Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

פרוטוקול נמוכים של ניתוח טביעת רגל ותלייה תיבת הבדיקה עבור עכברים חלה הלחץ איפוק כרונית

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/59027
Automatic Translation
1, 1
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

Summary

פרוטוקול נמוכים המורכב ניתוח טביעת רגל ותלייה תיבת הבדיקה לאחר ריסון מתח הוא שימושי עבור הערכת הפרעות תנועה של העכבר מודל.

Abstract

הפרעה בהליכה לעתים קרובות נצפית בחולים עם הפרעות תנועה דגמים העכבר משמש לטיפול בהפרעות תנועה, והרצתי ניתוח הוא מבחן התנהגותי חשוב כדי לקבוע אם העכברים לחקות את הסימפטומים של המטופלים. חסרונות המנוע הם לעיתים קרובות המושרה על ידי מתח כאשר אין פנוטיפ המוטורית הספונטנית נצפית במודלים העכבר. לכן, והרצתי ניתוח ואחריו מתח הטעינה יהיה שיטה רגישה להערכת של פנוטיפ מנוע במודלים של העכבר. עם זאת, החוקרים מול הדרישה של מכשירים יקרים כדי לקבל תוצאות כמותיות באופן אוטומטי והרצתי ניתוח הליכה. עבור מתח, מתח טעינה על ידי שיטות פשוטות ללא מנגנוני יקר הדרושים עבור הלם חשמלי והכריחו פועל הוא רצוי. לכן, אנו מציגים את פרוטוקול נמוכים ופשוט המורכב ניתוח טביעת רגל עם נייר ודיו, תלוי תיבת הבדיקה להעריך המוטורית, מתח טעינה המוגדר על-ידי ריסון עם צינור חרוטי. הגירעונות מנוע של עכברים אותרו בהצלחה על ידי פרוטוקול זה.

Introduction

הפרעות תנועה מוגדרים הפרעות של מערכת העצבים מראה של עודף או במחסור של תנועות רצוניות או אוטומטית1. בפרט, הפרעה בהליכה מתועדת בתדירות גבוהה בקרב חולים עם התנועה הפרעות2,3,4. לכן, והרצתי ניתוח הוא מבחן ההתנהגות מתאימים עבור האימות של מודלים חייתיים של הפרעות תנועה. בעכברים, הילוך אוטומטי ניתוחים בוצעו להליכה-מהירות טבעית5 ו במהירויות מתכוונן על-ידי הליכון6,7. ניתוחים אלה מספקים תוצאות כמותיות של דהירה באופן אוטומטי. שיטה חלופית לזהות הפרעה בהליכה זה נקרא ניתוח טביעת רגל. לאחר תיוג שהסוליות של כפות הרגליים עם דיו, עכברים ללכת על נייר, העקבות מנותחים. בתחילה, וזלין, אבקת פחם שימשו כדי להמחיש את טביעת רגל8ולאחר מכן הוחלפו דיו על נייר פוליגרף9 ומפתח הצילומי על נייר הצילום10. שיטה זולה יותר פחות רעיל באמצעות דיו ונייר מכל השיטות האחרות נשאר עד היום11. ניתוח טביעת רגל הוא פחות יקר לעומת ניתוח אוטומטיות5,6,7 , יהיה שימושי כדי להעריך את הפרעות תנועה במודלים של העכבר של החוקרים ללא קרנות מחקר שופע .

התליה תיבת הבדיקה הוא סוג של ארבע בדיקות תלוי של האיבר, באמצעות תיל מהכלוב המכסה12 , חוט רשת שינוי מסך13. התיבה תהיה מכשירים עם מכסה רשת rotatable בראש תיבת לאורך סרגל מרכז. בנוסף ניתוח הילוך, הבדיקה ניתן בזול ובקלות לבצע. לכן, ערכנו התליה תיבת הבדיקה להעריך כוח אחיזה ושיווי משקל, בנוסף לניתוח טביעת רגל של פרוטוקול זה.

מתח גורם הסימפטומים של התנועה הפרעות14,15. חסרונות המנוע לעתים קרובות שנגזרות לחצים כרוניים מספר גם כאשר אין פנוטיפ המוטורית הספונטנית נצפית במודלים העכבר התנועה הפרעת16,17,18. איפוק הוא אחת השיטות הנפוצות עבור מתח טעינה בעכברים, כי החיה אינה פיזית הנפגעת19 , עלות פחות לעומת שיטות אחרות כגון הלם חשמלי עם מכשיר ייעודי והכריח פועל עם שימוש של הליכון. הריסון על ידי צינור, אשר מבוצע על ידי כליאת עכבר צינור חרוטי מחזיק 50 מ ל, היא קלה יותר מאשר שיטות אחרות כגון חוט רשת שינוי מסננת האיבר בדוחק, עטיפה של חיה עם גזה (שנסקרה20). בנייר זה, אנו מסכמים את הפרוטוקולים של טביעת הרגל ניתוח ואת תיבת תלוי מבחן לאחר ריסון על ידי צינור. פרוטוקול זה יעזור לנו להשתמש בעכבר מודלים של הפרעות תנועה ללא פנוטיפ מנוע ספונטנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים נערכו בצורה הומאנית. מוסדיים חיות ניסוי הוועדה של jichi ב רפואי האוניברסיטה אישרה את המחקר. המחקר נערך לפי תקנה המוסדי חיות ניסוי, מנחה בסיסי עבור נכונה התנהגות של חיות ניסוי ופעילויות הקשורות מוסדות מחקר אקדמיים תחת הסמכות השיפוטית של MEXT של יפן. עכברים בשימוש פרוטוקול זה היה כפי שתוארה לעיל21.

1. תלוי תיבת הבדיקה

  1. להקליט את המשקל של כל עכבר. לסמן את הזנב על ידי עט סימון על הפליה בודדים (למשל., קו כפול קווים, קווים משולשת).
    הערה: עקומות גדילה משמשים עבור אינדקס של בריאות כללית22.
  2. הצב והעכברים ניסיוני חדר לפחות 30 דקות לפני המבחן ההתנהגותי. הגדר את תיבת תלויה, אשר מורכב של תיבה ברורה (25 x 25 x 40 ס מ3) עם מכסה רשת rotatable העליונה (איור 1). ניתן לסובב את מכסה רשת לאורך בר מרכזי כך העליון היפוך 180 מעלות.
  3. לשים עכבר במרכז המכסה רשת. . תנמיך את מכסה רשת למעלה בצד בזהירות
  4. למדוד ההשהיה סתיו (תלוי זמן) של העכבר מ המכסה רשת.
    הערה: אם העכבר לא נופל בתוך 5 דקות, להקליט ההשהיה כמו 5 דקות.
  5. להחזיר את העכבר על הכלוב הביתה. נקה תיבת לתלייה עם אתנול 70% לאחר כל בדיקה.

2. ניתוח טביעת רגל

הערה: בעקבות התיבה תלוי מבחן, לבצע ניתוח טביעת רגל.

  1. להגדיר את המסלול (איור 2 א).
    1. חותכים פיסת נייר לבן (29.7 ס מ x 42 סנטימטרים x 0.09 מ מ) longitudinally לתוך שלוש אורך רוחב שווה. הגדר נייר לבן (9.9 ס"מ x 42 ס מ) על השולחן.
    2. תניח את הקופסא המטרה כהה בקצה הדיסטלי של הנייר. . שים את השני תיבות (כ אורך זהה לזה של הנייר) עם הקירות משני צידי המסלול, מניעת הבריחה של עכברים.
    3. לשים דיו שחור, דיו אדום לתוך צלחות פטרי נפרדות (35 מ מ קוטר).
  2. אימון.
    הערה: לבצע את האימון עצמו רק בגיל ארבעה שבועות של גיל.
    1. לשים עכבר בקצה הפרוקסימלית של העיתון (עם הפנים הראש לכיוון תיבת המטרה). תן העכבר הליכה מהסוף proximal לתיבה המטרה. הסר את העכבר מהתיבה המטרה. אם העכבר מפסיק על הנייר, דחף בעדינות את העכבר אל תיבת המטרה על ידי האצבע.
    2. החזק את העכבר על ידי האוחז את עורפה בין האגודל לאצבע כדי להגביל את התנועה של forelimbs. לאחר מכן, לאחוז הגב והזנב בין הכדור של האגודל האצבעות האחרות כדי להגביל את התנועה של hindlimbs.
      הערה: אחזקות לא מספקת של עכבר תוצאות שהכלים של דיו על הבגדים.
    3. לטבול את החלק התחתון של forelimbs בדיו אדומה, את החלק התחתון של hindlimbs בדיו שחור. מיד לשים את העכבר בקצה הפרוקסימלית של העיתון (עם הפנים הראש לכיוון תיבת המטרה). תן העכבר הליכה מהסוף proximal לתיבה המטרה. אם העכבר מפסיק על הנייר, דחף בעדינות את העכבר אל תיבת המטרה על ידי האצבע.
    4. הסר את העכבר מהתיבה המטרה. ללכת הפעלת מבחן.
  3. מבחן הפעלה.
    1. בעקבות התרגול, להגדיר את המסלול ותחפש עם יצירה חדשה לחתוך נייר לבן.
    2. החזק את העכבר על ידי האוחז את עורפה בין האגודל לאצבע כדי להגביל את התנועה של forelimbs. לאחר מכן, לאחוז הגב והזנב בין הכדור של האגודל האצבעות האחרות כדי להגביל את התנועה של hindlimbs.
    3. לטבול את החלק התחתון של forelimbs בדיו אדומה, את החלק התחתון של hindlimbs בדיו שחור. מיד לשים את העכבר על קצה הפרוקסימלית של הנייר. תן העכבר הליכה מהסוף proximal לתיבה המטרה.
      הערה: כי עכברים מעדיף בחושך, הליכה הופך וקולה העכבר מתקרב תיבת המטרה כהה. אם העכבר מפסיק על הנייר, דחף בעדינות את העכבר אל תיבת המטרה על ידי האצבע. אז, אם לא עקבות אמין לבדיקה (ראה שלב 2.4. ניתוח של עקבות עבור פרטים) כי העכבר הפסיק, שנית את הפעלת מבחן.
    4. להחזיר את העכבר לכלוב הביתה מהתיבה המטרה. נקה תיבת המטרה עם אתנול 70% לאחר כל מפגש הבדיקה. מילה נהדרת בעיתון מודפס-רגל.
  4. ניתוח של עקבות
    1. להשיג שלוש מדידות של כל פרמטר (סטרייד פיאנו אורכים של forelimbs ורוחב בסיס hindlimbs, קבלה, הינד, חפיפה בין forelimb לבין hindlimb, איור 2B) עם סרגל מעיתון מודפס-רגל.
      הערה: כי עקבות קצות לקרע, לעתים קרובות להציג וריאציות גדולים עקב עצירה או רץ, בחר את החלק עם דפוס בהליכה יציבה של טביעות. החלק האמצעי של נייר מודפס הרגל יהיה בדרך כלל מתאימים לניתוח.
      1. אורך צעד, למדוד את המרחקים בין חלקי הכפה (למשל, כרית כף הרגל או הבוהן) אותו.
      2. עבור רוחב הבסיס הקדמי, למתוח קו ברור בין עקבות קבלה ברציפות ימינה (או שמאלה). לאחר מכן, למדוד את האורך של קו אנכי מהמקלדת של טביעת הקדמי (ימינה או שמאלה) אל קו הנמתח בין העקבות ימינה (או שמאלה).
      3. עבור רוחב בסיס האחוריות, למתוח קו ברור בין עקבות האחוריות ברציפות ימינה (או שמאלה). לאחר מכן, למדוד את האורך של קו אנכי מהמקלדת של טביעת האחוריות (ימינה או שמאלה) אל קו הנמתח בין העקבות ימינה (או שמאלה).
      4. עבור חפיפה, למדוד את המרחק בין קבינה קדמית רפידות של שמאל (או ימין) טביעות הרגליים האחוריות.
    2. ממוצע של שלוש מדידות עבור כל אדם. השתמש הממוצע בודדים של כל פרמטר עבור ניתוח סטטיסטי.
      1. לשימוש האורך פסיעה, הממוצע של הממוצעים בודדים של הצעדים ימינה ושמאלה.
      2. לשימוש האסימטריה של אורך צעד, הערך המוחלט של ההבדל בין ממוצעים בודדים של האיבר השמאלי אורך צעד נכון האיבר.
      3. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים האחרים (רוחב בסיס קדמי, רוחב הבסיס האחוריות ו חפיפה), להשתמש הממוצע בודדים ישירות.

3. איפוק מתח טעינה

  1. הכנה של צינורות איפוק.
    1. לעשות חורים 16 (כ 2 מ מ קוטר) צינור חרוטי 50 מ ל (30 מ"מ בקוטר x 115 מ מ אורך) לאורך סימני סולם (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 מ"ל) ואת הישבן של כל סולם לסמן על-ידי התרגיל מרובע (איור 3). תעשה חור על קצה הצינור חרוט 50 מ ל (כ 5 מ מ קוטר) עבור הנשימה שתורידו הטיפ. לעשות בו חור (כ 4 מ"מ קוטר) שבתחתית מכסה הצינורית להעביר את הזנב של עכברים.
  2. מתח טעינה
    1. הצב והעכברים בחדר ניסיוני.
    2. להחזיק עכבר על ידי האוחז את עורפה בין האגודל לאצבע. הזן את העכבר לתוך הצינור איפוק מהראש. עוברים את הזנב דרך החור הכיפה. לסגור את הפקק.
      הערה: להגביל את תנועת forelimb, כי עכברים דוחים הזנת את הצינור על ידי forelimbs.
    3. שמור את העכבר סגור כבר שעתיים על שולחן בטמפרטורת החדר. להסיר את העכבר מהצינור איפוק ולחזור אל הכלוב הביתה.
      הערה: הצינורות איפוק חוזר לאחר שטיפה ויבש.

4. ניסיוני לוח זמנים (איור 4):

  1. לבצע התליה תיבת בדיקה וניתוח טביעת הרגל באותו היום רוב בגיל 4 שבועות (ראו שלב 1. מבחן תיבת לתלייה, שלב 2. ניתוח טביעת רגל לפרטים) כמידה בסיסית על עכברים כל לפני הקיבוץ 'קבוצת לחץ', 'קבוצה ללא מתח'.
    הערה: בערך 8-10 עכברים בתוך 2-3 המלטות עשוי להיות מתאים לשימוש בניסוי. ניתוח טביעת רגל רוב בגיל 4 שבועות מורכב הפעלות הבדיקה והדרכה.
  2. לחלק באופן אקראי העכברים 'קבוצה לחץ', 'קבוצה ללא מתח'.
    הערה: כאשר העכברים משמשים המורכב מספר המלטות, לחלק את הארנבונים מאותה באופן שווה בשתי הקבוצות. מספר בכל קבוצה מורכבת בערך 4-5 עכברים.
  3. להחיל את הלחץ איפוק לקבוצה' סטרס' שש פעמים במשך שבועיים (ראה שלב 3. איפוק מתח טעינה לפרטים).
    הערה: 6 פעמים איפוק מוחלים כל שבועיים, ואחריו תלייה תיבת ניתוח, בדיקה של טביעת הרגל של גיל 6-12 שבועות. אל תחיל את הלחץ איפוק ביום הבדיקה של התליה תיבת בדיקה וניתוח טביעת רגל.
  4. לבצע התליה תיבת הבדיקה המושב בדיקת של ניתוח טביעת הרגל באותו יום בשעה 6, 8, 10, ו בגיל 12 שבועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העכברים זכר משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים של Atp1a3 (Atp1a3+ −) כי הם המודל העכבר עבור התחלה מהירה פוקאלית parkinsonism פראי-סוג הארנבונים מאותה שימשו ב פרוטוקול זה. Atp1a3+ − הראה נמוך באופן משמעותי פסיעה אורכים של forelimb ו- hindlimb יותר מאלה של סוג בר-גיל (5A איור , איור 5B, לפתוח מעגל וכיכר) 4 שבועות. 'לחוץ' Atp1a3+ − הראה נמוך באופן משמעותי פסיעה אורכים של שני הגפיים מאלה של 'שאינם הדגיש' Atp1a3+ − בגיל 8 שבועות של גיל (איור 5A , איור 5B, מעגל סגור ופתוח). Asymmetries פסיעה האורכים של שני הגפיים לא היו שונים באופן משמעותי בכל קבוצות של עכברים בכלל הגילאים (5C איור , איור 5D). הבסיס הקדמי חופף של שני הגפיים היו גם דומה בכל קבוצות בכלל הגילאים (איור 5EG, H). הבסיס האחוריות היה רחב יותר משמעותית אצל 'לחוץ' Atp1a3+ − מזה בעכברים פראי-סוג 'לחוץ' ב 10 שבועות של גיל (איור 5F, מעגל סגור וכיכר). ולכן, איפוק הלחץ גרם גירעונות מוטוריים (פסיעה קצרה ובסיס רחב) של Atp1a3+ −.

התליה תיבת הבדיקה בוצעה כדי להעריך את ידית כוח ושיווי משקל ביום הבדיקה של ניתוח טביעת רגל. אין הבדלים משמעותיים זמן התלייה נצפו בשבועות 4 10 עכברים הישן (איור 6). בגיל 12 שבועות, תלוי שעת 'לחוץ' פראי-סוג עכברים היה באופן משמעותי יותר מאשר זו של קבוצות אחרות (איור 6, סגור מרובע). איפוק מתח ממושך תלוי זמן בעכברים פראי-סוג בלבד, אבל לא Atp1a3+ −. לפיכך, גירעון המנוע של Atp1a3+ − היה להבדיל בין פראי-סוג עכברים על ידי ריסון מתח.

משקל הגוף הוא אינדקס של בריאות כללית22. מדדנו את משקל הגוף של עכברים ביום הבדיקה של התליה תיבת הבדיקה, ניתוח טביעת רגל. אין הבדלים משמעותיים נצפו בכל קבוצות של עכברים בכל גיל (איור 7). לפיכך, הלחץ איפוק לא השפיע על הבריאות הכללית של עכברים.

Figure 1
איור 1: תלוי תיבת מכשיר עם מכסה רשת rotatable. עכבר הוצב במרכז המכסה עם רשת שינוי, ואז מכסה רשת הורחקה למעלה בצד. ההשהיה הנפילה של העכבר מ המכסה רשת נועד למדוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח טביעת רגל. המסלול (A) עבור ניתוח טביעת רגל. עכבר מצוירים רגל (forelimbs: דיו אדום; hindlimbs: דיו שחור) היה מותר ללכת מהסוף proximal לתיבה המטרה. (B) תמונת הנציגה של טביעת רגל ומדידה של פרמטרים. שלוש מדידות של כל פרמטר (forelimb ו- hindlimb סטרייד פיאנו אורך, רוחב של הקדמי ואת הבסיס הינד, חפיפה בין forelimb ו hindlimb), התקבלו נייר מודפס-רגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: איפוק מתח על ידי צינור חרוטי מחזיק 50 מ ל. הצינור איפוק יש חור בשביל לנשום, חור בשביל להעביר את הזנב, 16 חורים זרימת אוויר. העכבר נשמר בצינור כבר שעתיים בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הזמנים ניסיוני של התליה תיבת בדיקה וניתוח טביעת רגל עם טעינת מתח כרוני איפוק. ניתוח טביעת רגל ואת תיבת תלויה במבחן בוצעו בגיל 4 שבועות. לאחר מכן, העכברים היו פצל 'לחוץ' וקבוצות 'שאינם הדגיש'. עבור הקבוצה 'לחוץ', הלחץ איפוק הוחל 6 פעמים ב 2 שבועות עד גיל 12 שבועות. גם קבוצות, ניתוח טביעת רגל וגם תיבת תלויה במבחן בוצעו פעם אחת בכל שבועיים עד גיל 12 שבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נציג מתוצאות ניתוח טביעת רגל. ניתוח טביעת רגל בוצעה עם בן בשבוע-4 Atp1a3+ − (a3) ועכברים פראי-סוג (wt) (N = 19 ו 17, בהתאמה). לאחר מכן, Atp1a3+ − פראי-סוג העכברים היו להתחלק לקבוצות 'לחוץ' ו- 'שאינם הדגיש'. ניתוח טביעת רגל נערך עבור 'ללא הדגיש' Atp1a3/ −, 'שאינם הדגיש' פראי-סוג, 'לחוץ' Atp1a3/ −, ' והדגיש ' פראי-סוג עכברים החל מגיל 6-12 שבועות (פתיחת חוגים, N = 9; פתח ריבועי, N = 8; עיגולים מוצקים , N = 10; ריבועי מוצק, N = 9, בהתאמה). (א) סטרייד פיאנו אורך forelimb. (B) סטרייד פיאנו אורך hindlimb. (ג) האסימטריה של forelimb צעדים אורך. אסימטריה (D) אורך צעדים hindlimb. רוחב (E) בין forelimbs. רוחב (F) בין hindlimbs. (G) חפיפה בין שמאל forelimb hindlimb. (H) חפיפה בין forelimb נכון hindlimb. הנתונים הם זאת אומרת ± SD. Statistical ניתוחים (t -test עבור עכברים בת 4 בשבוע) ו pairwise t -test עם שיטת ההתאמה הולם עבור 6-בשבוע ה-12 עכברים בוצעו על ידי R23. # p <.05, עבור 'ללא הדגיש' Atp1a3+ − 'שאינם הדגיש' שאקבל פראי-סוג. p <.05, עבור 'לחוץ' Atp1a3+ − ' והדגיש ' פראי-סוג עכברים. + p <.05, עבור 'ללא הדגיש' ו- 'לחוץ' Atp1a3+ − עכברים. איור 5A -F שונתה מ הפניה18 עם אישור של Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: תוצאות נציג של תלויים תיבת בדיקות. התליה תיבת הבדיקה בוצעה עם Atp1a3+ − (a3) ועכברים פראי-סוג (wt) רוב בגיל 4 שבועות. לאחר מכן, Atp1a3+ − פראי-סוג העכברים היו להתחלק לקבוצות 'לחוץ' ו- 'שאינם הדגיש'. תלוי זמן של שבוע-בת 4 Atp1a3+ / − (פתיחת חוגים, N = 19) ופראי-סוג (פתח ריבועי, N = 17) עכברים ומחזיק זמן של 6-12-בת שבוע 'שאינם הדגיש' Atp1a3+ − (פתיחת חוגים, N = 9), 'שאינם הדגיש' פראי-סוג (ובכיכרות פתוחות N = 8), 'לחוץ' Atp1a3+ − (עיגולים מוצקים, N = 10), ופראי-סוג של ' לחוץ' (ריבועי מוצק, N = 9) עכברים שורטטו בסרגל לוגריתמי. הנתונים הם זאת אומרת ± SD. Statistical ניתוחים (t -test עבור עכברים בת 4 בשבוע) ו pairwise t -test עם שיטת ההתאמה הולם עבור 6-בשבוע ה-12 עכברים בוצעו על ידי R23. p <.05, עבור 'לחוץ' Atp1a3+ − ' והדגיש ' פראי-סוג עכברים. $ p <.05, עבור עכברים פראי-סוג 'שאינם הדגיש', 'לחוץ'. + p <.05, עבור 'ללא הדגיש' Atp1a3+ − ' והדגיש ' פראי-סוג עכברים. נתונים יש הודפס מ הפניה18 עם אישור של Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: התוצאות נציג של עקומות גדילה. הגוף משקולות נמדדו של Atp1a3+ − (a3) ועכברים פראי-סוג (wt) רוב בגיל 4 שבועות (פתיחת חוגים, N = 19; פתח ריבועי, N = 17, בהתאמה). לאחר מכן, Atp1a3+ − פראי-סוג העכברים היו להתחלק לקבוצות 'לחוץ' ו- 'שאינם הדגיש'. גוף משקולות בין 6 ל 12 שבועות של גיל 'שאינם הדגיש' Atp1a3+ − (פתיחת חוגים, N = 9), 'שאינם הדגיש' פראי-סוג (פתח ריבועי, N = 8), 'לחוץ' Atp1a3/ − (עיגולים מוצקים, N = 10), ' והדגיש ' פראי-סוג (מוצק ריבועים, N = 9) עכברים נמדדו. הנתונים הם זאת אומרת ± SD. Statistical ניתוחים (t -test עבור עכברים בת 4 בשבוע) ו pairwise t -test עם שיטת ההתאמה הולם עבור 6-בשבוע ה-12 עכברים בוצעו על ידי R23. איור 7 שונתה מ הפניה18 עם אישור של Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח טביעת רגל ואת תיבת תלוי לבדוק מבחנים התנהגותיים פשוט וזול בתפקוד המוטורי של עכברים. הפנוטיפים neurobehavioral במספר דגמים העכבר זוהו בהצלחה על ידי בדיקות אלה. לדוגמה, קוצר אורך צעד נוירודגנרטיביות24, אורך מוגברת של פסיעה סימטרית תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה25, אורך מוגברת של חפיפה של מחלת הנטינגטון26 ופוקאלית27, ו בסיס מורחב28,אטקסיה29, אנגלמן תסמונת30 ו פוקאלית31 היו הוכח על-ידי ניתוח טביעת רגל. בנוסף, הזמן תלוי קצר יותר מזה של העכברים שליטה נצפתה במודל עכבר של ניוון שרירים דושן32. לכן, שתי בדיקות שמתואר הנייר הזה יהיה שימושי להערכת תפקוד מוטורי של עכברים.

יש שלב קריטי של פרוטוקול זה להשיג העקבות חדה. חשוב מאוד לשים את העכבר על נייר מיד לאחר הטבעית שהסוליות של הגפיים דיו כדי למנוע התייבשות. זה הכרחי לסיים את השלבים immersing (שלבים 2.2.3 ו- 2.3.3) תוך זמן קצר. החיסרון של הפרוטוקול של ניתוח טביעת רגל הוא כי הפרמטרים מתקבל מוגבלות לאלה פשוטות שאינן כוללות מידע זמני (למשל, משך ההליכה מחזור וצעד רצף של כל רגל) מידע פיזי (למשל, הלחץ של טביעת בהתבסס על לוח LED רגיש למגע). כאשר נדרש מידע זמני והפיזי, יש להשתמש מכשיר ניתוח הילוך אוטומטי. לחלופין, ניתן לקבל מידע זמני של דפוס הילוך על ידי המצלמה במהירות גבוהה33. חיסרון נוסף הוא מדידת הפרמטרים על נייר מודפס-רגל הוא יותר מפרך יותר אוטומטית והרצתי ניתוח הליכה. עבור יישומים עתידיים, הפיתוח של תוכנית עבור איסוף נתונים semiautomated או אוטומטית נייר מודפס רגל יידרש להפחית את המאמצים שהושקעו מדידת הפרמטרים.

עבור טעינת מתח, הכולל מספר ומשך בכל הפעלה יכולים להיות מגוונים של פרוטוקול זה. איפוק מתח נערכה עם משכים שונים מספר יישומים (למשל., יחיד עבור 5 דקות34, יחיד עבור 24 שעות35, h 12 x 5 מפגשים36הפעלות h 6 x 3137, שבתוך הפניה למעורר 20). לידע שלנו, אין מחקר שיטתי מדאיג את ההשפעות של המספר הכולל ומשך בכל הפעלה בתפקוד המוטורי של עכברים. הפעילות של עכברים בשדה הפתוח מושפע על ידי יחיד מתח טעינה של 1 h38 או 2 h אבל לא על ידי זה 15 דקות19. משך הטעינה מתח ממושך עלול להוביל גירעונות מוטוריות קשות. עבור המספר של מתח loadings, העמידה של עכברים הופכת רחב יותר מזה של שאינם הדגיש עכברים לאחר 36 פעמים של מתח טעינה (h 1 פעמיים בשבוע), אבל לא אחרי 30 פעמים39. מתח כרוני איפוק (6 שעות ליום 31 ימים רצופים) מחמירה rotarod ביצועים במודל עכבר של מחלת פרקינסון37. התוצאות שלנו הראה את הזמן תלוי של 'לחוץ' Atp1a3+ − עכברים הפכה קצרה יותר מזו של העכברים פראי-סוג 'לחוץ' לאחר 24 פעמים של מתח טעינה (בגיל 12 שבועות של גיל), אך לא לאחר 18 פעמים או פחות (בגיל 4, 6, 8, ו 10 שבועות של גיל). לכן, חוזרות ונשנות מתח הטעינה נדרשת עבור אינדוקציה של מסוימים גירעונות מוטורי בעכברים, למרות אפשרות להוציא את אינדוקציה של גירעונות מנוע לאחר תקופה ארוכה מן ההתחלה של יחיד או מספר פעמים של מתח טעינה. כאשר עכברים אינם מראים הפנוטיפ neurobehavioral ב פרוטוקול זה, ההמלצה היא להגדיל את המספר הכולל והמשך של מתח טעינה בכל הפעלה. לעומת זאת, כאשר העכברים מראים חריגות הילוך אחד או מספר פעמים של מתח טעינה, ובמספר הניתנות להפחתה.

בסופו של דבר, הביצועים של והליכה תלויה עשויה להיות מושפעת רגשית תווים התנהגותית (למשל, פעילות והחרדה) מלבד אלה של חוסר תפקוד מוטורי. עכברים עם חרדה גבוהה ועם היפראקטיביות להפעיל לעתים קרובות (במקום הליכה) לתיבה המטרה. עכברים מציג התנהגות דיכאון יכול ללכת עם עצירות תכופות. לכן, דוגמת סוטה טביעת רגל לא ניתן בשל גירעונות מוטוריים. ובכך, לאשר את חריגות הילוך הנובע רק חסרונות המנוע, ביצוע נוספים בדיקות זה להעריך את תכונות רגשיות (פעילות: בדיקת שדה פתוח; חרדה: פתח שדה, גבוהות וגם מבחן מבוך; התנהגות דיכאון: נאלץ לשחות מבחן) לאחר פרוטוקול זה כפי שתואר לעיל18 מומלץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI JSPS (יפן האגודה לקידום המדע ע) (מענק הסיוע עבור C מחקר מדעי), להעניק מספר 18K 07373 (בחיי) וה סובסידיות עבור אוניברסיטאות פרטיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanging box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking pen ZEBRA MO-120-MC-BK
Goal box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/ Accessory for apparatus of balanced beam test
Boxes O’hara & Co. - Side wall of runway
Black ink Shin-asahi -
Red ink Maruyamakogyo BC-6
Disposable Petri Dish Corning 351008 Petri dishes (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3 Askul 701-712 White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tube Corning 430829
Square drill KAKURI Corporation DIY FACTORY (K32-0313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warner, T. T. Movement disorders. Practical Guide to Neurogenetics. , Elsevier Health Sciences. (2008).
  2. Brashear, A., DeLeon, D., Bressman, S. B., Thyagarajan, D., Farlow, M. R., Dobyns, W. B. Rapid-onset dystonia-parkinsonism in a second family. Neurology. 48 (4), 1066-1069 (1997).
  3. Linazasoro, G., Indakoetxea, B., Ruiz, J., Van Blercom, N., Lasa, A. Possible sporadic rapid-onset dystonia-parkinsonism. Movement Disorders. 17 (3), 608-609 (2002).
  4. Svetel, M., Ozelius, L. J., et al. Rapid-onset dystonia-parkinsonism: case report. Journal of Neurology. 257 (3), 472-474 (2010).
  5. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. T. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. PAIN. 102 (1), 203-209 (2003).
  6. Berryman, E. R. DigigaitTM quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  7. Beare, J. E., Morehouse, J. R., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
  8. Rushton, R., Steinberg, H., Tinson, C. Effects of a single experience on subsequent reactions to drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 20, 99-105 (1963).
  9. Lee, C. C., Peters, P. J. Neurotoxicity and behavioral effects of thiram in rats. Environmental health perspectives. 17, 35-43 (1976).
  10. van der Zee, C. E., Schuurman, T., Traber, J., Gispen, W. H. Oral administration of nimodipine accelerates functional recovery following peripheral nerve damage in the rat. Neuroscience Letters. 83 (1-2), 143-148 (1987).
  11. Leroy, T., Stroobants, S., Aerts, J. -M., D'Hooge, R., Berckmans, D. Automatic analysis of altered gait in arylsulphatase A-deficient mice in the open field. Behavior Research Methods. 41 (3), 787-794 (2009).
  12. Sango, K., McDonald, M. P., et al. Mice lacking both subunits of lysosomal beta-hexosaminidase display gangliosidosis and mucopolysaccharidosis. Nature Genetics. 14 (3), 348-352 (1996).
  13. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments. (76), e2610 (2013).
  14. Djamshidian, A., Lees, A. J. Can stress trigger Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgey, and Psychiatry. 85 (8), 879-882 (2014).
  15. Brashear, A., Dobyns, W. B., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3. Brain. 130 (Pt 3), 828-835 (2007).
  16. Kirshenbaum, G. S., Saltzman, K., Rose, B., Petersen, J., Vilsen, B., Roder, J. C. Decreased neuronal Na+,K+-ATPase activity in Atp1a3 heterozygous mice increases susceptibility to depression-like endophenotypes by chronic variable stress. Genes, Brain and Behavior. 10 (5), 542-550 (2011).
  17. DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioral Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
  18. Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioral Brain Research. 272, 100-110 (2014).
  19. Zimprich, A., Garrett, L., et al. A robust and reliable non-invasive test for stress responsivity in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 125 (2014).
  20. Buynitsky, T., Mostofsky, D. I. Restraint stress in biobehavioral research: recent developments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (7), 1089-1098 (2009).
  21. Ikeda, K., Satake, S., et al. Enhanced inhibitory neurotransmission in the cerebellar cortex of Atp1a3-deficient heterozygous mice. The Journal of Physiology. 591 (13), 3433-3449 (2013).
  22. Crawley, J. N. Motor functions. What's Wrong with My Mouse?. , John Wiley & Sons. (2007).
  23. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.R-project.org/ (2014).
  24. Wils, H., Kleinberger, G., et al. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3858-3863 (2010).
  25. Eilam, R., Peter, Y., et al. Selective loss of dopaminergic nigro-striatal neurons in brains of Atm-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12653-12656 (1998).
  26. Lin, C. -H., Tallaksen-Greene, S., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  27. Dang, M. T., Yokoi, F., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
  28. Glynn, D., Drew, C. J., Reim, K., Brose, N., Morton, A. J. Profound ataxia in complexin I knockout mice masks a complex phenotype that includes exploratory and habituation deficits. Human Molecular Genetics. 14 (16), 2369-2385 (2005).
  29. Becker, E. B. E., Oliver, P. L., et al. A point mutation in TRPC3 causes abnormal Purkinje cell development and cerebellar ataxia in moonwalker mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (16), 6706-6711 (2009).
  30. Heck, D. H., Zhao, Y., Roy, S., LeDoux, M. S., Reiter, L. T. Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Human Molecular Genetics. 17 (14), 2181-2189 (2008).
  31. Kirshenbaum, G. S., Dawson, N., et al. Alternating hemiplegia of childhood-related neural and behavioural phenotypes in Na+,K+-ATPase α3 missense mutant mice. PLoS ONE. 8 (3), e60141 (2013).
  32. Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioral Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
  33. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3 (Pt 7), e1175 (2015).
  34. Cecchi, M., Khoshbouei, H., Morilak, D. A. Modulatory effects of norepinephrine, acting on alpha1 receptors in the central nucleus of the amygdala, on behavioral and neuroendocrine responses to acute immobilization stress. Neuropharmacology. 43 (7), 1139-1147 (2002).
  35. Chu, X., Zhou, Y., et al. 24-hour-restraint stress induces long-term depressive-likephenotypes in mice. Scientific Reports. 6, 32935 (2016).
  36. Freeman, M. L., Sheridan, B. S., Bonneau, R. H., Hendricks, R. L. Psychological Stress Compromises CD8+ T cell control of latent herpes simplex virus type 1 infections. The Journal of Immunology. 179 (1), 322-328 (2007).
  37. Lauretti, E., Di Meco, A., Merali, S., Praticò, D. Chronic behavioral stress exaggerates motor deficit and neuroinflammation in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Translational Psychiatry. 6, e733 (2016).
  38. Quartermain, D., Stone, E. A., Charbonneau, G. Acute stress disrupts risk assessment behavior in mice. Physiology and Behavior. 59 (4-5), 937-940 (1996).
  39. Bannon, D. The Behavioural effects of stress and aluminum toxicity on a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Parkinsonism-dementia complex. , 1-186 (2015).

Tags

התנהגות גיליון 143 ניתוח טביעת רגל תלוי תיבת הבדיקה איפוק מתח בדיקה התנהגותית עכבר בתפקוד המוטורי
פרוטוקול נמוכים של ניתוח טביעת רגל ותלייה תיבת הבדיקה עבור עכברים חלה הלחץ איפוק כרונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost… More

Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. J. Vis. Exp. (143), e59027, doi:10.3791/59027 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter