Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA
Summary
Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2′-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.
Abstract
En el proceso de desarrollo de fármacos de moléculas pequeñas metas de RNA, se desea dilucidar los cambios estructurales en sus interacciones con secuencias de RNA Diana. Aquí proporcionamos una detallada en vitro y en célula selectiva 2′-hidroxilo acilación analizadas por extensión primer Protocolo (forma) para estudiar el cambio estructural del RNA en presencia de una droga experimental para la atrofia muscular espinal (SMA), la supervivencia de la neurona de motor (SMN)-C2 y en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2. En la forma in vitro, una secuencia de ARN de 140 nucleótidos que contienen SMN2 exón 7 transcripción por polimerasa del RNA T7, doblada en presencia de SMN-C2 y modificada posteriormente por un reactivo de acilación suave 2′-OH, imidazolide ácido 2-methylnicotinic (NAI). Esta aducción 2′-OH-NAI más es sondeado por un 32extensión primer marcado con P y resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Por el contrario, Acilación de la 2′-OH en la forma en las células ocurre in situ con SMN-C2 límite ARN celular en las células vivas. La secuencia de pre-mRNA del exón 7 en el gen SMN2, y mutaciones inducidas por la forma en la extensión de la cartilla, entonces fue amplificada por PCR y secuenciación de próxima generación. Comparando las dos metodologías, forma in vitro es un método más económico y no requiere de poder computacional a visualizar los resultados. Sin embargo, el modelo in vitro de RNA forma derivada a veces se desvía de la estructura secundaria en el contexto celular, probablemente debido a la pérdida de todas las interacciones con proteínas RNA-que atan. FORMA en la célula no necesita un lugar de trabajo de material radiactivo y produce una precisa estructura secundaria del RNA en el contexto celular. Además, forma en las células es generalmente aplicable para una mayor gama de RNA las secuencias (~ 1.000 nucleótidos) utilizando secuenciación de próxima generación, en comparación con el in vitro de la forma (~ 200 nucleótidos) que generalmente se basa en el análisis de la página. En el caso del exón 7 en el pre-mRNA de SMN2, derivados de la forma in vitro y en células RNA modelos son similares entre sí.
Introduction
Acilación selectiva 2′-hidroxilo por extensión de la cartilla (forma) es un método de medición de la cinética de cada nucleótido en una secuencia de ARN de interés y elucidar la estructura secundaria en el nucleótido resolución1. Metodologías de la forma, tanto en condiciones in vitro2,3,4 (RNA purificado en un sistema de amortiguamiento definida) y en vida de células de mamífero5,6, se han desarrollado para investigar la secundaria estructura de secuencias de RNA de longitud media (normalmente < 1.000 nucleótidos de forma en las células y < 200 nucleótidos de forma in vitro). Es particularmente útil para evaluar los cambios estructurales en el receptor del RNA en Unión a interacción con RNA molécula pequeña metabolitos2,4,para7,8 y estudiar acciones mecánicas de moléculas de RNA de metas durante el desarrollo de drogas9,10.
Descubrimiento de fármacos dirigidos a RNA recientemente ha atraído atención en laboratorios académicos y la industria farmacéutica11,12 a través de diferentes enfoques y estrategias13,14,15 ,16. Ejemplos recientes de RNA-dirigido a pequeñas moléculas para el uso clínico incluyen dos medicamentos experimentales estructuralmente distintas, LMI-07017 y RG-791618,19, para la atrofia muscular espinal (SMA), que demostró prometedor resultados en la fase II ensayos clínicos20. Ambas moléculas fueron demostrado a la supervivencia de la blanco de la neurona de motor (SMN) 2 pre-mRNA y regular el proceso de empalme del SMN2 gene6,17,21. Previamente demostramos la aplicación de in vitro y forma en las células en un examen de los cambios estructurales objetivo RNA en presencia de un análogo de la RG-7916 conocido como SMN-C26.
En principio, forma mide la tasa de Acilación de 2′-OH de cada nucleótido de una secuencia de ARN en presencia de cantidades excesivas de un reactivo de acilación por enfriamiento de una manera imparcial. El reactivo de acilación no es estable en agua, con una vida media corta de (p. ej., T1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhídrido; o 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide ácido 2-methylnicotinic, NAI)22 y la insensibilidad a la identidad de las bases de23. Esto resulta en una acilación más favorable de los grupos 2′-OH de bases flexibles, que pueden transformarse en una evaluación precisa de la dinámica de cada nucleótido. En concreto, un nucleótido en un par de base es generalmente menos reactivo que no emparejada a un reactivo modificar 2′-OH, como NAI y 1 M 7.
Mirando la fuente de la plantilla del RNA y en 2′-OH acilación ocurre, forma generalmente puede ser clasificada en forma in vitro y en células. En usos de vitro forma purificada T7 transcrito RNA y carece de un contexto celular en diseños experimentales. En forma de celdas, la transcripción del RNA plantilla y 2′-OH acilación ocurren dentro de las células vivas; por lo tanto, los resultados pueden recapitular el modelo estructural del RNA en un contexto celular. FORMA en las células se ha referido como vivo forma para la forma en las células vivas en la literatura24. Ya que este experimento no se realiza en un animal, llama este experimento como forma en las células para la exactitud.
Las estrategias para la etapa de extensión de la cartilla de forma in vitro y en células también son diferentes. En la forma in vitro, reversa de la transcripción se detiene en la posición de la acilación de 2′-OH en presencia de Mg2 +. Por lo tanto, una extensión de la cartilla de 32P etiqueta aparece como una banda en electroforesis del gel de poliacrilamida (PAGE) y la intensidad de la banda es proporcional a la acilación tipo1. En forma de celdas, la transcripción reversa genera mutaciones aleatorias en el 2′-OH aducción posición en presencia de Mn2 +. La tasa mutacional de cada nucleótido puede ser capturada por en secuenciación de próxima generación de profundidad, y luego se puede calcular la reactividad de la forma en la resolución del solo-nucleótido.
Un problema potencial para la forma en las células es la baja relación de señal a ruido (es decir, la mayoría de los grupos 2′-OH es sin modificar, mientras que las secuencias no modificadas ocupan la mayor parte de la lectura en secuenciación de próxima generación). Recientemente, un método para enriquecer el 2′-OH modificado RNA, que se refiere como en vivo haga clic en forma (icSHAPE), fue desarrollado por el laboratorio de Chang25. Este método de enriquecimiento puede ser ventajoso en el estudio de débiles pequeñas moléculas como interacciones RNA, especialmente en un interrogatorio de todo el transcriptoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la forma in vitro, es fundamental utilizar plantilla de RNA homogéneo de alta calidad. Transcripción de T7, sin embargo, a menudo produce secuencias heterogéneas36. Especialmente, secuencias de nucleótidos de ±1 en el 3′-terminal con rendimientos no despreciable36 son generalmente difíciles de extirpar por purificación del gel de poliacrilamida. Plantilla de RNA heterogéneo puede resultar en más de un sistema de la señal en el gel de secuenciación perfiles del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue posible gracias a la subvención del NIH R01 (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
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