Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar
Summary
Detaljerade protokoll för både in vitro och i cell selektiv 2′-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) experiment för att fastställa det sekundära strukturerar av pre-mRNA sekvenser av intresse i närvaro av en RNA-targeting liten molekyl är presenteras i denna artikel.
Abstract
I processen för läkemedelsutveckling RNA-targeting små molekyler önskas belysa de strukturella förändringarna vid deras interaktioner med målet RNA sekvenser. Vi tillhandahåller häri en detaljerad in vitro- och selektiv i cell 2′-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) protokoll för att studera den RNA strukturförändringen i närvaro av en drog för spinal muskelatrofi (SMA), överlevnad motorneuronen (SMN)-C2, och i exon 7 av pre-mRNA av SMN2-genen. I in vitro-form, är en RNA-sekvens av 140 nukleotider som innehåller SMN2 exon 7 transkriberas av T7 RNA-polymeras, vikta i närvaro av SMN-C2 och därefter ändras av en mild 2′-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Detta 2′-OH-NAI addukt är ytterligare trotsat av 32P-märkt primer filändelsen och lösas av polyakrylamid gelelektrofores (sidan). Omvänt, 2′-OH acylation i cell formen sker på plats med SMN-C2 bunden cellulära RNA i levande celler. Den pre-mRNA-sekvensen av exon 7 i SMN2 genen, tillsammans med form-inducerade mutationer i tillägget primer, förstärktes sedan av PCR och omfattas av nästa generations sekvensering. Jämföra de två metoderna, in vitro-form är en mer kostnadseffektiv metod och kräver inte datorkraft att visualisera resultat. In vitro-form-derived RNA modellen avviker dock ibland från det sekundära strukturerar i cellulära sammanhang, sannolikt på grund av förlusten av alla interaktioner med RNA-bindande proteiner. I cell form behöver inte ett radioaktivt material arbetsplatsen och ger en mer exakt RNA sekundära struktur inom ramen för cellulära. Dessutom i cell formen är vanligtvis tillämplig för ett större utbud av RNA-sekvenser (~ 1000 nukleotider) genom att använda nästa generations sekvensering, jämfört med in vitro-forma (~ 200 nukleotider) som vanligtvis bygger på analys. I fall av exon 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro och i cell form härrör är RNA modellerna lika varandra.
Introduction
Selektiv 2′-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) är en metod för mätning av kinetik av varje nukleotid i en RNA-sekvens av intresse och klarlägga det sekundära strukturerar på single-nucleotide upplösning1. FORM metoder, både i in vitro-villkor2,3,4 (renat RNA i en definierad buffertsystem) och levande däggdjursceller5,6, har utvecklats för att undersöka sekundärt struktur av medium längd RNA sekvenser (vanligtvis < 1 000 nukleotider för i cell form och < 200 nukleotider för in vitro-form). Det är särskilt användbart att utvärdera strukturella förändringar i receptorn RNA vid bindning till RNA-interagera småmolekylära metaboliter2,4,7,8 och studera mekanistiska åtgärder av målobjekt RNA molekyler under drog utveckling9,10.
RNA-targeting läkemedelsutveckling har nyligen dragit uppmärksamhet i akademiska laboratorier och läkemedelsindustrin11,12 via olika metoder och strategier13,14,15 ,16. Aktuella exempel på RNA-targeting små molekyler för klinisk användning är två strukturellt distinkta experimentella läkemedel, LMI-07017 och RG-791618,19, för spinal muskelatrofi (SMA), som visade lovande resultat i fas II kliniska prövningar20. Båda molekylerna var visat att målet överlevnad motorneuronen (SMN) 2 pre-mRNA och reglera processen skarvning av SMN2 genen6,17,21. Vi visat tidigare tillämpning av in vitro- och i cell form i en undersökning av de strukturella förändringarna som mål RNA i närvaro av en analog till RG-7916 kallas SMN-C26.
I princip mäter form 2′-OH acylation andelen varje nukleotid av en RNA-sekvens i närvaro av överskjutande belopp av själv släcka acylation reagens på ett opartiskt sätt. Acylation reagens är inte stabila i vatten, med en kort halveringstid på (t.ex., T1/2 = 17 s för 1-metyl-7-nitroisatoic bauxit; eller 1 M 7, ~ 20 min för 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 och okänslighet för identitet baser23. Detta resulterar i en mer gynnsam acylation av 2′-OH grupper av flexibla baser, som kan omvandlas till en korrekt bedömning av dynamiken i varje nukleotid. Specifikt, är en nukleotid i en base-par oftast mindre reaktiva än en oparade till 2′-OH modifiera reagens, såsom NAI och 1 M 7.
Tittar på källan till mallen RNA och där 2′-OH acylation sker, kan formen generellt delas in i in vitro och i cell form. I vitro form använder renat T7 transkriberade RNA och saknar en cellulär sammanhang i experimentell design. I cell form inträffa både RNA mall transkription och 2′-OH acylation inom levande celler; resultaten kan därför sammanfatta RNA strukturella modellen i cellulära sammanhang. I cell form har hänvisats till som i vivo form för formen i levande celler i den litteratur24. Eftersom detta experiment inte utförs i ett djur, kallas vi detta experiment i cell form för noggrannhet.
Strategierna för primer filändelsen scenen av in vitro och i cell form är också olika. I in vitro-form slutar omvänd Transkription vid 2′-OH acylation position i närvaro av Mg2 +. En 32P-märkt primer filändelsen förefaller därför som ett band i polyakrylamid gelelektrofores (sidan) och intensiteten i bandet är proportionell till acylation kurs1. I cell form, omvänd Transkription genererar slumpmässiga mutationer på 2′-OH addukt position i närvaro av Mn2 +. Mutationsanalys andelen varje nukleotid kan fångas av i djup nästa generations sekvensering, och formen reaktiviteten på single-nucleotide upplösning kan sedan beräknas.
Ett potentiellt problem för i cell form är låg signal-brus-förhållandet (dvs. en majoritet av de 2′-OH-grupperna är oförändrad, medan de omodifierade sekvenserna upptar mest av Läs i nästa generations sekvensering). Nyligen, en metod för att berika 2′-OH modifierade RNA, som avses i vivo Klicka formen (icSHAPE), utvecklades av Chang laboratorium25. Denna berikning metod kan vara förmånligt studera svaga små molekyler som RNA interaktioner, särskilt i en transkriptom-wide förhör.
Protocol
Representative Results
Discussion
I in vitro-form är det viktigt att använda högkvalitativa homogena RNA mall. T7 transkription, ger dock ofta heterogena sekvenser36. Särskilt, är sekvenser med ±1 nukleotid på 3′-terminus med försumbar avkastning36 ofta svåra att avlägsnas genom Polyakrylamidgelen rening. Heterogena RNA mall kan resultera i mer än en uppsättning av signalera i sekvensering gel profilering av primer filändelsen produkten, vilket ibland gör det svårt att tolka resultatet. Riboz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har gjorts möjlig genom NIH R01 bidraget (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
