작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도
Summary
둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2′-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.
Abstract
RNA를 대상으로 작은 분자의 약 개발, 과정 대상 RNA 순서와 그들의 상호 작용에 구조적인 변화를 elucidating는 원한다. 우리 여기는 상세한 생체 외에서 제공 하 고 셀 선택 2′-히 드 록 acylation 뇌관 연장에 의해 척수 근육 위축 증 (SMA)의 생존에 대 한 실험 약물의 RNA 구조 변화 연구 (모양) 프로토콜 분석 모터 신경 (SMN)-c 2를 사전-SMN2 유전자의 mRNA의 exon 7에서. 생체 외에서 모양, SMN2 exon 7 포함 된 140 뉴클레오티드는 RNA 순서 T7 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 SMN-C2, 존재 접혀 이며 가벼운 2′-OH acylation 시 약, 2-methylnicotinic 산 imidazolide (NAI)에 의해 연속적으로 수정. 이 2′-오-NAI adduct 추가 32P 표시 된 뇌관 연장에 의해 조사 되 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 해결. 반대로, 2′-OH acylation 셀 모양에서 일어난다 SMN-C2 바인딩된 세포질 RNA와 현장에서 살아있는 세포에서. 뇌관 연장에 모양 유발 돌연변이와 SMN2 유전자에서 exon 7의 사전 mRNA 순서는 다음 차세대 시퀀싱 및 PCR에 의해 증폭 됩니다. 두 가지 방법론을 비교, 생체 외에서 모양을 더 비용 효율적인 방법 이며 결과 시각화 하는 컴퓨팅 파워를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 생체 외에서 모양을 파생 RNA 모델은 때때로 RNA 의무적인 단백질에와 함께 모든 상호 작용의 손실로 인해 가능성이 셀룰러 맥락에서 이차 구조에서 일탈 한다. 셀 모양 방사성 소재 직장을 필요 하지 않습니다 고 세포질 문맥에서 더 정확한 RNA 이차 구조를 생성 합니다. 또한, 셀에 형태는 일반적으로 해당 페이지 분석에 의존 하는 체 외에 비해 차세대 시퀀싱을 활용 하 여 더 큰 범위의 RNA 시퀀스 (~ 1000 뉴클레오티드) 모양 (~ 200 뉴클레오티드)는 일반적으로 대 한. SMN2 사전-mRNA에 exon 7의 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 파생 하는 경우에 RNA 모델은 서로 비슷합니다.
Introduction
선택 2′-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양)에 의해 분석은 관심사의 RNA 순서에 있는 각 뉴클레오티드의 활동을 측정 하 고 단일 뉴클레오티드 해상도1에서 이차 구조를 elucidating 방법입니다. 생체 조건2,,34 (정의 된 버퍼 시스템에서 정화 RNA)에 둘 다 모양 방법론 및 보조를 조사 하기 위해 개발 되었습니다 생활 포유류 세포5,6, 중간 길이가 RNA의 구조 (일반적으로 < 셀 모양에 대 한 1000 뉴클레오티드와 < 생체 외에서 모양에 대 한 200 뉴클레오티드). 특히 유용 바인딩 상호 작용 하는 RNA 분자 대사 산물2,4,7,8 시 수용 체 RNA에에서 구조적인 변화를 평가 하 고 기계 작업을 공부 하 약 개발9,10동안 RNA를 대상으로 분자.
RNA를 대상으로 약물 발견 최근 그려 관심 학술 연구소에서 및 제약 산업11,12 다른 접근 방식 및 전략13,,1415 를 통해 16. 최근 임상 사용에 대 한 RNA를 대상으로 하는 작은 분자의 예로 두 구조적으로 독특한 실험 약물, LMI-07017 및 RG-791618,19, 척수 근육 위축 증 (SMA), 유망 보여준 단계 II 임상 시험20에서 결과. 두 분자 했다 증명 대상 생존 모터 신경 (SMN)의 2 중-mRNA 및 SMN2 유전자6,,1721의 접합 과정을 조절. 우리는 이전의 생체 외에서 셀 모양 RG-7916 SMN C26으로 알려진의 아날로그의 대상 RNA 구조 변경 검사에 응용 프로그램을 설명 했다.
원칙적으로, 모양 편견 방식에서 자체 냉각 acylation 시 약의 초과 하는 금액의 RNA 순서의 각 뉴클레오티드의 2′-OH acylation 속도 측정합니다. Acylation 시 약은 물의 짧은 반감기에에서 불안정 (예를 들어, T1/2 = 17의 1-메 틸-7-nitroisatoic 무수 물; 또는 1 M 7, 2-methylnicotinic 산 imidazolide에 대 한 ~ 20 분 또는 NAI)22 와 무감각의 정체성 기지23. 각 뉴클레오티드의 역학의 정확한 평가로 변형 될 수 있는 유연한 기초 2′-OH 그룹의 더 유리한 acylation 발생 합니다. 특히, 뉴클레오티드 기본적인 쌍에 NAI 1 M 7 등 2′-오 수정 시에는 짝이 없는 하나 보다 일반적으로 덜 반응입니다.
RNA 템플릿과 2′-OH acylation 수행의 소스를 보면, 모양 수 있다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양으로 일반적으로 분류 될 있다. 시험관 모양 사용에서 순화 T7 RNA를 변하게 하 고 실험 설계에서 셀룰러 컨텍스트 부족. 셀 모양에 RNA 서식 파일 녹음 및 2′-OH acylation는 살아있는 세포; 내에서 발생 따라서, 결과 세포 맥락에서 RNA 구조 모델을 정리 수 있습니다. 셀에서 모양은 하 비보 모양에서 문학24에서 살아있는 세포에 운반 하는 모양에 대 한 추천 되었습니다 했다. 이후이 실험 동물에서 수행 되지 않습니다, 우리 셀 모양 정확도 대 한이 실험 되 나.
체 외에서 세포 모양의 뇌관 확장 단계에 대 한 전략 또한 다르다. 생체 외에서 모양, 반전 녹음 방송의 Mg2 +2′-OH acylation 위치에서 중지합니다. 밴드의 강도 acylation 속도1에 비례와 32P 표시 뇌관 연장 따라서 밴드 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 나타납니다. 셀 모양, 반전 녹음 방송 2′-OH에서 무작위 돌연변이 생성 adduct 미네소타2 +존재 위치. 각 뉴클레오티드의 mutational 속도 깊이 차세대 시퀀싱에서 캡처할 수 수 있습니다 그리고 단일 뉴클레오티드 해상도 모양 반응 다음 산출 될 수 있다.
셀 모양에 대 한 잠재적인 문제는 낮은 신호 대 잡음 비율 (즉, 2′-OH 그룹의 대부분은 수정, 수정 되지 않은 시퀀스 다음-세대 시퀀싱에서 읽기의 대부분을 차지 하는 동안). 최근, 2′-OH를 풍부 하 게 하는 방법 RNA, vivo에서 모양 (icSHAPE)를 클릭 하 여 참조, 수정 장 실험실25에 의해 개발 되었다. 이 농축 방법 RNA 상호 작용, 특히 전체 transcriptome 심문 등 약한 작은 분자를 공부에 유리한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 외에서 모양, 그것이 고품질 동종 RNA 서식 파일을 사용 하 여 중요 합니다. 그러나 T7 전사,, 종종 다른 유형의 시퀀스36을 생성합니다. 특히, ± 1에는 3′-무시할 수 없는 수익률36 와 뉴클레오티드와 시퀀스는 일반적으로 polyacrylamide 젤 정화에 의해 제거 될 어렵다. 유형이 다른 RNA 템플릿을 때로는 어려운 결과 해석 하는 뇌관 확장 제품의 시퀀싱 젤 프로 파일…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 NIH R01 보조금 (NS094721, K.A.J.)에 의해 가능 하 게 되었다.
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
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