Summary
Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.
Abstract
Antiaquaporina-4 (AQP4) Imunoglobulina G (IgG) é o biomarcador de núcleo diagnóstico para transtornos do espectro do Neuromielite optica (NMOSD). O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano com alta sensibilidade e especificidade. Brevemente, soro anti-AQP4 IgG é capturado pela célula AQP4-transfectadas que é fixada sobre o biochip então detectada por um anticorpo secundário marcado com fluoresceína. Microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência, e a intensidade da fluorescência é avaliada pelo menos dois médicos experientes. Um diagnóstico final de NMOSD pode ser feito com base na combinação de resultados de deteção de IgG anti-AQP4, manifestações clínicas e achados neurorradiológica. De acordo com estudos anteriores, a CBA é mais sensível e específica do que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4, e pode ser aplicada para diagnóstico clínico e estudos de NMOSD. O método tem limitações; por exemplo, a escala internacional para avaliar a concentração de IgG do soro anti-AQP4 é ainda insuficiente. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de IgG anti-AQP4 soro humano usando CBA é descrito.
Introduction
Soro AQP4 IgG é um biomarcador de diagnóstico de núcleo para Neuromielite optica espectro transtornos (NMOSD)1. O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método de deteção de IgG anti-AQP4 amplamente utilizado com alta sensibilidade e especificidade. Aqui, um protocolo detalhado para a CBA é introduzido.
AQP4, uma proteína de canal de água, possui seis unidades de membrana que mede e dois domínios helicoidais em torno um aquosa pore2. IgG anti-AQP4 está envolvida na patogênese da NMOSD por meio de ligação ao seu alvo AQP4, que situa-se principalmente sobre o endfeet de astrócitos3. Tem sido demonstrado que IgG anti-AQP4 é positivo em cerca de dois terços dos pacientes NMOSD4. Nos mais recentes critérios diagnósticos internacionais para NMOSD, IgG anti-AQP4 é considerado ser um biomarcador diagnóstico do núcleo5. A este respeito, é fundamental estabelecer um protocolo confiável para detectar soro humano IgG anti-AQP4 e facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.
Atualmente, vários métodos de deteção de IgG anti-AQP4 estão disponíveis, tais como a CBA, ensaio baseado em tecido, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo6,7. CBA emprega EU90 células, que são transfected com AQP4 humano, para capturar IgG anti-AQP4. O IgG anti-AQP4 capturado é detectado pelos anticorpos secundários fluorescentes e posteriormente visualizado por microscopia. Acumular evidências tem mostrado que a CBA é mais sensível e específico do que outros anti-AQP4 IgG deteção métodos6,7. De acordo com uma meta-análise, a sensibilidade e especificidade do CBA foram mostrados para ser de 76% e 99%, que eram superiores baseados em tecido e ensaios de enzima-lig da imunoabsorção6. Além disso, uma comparação multicêntrico de ensaios de diagnósticos de IgG anti-AQP4 foi realizado7. Um total de 193 estudo sujeitos de 15 centros de diagnósticos europeus foram matriculados7. Quatro diferentes métodos foram utilizados para detectar soro de IgG anti-AQP47. Foi demonstrado que a CBA foi mais sensível e específico do que os outros métodos7. Como AQP4 é expressa em duas isoformas principais (AQP4-M1 e M23-AQP4), célula de captura de IgG anti-AQP4 é transfectada com AQP4-M1 ou AQP4-M23. No entanto, o tipo de célula de captura é melhor permanece controverso. Uma investigação apoiou AQP4-M1 baseado CBA8, enquanto outros têm indicado que AQP4-M23 baseado CBA é melhor7,9,10. No entanto, CBA AQP4 M23-baseados pode produzir resultados falso-positivos devido a inespecíficos IgG ligação8. Jarius et al.. 11 relataram que não houve significativa diferença em taxas de detecção de IgG anti-AQP4 entre AQP4-M1 e CBAs AQP4-M23-baseado.
Em resumo, soro anti-AQP4 IgG é um biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tem maior especificidade e sensibilidade que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4. Permanece controverso se AQP4-M1-AQP4 M23-baseado ou CBA é melhor. Neste artigo, um protocolo detalhado para a CBA AQP4 M1-baseada é descrito, que pode aplicar para o diagnóstico clínico e estudos de NMOSD.
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Protocol
Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade primeiro Hospital de Jilin e realizou-se em aproximadamente 1.500 indivíduos.
1. se o paciente registro e coleta de amostra de sangue
- Aplica a detecção laboratorial de soro de que IgG anti-AQP4 aos pacientes da clínica com os principais queixas e sintomas listado abaixo. Realize exames físicos também.
Neurite óptica: pacientes sofrem com déficits visuais, tais como a perda dos campos visuais e redução da acuidade visual.
Mielite aguda: os pacientes podem apresentar com paralisia, déficits sensoriais e disfunção autonômica.
Síndrome de área postrema: os pacientes podem ter sintomas de soluços inexplicados, náuseas ou vómitos.
Síndrome de tronco cerebral aguda: lesões do tronco cerebral podem resultar em diferentes sintomas e sinais físicos, dependendo da localização das lesões.
Narcolepsia sintomática ou aguda síndrome clínica diencephalic com lesões diencephalic NMOSD-típicas do MRI.
Síndrome cerebral sintomático com lesões NMOSD-típicas do cérebro.
Nota: De acordo com os critérios de diagnóstico de consenso internacional para NMOSD5, um diagnóstico de NMOSD pode ser feita se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e tem pelo menos uma das características clínicas do núcleo acima mencionados. No entanto, não recomendamos teste de IgG anti-AQP4 em pacientes com neurite óptica apenas. -
Coleta de amostra de sangue
Nota: pacientes não precisa ser em jejum.- Desenhe 2-3 mL de sangue venoso em um tubo de coleta de sangue do vácuo de 4 mL.
- Permitir que o soro coagular por 30 min à temperatura ambiente (RT).
Nota: Prolongada de coagulação pode aumentar os níveis séricos devido ao escapamento de plaquetas. - Centrifugar 2100 x g por 5 min., cuidadosamente, transferir o soro para um novo tubo.
- Analisar o soro imediatamente ou alíquota e armazenar a -20-80 ° c.
Nota: Armazenamento-20 ° c é para o armazenamento de meses, enquanto a-80 ° C é para o armazenamento de anos.
2. pesquisa de anticorpos anti-AQP4
Atenção: As amostras dos doentes e dos reagentes utilizados devem ser considerados materiais infecciosos. Reagentes contendo azida de sódio no kit são tóxicos. Um gráfico de fluxo do protocolo é fornecido na Figura 1.
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Preparação
- Trazer o kit para RT antes do uso.
Nota: Armazene o kit de 2-8 ° c. - Preparar pelo menos 200 mL de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% Tween 20. Despeje um copo de 500 mL, 100 mL de tampão de lavagem.
- Diluir o soro amostras x 10 com tampão de lavagem. Prepare os controles positivos e negativos de acordo com as instruções do distribuidor.
- Trazer o kit para RT antes do uso.
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Incubação da amostra
- Adicione 30 µ l do pre-diluídas amostras, controle positivo, controle negativo ou para os campos de reação da bandeja do reagente (Figura 2).
Nota: Evite bolhas de ar. - Remova a tampa protetora nas corrediças de biochip.
Nota: Não toque os biochips para evitar o desprendimento e a contaminação de células fixas. Segure a slide lado a lado antes de remover a tampa. - Aplica o slide de biochip para a bandeja do reagente (Figura 2). Começar uma incubação de 30 min a RT
Nota: Cada amostra deve ser uma gota individual conectada para o biochip correspondente sem misturar com outras gotículas. - Lave suavemente o slide de biochip que uma vez com o tampão de lavagem. Mergulhe o slide de biochip para o copo de 500 mL preenchido com 100 mL de tampão de lavagem durante pelo menos 5 min. lugar o copo num agitador se possível.
- Tire o slide biochip do tampão de lavagem. Cuidadosamente Limpe o tampão de lavagem residual fora os campos de reação com uma toalha de papel. Expor o slide de biochip que ao ar livre por 1-2 minutos evaporar o tampão de lavagem residual no campo de reação.
Nota: Não seca os campos de reação. Não toque os biochips com toalha de papel.
- Adicione 30 µ l do pre-diluídas amostras, controle positivo, controle negativo ou para os campos de reação da bandeja do reagente (Figura 2).
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Incubação do anticorpo secundário
- Prepare a solução de anticorpo secundário de acordo com as instruções do distribuidor.
- Adicione 25 µ l de anticorpo secundário fluorescente para os campos de reação de uma bandeja limpa reagente.
- Aplica o slide de biochip para a bandeja de reagente carregada com anticorpo secundário. Incubar durante 30 min à RT.
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Montagem
- Deite fora o tampão de lavagem usado e adicionar 100 mL de tampão de lavagem fresca no copo medidor. Repeti a lavagem como descrito nos passos 2.2.4 e 2.2.5.
- Adicione cuidadosamente encastre médio para os campos de reação em um slide de biochip (uma gota por campo de reação). Sele o slide de biochip com um pedaço de vidro de tampa. Evite bolhas de ar.
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Deteção de fluorescência
- Ligue a lâmpada fluorescente do microscópio e pré-aquecimento de 15 min. escolha um filtro de 488 nm.
- Software de fotografia aberta. Tire fotos das áreas transfectadas e untransfected de todos os campos de reação com diferentes ampliações. Primeiro, tirar uma foto com ampliação de 4x para uma visão geral e, em seguida, tirar mais fotos com 10x e 20 x de ampliações.
Nota: O protocolo detalhado é mostrado na tabela 1. Interpretação dos resultados é discutida na seção resultados representativos.
3. o diagnóstico de pacientes
- Se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e mostra pelo menos uma característica clínica do núcleo de NMOSD (veja a seção de discussão), diagnosticar o paciente com NMSOD5. No entanto, se o paciente é anti-AQP4 IgG negativo, o diagnóstico de NMOSD não pode ser excluído.
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Representative Results
Usando o procedimento descrito aqui, anti-AQP4 específicos IgG no soro é detectável. Durante o procedimento, pre-diluídas amostras, um controle positivo e um controle negativo foram adicionados aos campos de reação, que contêm áreas transfectadas e untransfected (Figura 2). Fluorescência do controlo negativo numa área transfectada indicado principalmente a vinculação não específico do anticorpo secundário às células transfectadas em biochips (Figura 3). Homogeneamente fraca fluorescência era visível (Figura 3). Quanto ao controlo positivo, anticorpo anti-AQP4 foi adicionado para o campo de reação. Observou-se forte fluorescência na área transfectada, que indicou a vinculação específica de IgG anti-AQP4 para AQP4-M1 nas células transfectadas (Figura 4). Fluorescência do controlo positivo em uma área de untransfected mostrou dicas de ligação inespecífica de IgG anti-AQP4 para células fixas em biochips (Figura 4). Para 10 x amostras diluídas, anti-AQP4 negativo IgG soro apresentou a fluorescente padrão semelhante ao controle negativo, enquanto o soro positivo apresentou um padrão semelhante ao controle positivo (Figura 5). A intensidade de fluorescência foi associada com o título de IgG anti-AQP4. Na Figura 5, são apresentados exemplos de diferentes intensidades de fluorescência. Figura 5 A e 5B foram de amostras negativas para IgG de anti-AQP4, enquanto Figura 5C-H foram de amostras de IgG-positivo anti-AQP4. Enquanto heterogênea e granular fluorescência apareceu em áreas transfectadas, a amostra foi considerada anti-AQP4 IgG-positivo, independentemente da força da fluorescência. Os critérios de diagnóstico para NMOSD, que se baseia o soro anti-AQP4 IgG, será ainda mais descrita na seção de discussão.
Em algumas amostras, apenas um pequeno número de células foi fortemente manchado em áreas transfectadas, e era difícil determinar se o soro foi anti-AQP4 IgG-positivo ou negativo (Figura 6). Neste caso, "provável positivo" pode ser relatado. Em casos mais raros, a fluorescência de uma amostra em áreas transfectadas foi homogênea mais forte do que em áreas untransfected (Figura 7). Neste caso, a amostra deve ser considerada como negativo IgG anti-AQP4. A alta intensidade da fluorescência do fundo pode ser inespecífica. Para criar um relatório confiável, todas as fotografias devem ser avaliadas às cegas pelo menos dois médicos. Os clínicos devem ser treinados antes de avaliação. Neste protocolo, eles foram mostrados fotografias representativas dos tipos de amostras diferentes em foram informados sobre como avaliar os resultados. Então, eles avaliados fotografias juntamente com um médico experiente. Finalmente, os clínicos treinados trabalharam de forma independente. Em uma situação ideal, deve ser sempre os mesmos clínicos que avaliam os resultados.
Figura 1 : Carta de fluxo do protocolo de deteção de IgG anti-AQP4. AQP4-M1-transfectadas ou untransfected UE 90 células são fixadas sobre os biochips. Quando a adição de soro de biochips, anti-AQP4 IgG no soro é capturado pelas células transfectadas fixas. Então, o anticorpo secundário marcado com fluoresceína é aplicado para detectar IgG anti-AQP4. A fluorescência pode ser visualizada por microscopia, com diversas ampliações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Incubação da amostra. (A) vista superior da bandeja de reagente. Cada bandeja do reagente contém cinco campos de reação individual. O controle positivo, amostras e controlo negativo devem ser adicionados aos campos separados de reação. (B) vista superior do slide biochip. Cada slide biochip que contém cinco campos de reação, que tem duas subseções. A subseção transfectada contém células transfectadas AQP4-M1 fixas, enquanto a subseção untransfected contém células untransfected. (C) frente vista de slide de bandeja e biochip de reagente. Campos de reação do slide de bandeja e biochip de reagente estão emparelhados com o outro. A amostra adicionada ao campo de reação na bandeja de reagente deve ser ligada ao campo de reação correspondente no slide biochip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Figuras representativas para controle negativo. (A) uma visão geral da área transfectada do controlo negativo foi obtida por microscopia de ampliação de 4x. Fluorescência homogeneamente fraca foi observada em toda a área. (B, C) Mais detalhes foram observados em 10 x (B) e x (C) fotografias de ampliação. Geralmente, a membrana celular e plasma foram ligeiramente manchados, e o núcleo da célula era inocente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Figuras representativas para controle positivo. (A, B) Transfectadas (A) e untransfected (B) áreas de controlo positivo são mostradas. Homogeneamente fraca fluorescência foi observada em áreas untransfected, indicando a vinculação inespecífica de IgG anti-AQP4 para células fixas. Por outro lado, heterogênea forte fluorescência foi observada em áreas transfectadas, indicando a ligação específica de IgG anti-AQP4 para AQP4-M1, expressado em células fixas. (C-F) Mais informações sobre transfectadas (C, E) e untransfected (D, F) áreas são observadas com 10 x (C, D) ou 20 x ampliação (E, F). Fluorescência fraca e até mesmo apareceu em áreas untransfected. No entanto, uma grande porcentagem de células transfectadas áreas mostrou intensa fluorescência. No plasma das células fortemente coradas, IgG anti-AQP4 mostrou fluorescência granular e Lisa. O núcleo da célula era inocente ou ligeiramente manchado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Figuras representativas para amostras de negativo ou positivo de anticorpo anti-AQP4. Amostras foram 10 x diluído, e todos os valores apresentados foram tirados com um objectivo de 10x. (A, B) Amostra de fluorescência negativa: a fluorescência era homogeneamente fraca em ambos (A) transfectadas e (B) untransfected áreas. (C, D) Amostra de fluorescência fraco: quando comparado com áreas untransfected (D), uma pequena quantidade de células (cerca de 25% a 50%) em áreas transfectadas (C) mostrou a fluorescência mais intensa. (E, F) Amostra de fluorescência moderado: em áreas transfectadas (E), observou-se forte fluorescência granular em uma quantidade média de células (aproximadamente 50% a 75%). (G, H) Amostra forte fluorescência: células em áreas untransfected (H) fracamente estavam manchadas. No entanto, em áreas transfectadas (G), fluorescência granular com alta intensidade apareceu em um grande número de células (aproximadamente mais de 75%). Em geral, como o título de IgG anti-AQP4 aumentou, tanto a intensidade de fluorescência e percentagem de células fortemente coradas elevado correspondentemente. A fluorescência das áreas untransfected era sempre homogeneamente fraca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Figuras representativas para amostras de "provável positivo" de anticorpo anti-AQP4. (A, B) Não há diferenças significativas nos padrões de fluorescência foram observadas entre transfectadas (A) e untransfected (B) áreas de ampliação de 4x. (C-E) Com 10 x (C, D) ou 20 x (E, F) ampliação, algumas células transfectadas áreas (C, E) mostrou forte fluorescência granular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Exemplo de amostra de IgG negativo atípico anti-AQP4. Tanto transfectadas (A) e untransfected (B) áreas foram homogeneamente coradas. No entanto, era mais forte que a fluorescência nas áreas transfectadas em áreas untransfected. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ampliação | Transfectadas área | Área untransfected |
| 4 x | 1 imagem | 1 imagem |
| 10 x | 4 imagens | 1 imagem |
| 20 x | 5 fotos | 1 imagem |
Tabela 1: microscopia de fluorescência. É recomendável usar 4x, 10x e 20 objectivos de x para a imagem latente de áreas transfectadas e untransfected.
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Discussion
Descrevemos um método amplamente acessível para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano. IgG anti-AQP4 está intimamente relacionado com NMOSD, e que estabelece um método de deteção de IgG anti-AQP4 confiável é fundamental para o diagnóstico clínico de NMOSD. Primeiro, o IgG anti-AQP4 é específico para NMOSD. Esclerose múltipla é também uma doença imune-mediada do sistema nervoso central e compartilha muitas semelhanças com NMOSD12. No entanto, o IgG anti-AQP4 só é positivo em NMOSD13. Em segundo lugar, o IgG anti-AQP4 é comum entre os pacientes NMOSD. Aproximadamente dois terços dos pacientes NMOSD são soro anti-AQP4 IgG-positivo4. Em terceiro lugar, os critérios de diagnóstico mais recentes para NMOSD é baseado no soro anti-AQP4 IgG teste5. Tomados em conjunto, deteção de IgG soro anti-AQP4 poderia facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.
Entre os vários métodos de detecção de IgG anti-AQP4, CBA é amplamente utilizado para o diagnóstico clínico, devido à sua alta sensibilidade e especificidade6,7. Embora o CBA é um método rápido e simples, alguns pontos-chave devem ser dirigidos. Primeiro, experimentadores devem ter cuidadosos ao trabalhar com biochips, como células transfectadas AQP4-M1 e untransfected são fixadas sobre os biochips. Durante todo o processo, biochips não devem ser tocados com a mão ou dessecados. Além disso, os slides com biochips devem ser manuseados com cuidado, caso contrário as células fixas nos biochips podem cair ou contaminadas, que pode resultar em zonas defeituosas de fluorescência ou um fundo fluorescente elevado. Em segundo lugar, ao adicionar as amostras para os campos de reação na bandeja do reagente, pesquisadores devem garantir que as gotas de amostras não são misturadas com os outros. Bolhas de ar entre as amostras e biochips devem ser evitadas.
Este método tem limitações; por exemplo, ao usar o CBA para detectar IgG anti-AQP4, é difícil quantificar a intensidade da fluorescência e descrever o título de IgG anti-AQP4 no soro. Atualmente, em nosso centro de diagnóstico, a intensidade da fluorescência é subjetivamente relatada por dois médicos depois de comparar fotografias de controles de amostras vs. . Na maioria dos casos, não é difícil determinar se o soro é anti-AQP4 IgG-positivo ou negativo. No entanto, em casos raros, a fluorescência das amostras pode parecer apenas um pouco mais forte do que o controlo negativo, e a amostra é considerada "provável positivo". Nesta situação, os clínicos mais cuidado em fazer um diagnóstico. Outra solução possível é repetindo o CBA. Um método mais preciso para quantificar a intensidade da fluorescência e uma definição Internacional de "Anti-AQP4 IgG-positivo" é garantido. Nomeadamente, a taxa positiva de IgG anti-AQP4 no líquido cefalorraquidiano é muito menor do que no soro, e o teste para IgG anti-AQP4 no líquido cefalorraquidiano não é informativo14,15.
CBA pode ser aplicado a ambos, diagnóstico clínico e estudos científicos de NMOSD. Diagnóstico clínico de NMOSD é feito com base na combinação de manifestações clínicas, soro anti-AQP4 IgG e achados neurorradiológica. Soro anti-AQP4 IgG-positivo portadores característica clínica de pelo menos um núcleo de NMOSD podem ser diagnosticadas com NMOSD5; no entanto, se o paciente é anti-AQP4 IgG negativo, o diagnóstico de NMOSD não deve ser excluídos5, e os clínicos devem avaliar mais as manifestações clínicas e achados neurorradiológica5,16,17 . Soro mielina oligodendrocyte glicoproteína anticorpo pode ser detectado para auxiliar o diagnóstico18,19,20. Notavelmente, embora o título de IgG soro anti-AQP4 pode ser mudado com rituximab tratamento21, não é preditivo do curso da doença e resposta à imunoterapia22,23. CBA é também amplamente utilizado para a investigação científica. Por exemplo, Yang et al24 descreveu as características clínicas dos pacientes NMOSD positivo IgG anti-AQP4. Além disso, Kitley et al25 analisou os fatores prognósticos para anti-AQP4 IgG-positivo NMOSD pacientes25. Ambos os estudos usado CBA para detectar soro IgG anti-AQP4.
Em resumo, a CBA é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 e pode ser aplicada para o diagnóstico clínico e de investigação científica de NMOSD.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores são gratos pelo apoio de subsídios da Fundação Nacional de Ciências da China (n. º 31600820), a saúde e Comissão planejamento familiar da província de Jilin (não 2016Q036) e a ciência e tecnologia planejamento projeto da província de Jilin (n. º 20180520110JH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. |
| CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A | photograph software |
| Gel & clot activator tube | Improve medical | 623040202 | From a local Chinese company |
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