Summary

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

Published: January 30, 2019
doi:

Summary

פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2′-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.

Abstract

בתהליך של פיתוח תרופות של פילוח RNA מולקולות קטנות, שחקרתי את השינויים המבניים על האינטראקציות שלהם עם רצפי RNA יעד רצוי. בזאת אנו מספקים של נתונים היסטוריים במבחנה , בתא סלקטיבי 2′-הידרוקסיל acylation נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) פרוטוקול ללמוד השינוי המבני RNA בנוכחות תרופה ניסיונית עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), הישרדות מוטור נוירון (SMN)-C2, ו ב אקסון 7 של pre-mRNA של הגן SMN2. בצורת גופית, רצף הרנ א של נוקלאוטידים 140 המכיל SMN2 אקסון 7 עיבד על ידי T7 RNA פולימראז, מקופל בנוכחותו של SMN-C2, שונה לאחר מכן על ידי תגובה כימית acylation מתון-2′ הו, 2-methylnicotinic imidazolide חומצה (NAI). זה adduct 2′-הו-נאי נוסף שנבדק על-ידי בגודל 32הארכת תחל התווית על-ידי P, נפתרת על-ידי אלקטרופורזה בג’ל לזיהוי (עמוד). לעומת זאת, 2′-הו acylation במצב בתא מתקיים באתרו עם RNA הסלולר SMN-C2 מאוגד בתאים חיים. רצף ה-pre-mRNA של אקסון 7 בגן SMN2 יחד עם צורה-induced מוטציות בהרחבה פריימר, היה אז מוגבר על-ידי ה-PCR ובכפוף הדור הבא רצפי. משווים את שתי מתודולוגיות, צורה במבחנה היא שיטה חסכונית יותר, לא דורשת כוח חישובית לדמיין תוצאות. עם זאת, הדגם RNA נגזר צורה במבחנה לפעמים סוטה מן המבנה משני בהקשר הסלולר, ככל הנראה בשל האובדן של כל האינטראקציות עם RNA מחייב חלבונים. הצורה בתאים אינו צריך מקום העבודה חומרים רדיואקטיביים ותשואות מבנה שניוני מדויקת יותר של RNA בהקשר הסלולר. יתר על כן, בתא בצורה ישימה כלל עבור רצפי טווח של RNA גדול יותר (~ 1,000 נוקלאוטידים) על-ידי ניצול רצפי הדור הבא, לעומת הפריה צורה (~ 200 נוקלאוטידים) כי בדרך כלל מסתמך על דף ניתוח. במקרה של אקסון 7 ב- SMN2 pre-mRNA, נגזר הצורה במבחנה, בתא RNA מודלים דומים אחד לשני.

Introduction

Acylation סלקטיבית-2′ הידרוקסיל נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) היא שיטת מדידה של קינטיקה של כל נוקלאוטיד ברצף RNA עניין ולאחר שחקרתי את מבנה שניוני-נוקלאוטיד יחיד החלטה1. הצורה מתודולוגיות, שניהם תנאים במבחנה2,3,4 (מטוהרים RNA במערכת מאגר מוגדר), ב-5,בתרבית של תאים חיים6, פותחו כדי לחקור המשני מבנה של רצפי אורך בינוני RNA (בדרך כלל < 1,000 נוקלאוטידים עבור צורה בתוך תא, < נוקלאוטידים 200 עבור צורה במבחנה). זה שימושי במיוחד כדי להעריך את ביצוע שינויים מבניים קולטן ה-RNA על איגוד אינטראקציה-RNA מולקולה קטנה מטבוליטים2,4,7,8 , ללמוד פעולות מכניסטית של מולקולות RNA פילוח במהלך סמים פיתוח9,10.

פילוח RNA גילוי תרופות לאחרונה מושך תשומת לב במעבדות אקדמי ו11,בתעשייה הפרמצבטית12 באמצעות גישות שונות ואסטרטגיות13,14,15 ,16. דוגמאות פילוח RNA מולקולות קטנות לשימוש קליני האחרונות כוללות שתי תרופות ניסיוניות מבנית ברורים, LMI-07017 ו RG-791618,19, עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), אשר הראו מבטיח תוצאות בשלב II ניסויים קליניים20. היו שתי מולקולות הפגינו להישרדות היעד של נוירון מוטורי (SMN) 2 pre-mRNA ולווסת את התהליך splicing של17,216,ג’ין SMN2. אנחנו הפגינו בעבר היישום של במבחנה ואת הצורה בתא במבחן של השינויים המבניים היעד RNA בנוכחות אנלוגי של RG-7916 המכונה SMN-C26.

בעקרון, צורה מודד את שיעור acylation 2′-הו כל נוקלאוטיד של רצף הרנ א בנוכחות כמויות עודפות של ריאגנט acylation עצמית quenching בצורה בלתי לא משוחדת. הכימית acylation אינה יציבה במים, עם מחצית חיים קצר של (למשל, T1/2 = 17 s עבור 1-מתיל-7-nitroisatoic אנהידריד; או 1 מ’ 7, ~ 20 דקות עבור 2-methylnicotinic imidazolide חומצה, או נאי)22 ו חוסר רגישות לגבי זהותו של בסיסים23. התוצאה acylation יותר של קבוצות 2′-הו הבסיסים גמיש, אשר יכולה להיהפך הערכה מדויקת של כל נוקלאוטיד הדינמיקות. באופן ספציפי, נוקלאוטיד בזוג הבסיס הוא בדרך כלל מגיב פחות מזו אינטראקצית ל ריאגנט שינוי 2′-הו, נאי ו 1 מ’ 7.

מסתכל על המקור של התבנית RNA שם מתקיים acylation 2′-הו, צורה ניתן בדרך כלל לסווג במבחנה וצורה בתא. שימושים חוץ גופית צורה T7 מטוהרים עיבד RNA, חסר הקשר הסלולר בעיצובים ניסיוני. בצורת בתא, שעתוק RNA תבנית והן 2′-הו acylation מתרחשות בתוך תאים חיים; לכן, התוצאות ניתן לסכם המודל המבני RNA בהקשר הסלולר. הצורה בתא שהופנתה כמו vivo צורה עבור הצורה נשא בתאים חיים ספרות24. מאז הניסוי הזה לא מתבצע בחיה, אנחנו כינה את הניסוי הזה בתא הצורה על דיוק.

האסטרטגיות עבור השלב סיומת פריימר של הפריה וצורה בתא הם גם שונים. בצורת גופית, שעתוק במהופך עוצר המיקום acylation 2′-או בנוכחות Mg2 +. סיומת פריימר 32P-בעל התווית ולכן מופיע עם הלהקה ב לזיהוי בג’ל (עמוד), האינטנסיביות של הלהקה הוא יחסי קצב acylation1. בצורת בתא, שעתוק במהופך יוצר מוטציות אקראיות ב- 2′-. הו-adduct עמדה בנוכחות Mn2 +. קצב mutational של כל נוקלאוטיד ניתן ללכוד מאת עומק הדור הבא רצפי ולאחר מכן ניתן לחשב את תגובתיות צורה ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד.

בעיה פוטנציאלית עבור צורה בתא הוא יחס אות לרעש נמוך (קרי, רוב הקבוצות 2′-הו הוא שלא שונתה, ואילו רצפי יאומתו לכבוש את רוב קרא ב הדור הבא רצפי). לאחרונה, שיטה להעשיר 2′-. הו-שינוי RNA, המכונה כמו vivo לחץ על צורה (icSHAPE), פותחה על ידי מעבדה צ’אנג25. שיטה זו העשרה עשוי להיות יתרון בלימוד חלש מולקולות קטנות כגון אינטראקציות RNA, בפרט חקירה transcriptome ברוחב.

Protocol

1. במבחנה צורה הערה: הפרוטוקול זה ששינה את פרוטוקול שפורסמו1. הכנת תבנית הרנ אהערה: התבנית עבור שעתוק T7 פקדו סינתטי זוגית גדילי הדנ א (dsDNA), מוגבר על ידי גם הכניסה לתוך וקטור e. coli שיישא זוג ייחודי של אתרי endonuclease ההגבלה EcoRI/BamHI, …

Representative Results

אנחנו הפגינו בעבר כי RNA שחבור אפנן, SMN-C2, אינטראקציה עם מוטיב AGGAAG על אקסון 7 של pre-mRNA הגן SMN2, המשמש צורה כדי להעריך את השינויים המבניים של RNA בנוכחותו של SMN-C26. אתר איגוד של SMN-C2 היא נבדלת שאושרו על-ידי ה-FDA antisense oligonucleotide (אסו) עבור SMA, nusinersen, אשר נקשר וחוסם intronic splicing משת…

Discussion

בצורת גופית, חיוני להשתמש בתבנית ה-RNA הומוגנית באיכות גבוהה. T7 שעתוק, עם זאת, לעיתים קרובות התשואות רצפים הטרוגנית36. במיוחד, רצפי עם נוקלאוטיד ±1 בקצהו 3′-עם תשואות שעצירת36 קשים בדרך כלל שיוסרו על-ידי לזיהוי ג’ל לטיהור. תבנית ה-RNA הטרוגניות עלולים לגרום קבוצה אחד או יו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו התאפשרה על ידי המענק NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

Materials

DNA oligonucleotide IDT gBlock for > 200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2X TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10X TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6 % TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5X RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/ Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

View Video