرى، وأنه يمكن تطبيقها على كل من التشخيص السريري والدراسات المتعلقة نموسد. يحتوي الأسلوب على القيود؛ على سبيل المثال، لا تزال تفتقر إلى نطاق دولي لتقييم التتر مفتش مكافحة AQP4 المصل. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لمصل الدم البشري AQP4 المضادة مفتش الكشف عن استخدام تحليل التكاليف والمنافع.
Introduction
مفتش AQP4 المصل هو العلامات البيولوجية أساسية تشخيص المياليني البصري طيف اضطرابات (نموسد)1. تحليل يستند إلى الخلية (CBA) أسلوب الكشف عن مفتش AQP4 المضادة مستخدمة على نطاق واسع مع حساسية عالية وخصوصية. هنا، هو عرض بروتوكول مفصل لتحليل التكاليف والمنافع.
AQP4، بروتين قناة مياه، ست وحدات تمتد من الغشاء والمجالين حلزونية المحيطة واحد مائي المسامية2. مفتش مكافحة AQP4 تشارك في الآلية المرضية نموسد من خلال الربط إلى هدفها AQP4، التي تقع أساسا في اندفيت أستروسيتيس3. قد تبين أن مفتش مكافحة--AQP4 إيجابية في حوالي ثلثي المرضى نموسد4. في أحدث معايير التشخيص الدولي نموسد، يعتبر مفتش مكافحة AQP4 العلامات البيولوجية تشخيصية أساسية5. وفي هذا الصدد، من الأهمية بمكان وضع بروتوكول يمكن الاعتماد عليها لاكتشاف مصل الدم البشري مفتش مكافحة AQP4 وتيسير التشخيص السريري نموسد.
حاليا مختلف أساليب الكشف مفتش مكافحة AQP4 المتاحة، مثل المصرف المركزي والتحليل القائم على الأنسجة والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم والتدفق الخلوي6،7. وتوظف CBA EU90 الخلايا التي يتم transfected مع AQP4 البشرية، للقبض على مفتش مكافحة AQP4. مفتش مكافحة--AQP4 القبض على الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت وتصور بعد ذلك بالفحص المجهري. تتراكم الأدلة أظهرت أن المصرف المركزي أكثر حساسية وتحديداً من الأخرى المضادة AQP4 كشف مفتش أساليب6،7. ووفقا لتحليل تلوي، حساسية وخصوصية CBA قد تبين أن 76 في المائة و 99 في المائة، التي كانت أعلى من النسيج المستندة والمرتبط بالانزيم المرتبط فحوصات6. وعلاوة على ذلك، تمت مقارنة متعددة المراكز لفحوصات تشخيصية لمفتش مكافحة--AQP4 أجرى7. التحق ما مجموعة 193 دراسة المواضيع من مراكز التشخيص الأوروبية 157. واستخدمت أربعة أساليب مختلفة لكشف مفتش مكافحة AQP4 المصل7. وثبت أن المصرف المركزي كان أكثر حساسية وتحديداً من الأساليب الأخرى7. كما يتم التعبير عن AQP4 باثنين من isoforms الرئيسية (AQP4-M1 و AQP4-M23)، هو ترانسفيكتيد AQP4 المضادة مفتش القبض على خلية مع AQP4 M1 أو AQP4-M23. ومع ذلك، هو أي نوع من القبض على خلية أفضل ما زال مثيرا للجدل. ودعمت التحقيق واحد AQP4-M1 على أساس CBA8، بينما قد أشار آخرون إلى أن أساس AQP4-M23 CBA هو أفضل7،،من910. ومع ذلك، قد تسفر عن CBA AQP4-M23-تعتمد نتائج إيجابية كاذبة بسبب مفتش غير محدد ملزم8. Jarius et al. 11 أفادت بأنه لا يوجد اختلاف كبير في معدلات الكشف عن مفتش مكافحة AQP4 بين AQP4-M1 والتحرشات AQP4-M23-تعتمد.
في موجزة، الأمصال المضادة-AQP4 IgG هو العلامات البيولوجية أساسية نموسد. وقد CBA أعلى من خصوصية وحساسية من أساليب الكشف عن مفتش مكافحة AQP4 أخرى. ويبقى المثير للجدل عما إذا كان AQP4-M1-أو AQP4-M23-تعتمد CBA أفضل. في هذه المقالة، بروتوكول مفصل ل CBA AQP4-M1-تعتمد يرد، التي يمكن أن تنطبق على الدراسات نموسد والتشخيص السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا الإجراء أقرته "لجنة الأخلاقيات" في جامعة "مستشفى جيلين الأول" وأجرى على المواضيع 1,500 تقريبا.
1-الصبور الالتحاق وجمع عينات الدم
- تطبيق الكشف عن معمل المصل مفتش AQP4 المضادة لعيادة المرضى مع رئيس الشكاوى والأعراض المذكورة أدناه. إجراء الفحوص البدنية كذلك.
التهاب العصب البصري: المرضى الذين يعانون من العجز البصري، مثل فقدان الحقول البصرية والحد من حدة البصر.
سنجابية الحادة: قد تعرض المرضى بالشلل والعجز الحسي والخلل اللاإرادي.
متلازمة postrema المنطقة: قد يكون المرضى أعراض السقطات غير المبررة، والغثيان أو القيء.
متلازمة الدماغ الحادة: يمكن أن يؤدي إلى آفات جذع الدماغ في مختلف الأعراض والعلامات المادية تبعاً لموقع الآفات.
الخدار الأعراض أو الحاد السريرية diencephalic مع آفات التصوير بالرنين المغناطيسي diencephalic نموسد نموذجية.
أعراض متلازمة الدماغي مع آفات الدماغ نموسد نموذجية.
ملاحظة: وفقا لتوافق الآراء الدولي معايير التشخيص نموسد5، يمكن إجراء تشخيص نموسد إذا كان المريض الأمصال المضادة-AQP4 IgG إيجابية وقد واحدة على الأقل من الخواص الإكلينيكية الأساسية المذكورة أعلاه. ومع ذلك، لا نوصي اختبار مفتش مكافحة AQP4 في المرضى الذين يعانون من التهاب العصب البصري فقط. -
جمع عينات الدم
ملاحظة: المرضى لا تحتاج إلى أن يكون الصيام.- رسم 2-3 مل دم الوريدي في أنبوب جمع دم فراغ 4 مل.
- السماح بالمصل تجلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: تخثر الدم فترة طويلة يمكن أن تزيد مستويات المصل بسبب التسرب من الصفائح الدموية. - نقل أجهزة الطرد المركزي في 2100 س ز للحد الأدنى 5 بعناية المصل إلى أنبوب جديد.
- تحليل مصل الدم فورا أو قاسمة وتخزينها في-20 أو-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم التخزين في-20 درجة مئوية للتخزين لمدة أشهر، بينما-80 درجة مئوية للتخزين لسنوات.
2-مكافحة--AQP4 كشف الأجسام المضادة
تنبيه: عينات المريض والكواشف المستخدمة عدة ينبغي النظر في المواد المعدية. والكواشف التي تحتوي على أزيد الصوديوم في عدة مواد سامة. مخطط تدفق البروتوكول يرد في الشكل 1.
-
إعداد
- إحضار الطقم إلى RT قبل الاستخدام.
ملاحظة: تخزين عدة في 2-8 درجة مئوية. - إعداد برنامج تلفزيوني يغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.2% 200 مل على الأقل 20 توين. صب كوب 500 مل 100 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- تمييع عينات المصل x 10 مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. إعداد عناصر إيجابية وسلبية وفقا لتعليمات الموزع.
- إحضار الطقم إلى RT قبل الاستخدام.
-
حضانة عينة
- إضافة 30 ميليلتر العينات قبل المخفف أو مراقبة إيجابية، أو المراقبة السلبية إلى حقول رد فعل علبة الكاشف (الشكل 2).
ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء. - قم بإزالة الغطاء الواقي على الشرائح biochip.
ملاحظة: لا تلمس biochips لتجنب مفرزة وتلوث الخلايا الثابتة. اضغط الشريحة-الجانب قبل إزالة الغطاء. - تطبيق الشريحة biochip إلى علبة الكاشف (الشكل 2). تبدأ حضانة 30 دقيقة في الرايت
ملاحظة: يجب أن يكون كل عينة الحبرية فردية متصلاً biochip المقابلة دون خلط مع قطرات أخرى. - شطف بلطف الشريحة biochip مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. تزج الشريحة biochip في الكأس 500 مل مليئة 100 مل من المخزن المؤقت للغسيل لمكان الكأس على شاكر إذا كان ذلك ممكناً على الأقل 5 الحد الأدنى.
- إخراج الشريحة biochip من المخزن المؤقت الغسيل. بدقة مسح بعيداً من المخزن المؤقت غسيل المتبقية خارج مجالات التفاعل مع منشفة ورقية. يعرض الشريحة biochip في الهواء الطلق لمدة 1-2 دقيقة تتبخر المخزن المؤقت غسيل المتبقية في مجال رد الفعل.
ملاحظة: لم تجف حقول رد فعل. لا تلمس biochips مع منشفة ورقية.
- إضافة 30 ميليلتر العينات قبل المخفف أو مراقبة إيجابية، أو المراقبة السلبية إلى حقول رد فعل علبة الكاشف (الشكل 2).
-
حضانة جسم الثانوية
- إعداد الحل جسم الثانوي وفقا لتعليمات الموزع.
- إضافة 25 ميليلتر من جسم الثانوي الفلورية إلى حقول رد فعل من علبة الكاشف نظيفة.
- تطبيق الشريحة biochip إلى علبة الكاشف محملة بالجسم المضاد الثانوي. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
-
تصاعد
- صب المخزن المؤقت الغسيل المستخدمة وإضافة 100 مل من المخزن المؤقت للمياه العذبة والصرف الصحي إلى الكأس. كرر الغسل كما هو موضح في الخطوات 2.2.4 و 2.2.5.
- عناية إضافة المتوسطة تضمين حقول رد فعل على شريحة بيوتشيب (قطره واحدة في كل حقل رد الفعل). ختم الشريحة biochip مع قطعة واحدة من الزجاج غطاء. تجنب فقاعات الهواء.
-
كشف الأسفار
- قم بتشغيل مصباح فلوري مجهر والحرارة قبل 15 دقيقة من اختيار عامل تصفية 488 نانومتر.
- برنامج تصوير مفتوح. التقاط صور من المناطق ترانسفيكتيد وأونترانسفيكتيد على حد سواء في جميع حقول رد فعل مع تكبير مختلفة. أولاً، تتخذ صورة واحدة مع 4 x التكبير لنظره، ثم اتخاذ المزيد من الصور مع 10 x و 20 x تكبير.
ملاحظة: ويرد في الجدول 1البروتوكول مفصلاً. تفسير النتائج تناقش في قسم النتائج التمثيلية.
3-التشخيص للمرضى
- إذا كان المريض الأمصال المضادة-AQP4 IgG إيجابي ويظهر واحد على الأقل السمات السريرية الأساسية من نموسد (انظر القسم المناقشة)، تشخيص المريض مع نمسود5. ومع ذلك، إذا كان المريض هو مكافحة AQP4 مفتش سالب، تشخيص نموسد لا يمكن استبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مفتش مكافحة محددة-AQP4 في مصل الدم باستخدام الإجراء الموضح هنا، قابلاً للاكتشاف. أثناء الإجراء، أضيفت العينات قبل المخفف وعنصر تحكم إيجابية وعنصر تحكم سلبية إلى حقول رد الفعل، التي تحتوي على مناطق ترانسفيكتيد وأونترانسفيكتيد (الشكل 2). أساسا إلى الأسفار التحكم السلبي في منطقة transfected الربط غير محدد من جسم الثانوي لخلايا transfected biochips (الشكل 3). وكان الأسفار البلوتينيوم ضعيفة مرئية (الشكل 3). أما بالنسبة لعنصر التحكم الإيجابي، تمت إضافة الأجسام المضادة AQP4 إلى الميدان رد فعل. ولوحظ fluorescence قوية في منطقة ترانسفيكتيد، التي أشارت إلى ملزمة محددة من مفتش مكافحة--AQP4 إلى AQP4-M1 في transfected الخلايا (الشكل 4). أظهر fluorescence التحكم الإيجابي في منطقة أونترانسفيكتيد تلميحات من الربط غير محدد من مفتش AQP4 المضادة للخلايا الثابتة biochips (الشكل 4). 10 × عينات المخفف، المصل مفتش السلبية المضادة AQP4 أظهرت نمطاً فلورسنت مماثلة لمراقبة سلبية، بينما أظهر إيجابية المصل نمط مماثل لمراقبة إيجابية (الشكل 5). كثافة الأسفار ارتبط بعيار مفتش مكافحة AQP4. وترد أمثلة لكثافة مختلفة من الأسفار في الشكل 5. الشكل 5 ألف و 5B كانت من العينات السلبية مفتش مكافحة--AQP4، في حين الرقم 5ج-ح من عينات إيجابية مفتش مكافحة AQP4. طالما الأسفار غير متجانسة والحبيبية ظهرت في مناطق ترانسفيكتيد، العينة اعتبرت مكافحة AQP4 مفتش-إيجابية، بغض النظر عن قوة الأسفار. معايير التشخيص نموسد، الذي يرتكز على الأمصال المضادة-AQP4 مفتش، وسيرد كذلك في قسم النقاش.
في بعض العينات، سوى عدد قليل من الخلايا كان ملطخة بشدة في مناطق ترانسفيكتيد، وكان من الصعب تحديد ما إذا كان المصل مفتش مكافحة--AQP4--إيجابية أو سلبية (الشكل 6). وفي هذه الحالة، يمكن الإبلاغ عن "إيجابية محتملة". في حالات نادرة، كان الأسفار من عينة في المناطق transfected البلوتينيوم أقوى في مناطق أونترانسفيكتيد (الشكل 7). وفي هذه الحالة، ينبغي اعتبار العينة المضادة AQP4 مفتش سالب. كثافة عالية للأسفار الخلفية قد يكون غير محدد. لإنشاء تقرير موثوق به، ينبغي تقييم جميع الصور عمياء من قبل اثنين على الأقل من الأطباء. وينبغي تدريب الأطباء قبل التقييم. في هذا البروتوكول، وأنها عرضت صور الممثل لأنواع مختلفة من عينة وأبلغ فيما يتعلق بكيفية تقييم النتائج. ثم أنها تقييم الصور جنبا إلى جنب مع الأطباء ذوي خبرة. وأخيراً، عملت الأطباء المدربين بشكل مستقل. في وضع مثالي، فإنه ينبغي أن يكون دائماً نفس الأطباء الذين تقييم النتائج.
الشكل 1 : مخطط تدفق البروتوكول الكشف عن مفتش مكافحة--AQP4- أونترانسفيكتيد أو AQP4-M1-transfected الخلايا الاتحاد الأوروبي 90 ثابتة على بيوتشيبس. عند إضافة المصل إلى بيوتشيبس، مفتش مكافحة AQP4 في المصل يتم التقاطها بواسطة الخلايا transfected ثابت. ثم، يتم تطبيق المسمى fluorescein جسم الثانوية للكشف عن مفتش مكافحة AQP4. يمكن تصور الأسفار بالفحص المجهري مع تكبير مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نموذج الاحتضان. (أ) عرض أعلى علبة الكاشف. كل علبة الكاشف يحتوي على خمسة حقول رد الفعل الفردي. مراقبة إيجابية وعينات، ومراقبة سلبية تضاف إلى حقول رد فعل منفصلة. (ب) طريقة العرض العلوي من الشريحة biochip. كل شريحة biochip يحتوي على خمسة حقول رد الفعل، التي لها قسمين فرعيين. ويتضمن الجزء الفرعي transfected الخلايا AQP4-M1-transfected ثابت، بينما الجزء الفرعي أونترانسفيكتيد يحتوي على خلايا أونترانسفيكتيد. (ج) جبهة عرض شريحة صينية و biochip كاشف. يتم إقران حقول رد فعل على الشريحة صينية و biochip الكاشف مع بعضها البعض. يجب أن تكون متصلاً العينة إضافة إلى الحقل رد فعل على علبة الكاشف الحقل المقابل لها رد فعل على الشريحة بيوتشيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الأرقام التمثيلية للمراقبة السلبية. (أ) تم الحصول على لمحة عامة عن منطقة ترانسفيكتيد لعنصر التحكم السلبي ب 4 x التكبير المجهري. وقد لوحظ fluorescence البلوتينيوم ضعيفة في جميع أنحاء المنطقة. (ب، ج) مزيد من التفاصيل وقد لوحظت في 10 × (ب) والعاشر (ج) تكبير الصور الفوتوغرافية. وبوجه عام، كانت طفيفة الملون بغشاء الخلايا والبلازما، ونواة الخلية أونستينيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الأرقام التمثيلية لمراقبة إيجابية. (أ وب) وترد ترانسفيكتيد (A) وأونترانسفيكتيد (ب) مجالات المراقبة الإيجابية. ولوحظ fluorescence البلوتينيوم ضعيفة في مناطق أونترانسفيكتيد، يشير إلى الربط غير محدد من مفتش AQP4 المضادة للخلايا الثابتة. على العكس من ذلك، لوحظ fluorescence قوي غير متجانسة في مناطق ترانسفيكتيد، تشير إلى ملزمة محددة من مفتش مكافحة--AQP4 إلى AQP4-M1 أعرب في الخلايا الثابتة. (ج-F) المزيد من التفاصيل عن ترانسفيكتيد (ج وه) وأونترانسفيكتيد (د، و) المناطق ولوحظت مع 10 × (ج، د) أو 20 x التكبير (ه، و). ظهرت fluorescence ضعيفة، وحتى في المناطق أونترانسفيكتيد. ومع ذلك، أظهرت نسبة كبيرة من الخلايا في مناطق transfected fluorescence مكثفة. في بلازما خلايا ملطخة بشدة، أظهرت مفتش مكافحة AQP4 fluorescence سلس ومحبب. وكان أونستينيد نواة الخلية أو الملون قليلاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الأرقام التمثيلية لعينات سلبية أو إيجابية الأجسام المضادة AQP4 المضادة. وكانت عينات x 10 إضعاف، واتخذت جميع الأرقام المبينة مع هدف 10 x. (أ وب) عينة الأسفار السلبية: الأسفار كانت ضعيفة البلوتينيوم في كلا (A) ترانسفيكتيد وأونترانسفيكتيد (ب) المناطق. (ج، د) عينة الأسفار ضعيفة: بالمقارنة مع المناطق أونترانسفيكتيد (د)، كمية صغيرة من الخلايا (حوالي 25 إلى 50%) في مناطق ترانسفيكتيد (ج) أظهرت fluorescence أكثر كثافة. (ه، و) عينة الأسفار معتدلة: في مناطق ترانسفيكتيد (E)، لوحظ fluorescence الحبيبية قوية في كمية متوسطة من الخلايا (حوالي 50% إلى 75%). (ز، ح) عينة قوية fluorescence: الملون الخلايا في مناطق أونترانسفيكتيد (ح) كانت ضعيفة. غير أنه يبدو fluorescence الحبيبية بكثافة عالية في المناطق ترانسفيكتيد (ز)، في عدد كبير من الخلايا (تقريبا أكثر من 75 في المائة). عموما، كما زاد عيار مفتش مكافحة AQP4، كثافة الأسفار والنسبة المئوية للخلايا ملطخة بشدة مرتفعة في المقابل. الأسفار المناطق أونترانسفيكتيد كان دائماً البلوتينيوم ضعيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : الأرقام التمثيلية لمكافحة AQP4 جسم عينات "إيجابية محتملة". (أ وب) لم يلاحظ أي فروق كبيرة في أنماط الأسفار بين ترانسفيكتيد (A) والمناطق (ب) أونترانسفيكتيد في 4 x التكبير. (ج-ه) مع 10 × (ج، د) أو 20 × (ه، و) التكبير، وبعض الخلايا في مناطق ترانسفيكتيد (ج وه) أظهرت fluorescence الحبيبية قوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : مثال لنموذج سالب مفتش مكافحة غير النموذجية-AQP4- Transfected (A) وأونترانسفيكتيد (ب) مجالات كانت البلوتينيوم الملون. ومع ذلك، fluorescence في مناطق transfected كان أقوى من المناطق أونترانسفيكتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| التكبير | منطقة ترانسفيكتيد | منطقة أونترانسفيكتيد |
| 4 x | صورة واحدة | صورة واحدة |
| 10 x | صور 4 | صورة واحدة |
| 00: | 5 صور | صورة واحدة |
الجدول 1: الفحص المجهري Fluorescence. من المستحسن استخدام 4 x و 10 x و 20 x أهداف لتصوير المناطق ترانسفيكتيد وأونترانسفيكتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قمنا بوصف طريقة متاحة على نطاق واسع لكشف مفتش مكافحة AQP4 في مصل الدم البشري. مفتش مكافحة AQP4 يرتبط ارتباطاً وثيقا نموسد، وإنشاء أسلوب الكشف عن مفتش AQP4 المضادة موثوق بها أمر حاسم للتشخيص السريري نموسد. أولاً، مفتش مكافحة AQP4 محددة نموسد. التصلب المتعدد هو أيضا مرض المناعة بوساطة من الجهاز العصبي المركزي والعديد من أوجه التشابه مع نموسد12. ومع ذلك، مفتش مكافحة--AQP4 فقط إيجابية في نموسد13. وثانيا، مفتش مكافحة AQP4 شائع بين المرضى نموسد. هي حوالي ثلثي المرضى نموسد المصل AQP4 المضادة IgG إيجابي4. ثالثا، معايير التشخيص الأكثر حداثة ليقوم نموسد على الأمصال المضادة-AQP4 مفتش اختبار5. أخذت معا، يمكن أن تسهل كشف مفتش مكافحة AQP4 المصل التشخيص السريري نموسد.
بين مختلف أساليب الكشف مفتش مكافحة AQP4، يستخدم على نطاق واسع CBA للتشخيص السريري نظراً لحساسية عالية وخصوصية6،7. على الرغم من أن المصرف المركزي طريقة سريعة وواضحة، وينبغي تناول بعض النقاط الرئيسية. أولاً، ينبغي أن تكون حذراً عند العمل مع بيوتشيبس، المجربون كما ثابتة الخلايا AQP4-M1-ترانسفيكتيد وأونترانسفيكتيد على بيوتشيبس. أثناء الإجراء بأكمله، ينبغي عدم لمسها باليد biochips أو جفت. بالإضافة إلى ذلك، الشرائح مع بيوتشيبس وينبغي التعامل معها بلطف، وخلاف ذلك قد تسقط الخلايا الثابتة على بيوتشيبس أو تصبح ملوثة، مما قد يؤدي fluorescence المناطق المعيبة أو خلفية فلورية عالية. ثانيا، عند إضافة عينات إلى حقول رد فعل على علبة الكاشف، يجب ضمان الباحثين أن قطرات عينات غير مختلطة مع بعضها البعض. وينبغي تجنب فقاعات الهواء بين العينات وبيوتشيبس.
هذا الأسلوب له قيود؛ على سبيل المثال، عند استخدام تحليل التكاليف والمنافع لكشف مفتش مكافحة--AQP4، من الصعب قياس كثافة الأسفار ووصف عيار مفتش مكافحة AQP4 في المصل. حاليا، في مركز التشخيص، ذاتي وشدة الأسفار يقال باثنين من الأطباء بعد مقارنة الصور الفوتوغرافية لعينات مقابل. عناصر التحكم. وفي معظم الحالات، ليس من الصعب تحديد ما إذا كان المصل مفتش مكافحة--AQP4--إيجابية أو سلبية. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة، الأسفار من عينات فقط قد يبدو أقوى قليلاً من المراقبة السلبية، والعينة تعتبر "إيجابية محتملة". في هذه الحالة، ينبغي أن يكون الأطباء أكثر حذراً في إجراء تشخيص. حل ممكن آخر هو تكرار المصرف المركزي. طريقة أكثر دقة لقياس كثافة الأسفار وتعريف دولي لتكون مبررة "مفتش مكافحة--AQP4--إيجابية". جدير بالذكر أن معدل إيجابي لمفتش مكافحة AQP4 في السائل الدماغي النخاعي أقل بكثير مما في مصل الدم، واختبار لمفتش مكافحة AQP4 في السائل الدماغي النخاعي ليست مفيدة14،15.
يمكن تطبيق CBA للتشخيص السريري والدراسات العلمية من نموسد. التشخيص السريري نموسد هو على أساس مزيج المظاهر السريرية، المصل مفتش مكافحة AQP4، والنتائج التي توصل إليها نيوروراديولوجيكال. يمكن تشخيص المصل AQP4 المضادة إيجابية مفتش مرضى سمة أساسية واحدة على الأقل السريرية من نموسد مع نموسد5؛ ومع ذلك، إذا كان المريض هو مكافحة AQP4 مفتش سالب، تشخيص نموسد لا ينبغي استبعاد5، وينبغي مواصلة تقييم الأطباء بالمظاهر السريرية والنتائج نيوروراديولوجيكال5،16،17 . قد يتم الكشف عن أضداد بروتين سكري oligodendrocyte المايلين المصل للمساعدة في تشخيص18،،من1920. جدير بالذكر أن على الرغم من أن قد يتم تغيير عيار مفتش مكافحة AQP4 المصل مع rituximab العلاج21، ليس تنبؤية لمسار المرض، واستجابة للعلاج المناعي22،23. CBA يستخدم أيضا على نطاق واسع للبحث العلمي. على سبيل المثال، وصف يانغ et al.24 المظاهر السريرية للمرضى نموسد إيجابية مفتش مكافحة AQP4. بالإضافة إلى ذلك، كيتليي et al.25 تحليل عوامل تشخيصية لمكافحة AQP4 نموسد IgG إيجابية المرضى25. تستخدم كلتا الدراستين CBA للكشف عن المصل مفتش مكافحة AQP4.
باختصار، هو أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لكشف مفتش مكافحة--AQP4 CBA ويمكن تطبيقها على التشخيص السريري والبحث العلمي من نموسد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون للدعم من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الصينية الوطنية (رقم 31600820)، وأن الصحة ولجنة تنظيم الأسرة لمقاطعة جيلين (لا 2016Q036)، والعلم والتكنولوجيا تخطيط المشروع من مقاطعة جيلين (رقم 20180520110JH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. |
| CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A | photograph software |
| Gel & clot activator tube | Improve medical | 623040202 | From a local Chinese company |
References
- Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).
- Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).
- Takeshita, Y., et al. Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro. in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).
- Sato, D. K., et al. Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders. Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).
- Wingerchuk, D. M., et al. International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders. Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).
- Ruiz-Gaviria, R., et al. Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).
- Waters, P., et al. Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).
- Fryer, J. P., et al. AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11 (2014).
- Long, Y., et al. Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China. The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).
- Pisani, F., et al. Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity. PloS One. 8 (11), 79185 (2013).
- Jarius, S., et al. Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate. Journal of Neuroinflammation. 11, 129 (2014).
- Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).
- Chen, H., et al. Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders. Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).
- Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231 (2016).
- Jarius, S., et al. Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance. Journal of Neuroinflammation. 7, 52 (2010).
- Asgari, N., et al. Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343 (2017).
- Kim, H. J., et al. MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update. Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).
- Jarius, S., et al. MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).
- Narayan, R., et al. MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).
- Ogawa, R., et al. MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).
- Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).
- Kessler, R. A., et al. Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).
- Mealy, M. A., et al. Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders. Multiple Sclerosis. , (2017).
- Yang, Y., et al. The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica. Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).
- Kitley, J., et al. Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan. Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).
