Summary
Das kostengünstige Protokoll bestehend aus Footprint Analysen und hängen-Box-Test nach Zurückhaltung Stress nützlich ist für die Bewertung der Bewegungsstörungen des Mausmodells.
Abstract
Gangstörung ist häufig bei Patienten mit Bewegungsstörungen zu beobachten. In Mausmodellen für Bewegungsstörungen verwendet ist Ganganalyse wichtiger Verhaltens Test um festzustellen, ob die Mäuse die Symptome des Patienten zu imitieren. Motorische Defizite werden oft durch Stress induziert, wenn keine spontane motor Phänotyp in den Mausmodellen beobachtet wird. Ganganalyse, gefolgt von Stress laden wäre daher eine sensitive Methode zur Bewertung des motorischen Phänotyps in Mausmodellen. Allerdings haben Forscher das Erfordernis einer teuren Apparatur quantitative Ergebnisse automatisch Ganganalyse einzuholen. Für Stress ist Stress laden durch einfache Methoden ohne teure Apparate für elektrischen Schlag erforderte und zwang ausgeführt wünschenswert. Daher stellen wir eine einfache und kostengünstige Protokoll bestehend aus Footprint Analysen mit Papier und Tinte, hängend-Box-Test zur Beurteilung der motorischen Funktion, und Stress-Belastung durch Zurückhaltung mit einem konischen Rohr definiert. Die motorischen Defizite von Mäusen wurden erfolgreich durch dieses Protokoll erkannt.
Introduction
Bewegungsstörungen werden als Störungen des Nervensystems zeigen ein Überschuss oder Mangel an freiwilligen oder automatische Bewegungen1definiert. Gangstörung ist besonders häufig bei Patienten mit Bewegung Störungen2,3,4dokumentiert. Ganganalyse deshalb einen geeigneten Verhaltens Test für die Validierung von Tiermodellen von Bewegungsstörungen. Bei Mäusen wurden automatisierte Gangart Analysen durchgeführt zum Wandern bei natürlichen Geschwindigkeit5 und einstellbare Geschwindigkeiten Laufband6,7. Diese Analysen liefern quantitative Ergebnisse des Gehens automatisch. Eine alternative Methode zur Erkennung von Gangstörungen nennt Footprint Analysen. Nach Kennzeichnung der Unterseite der Füße mit Tinte, Mäuse Fuß auf dem Papier, und die Spuren ausgewertet. Zunächst, Vaseline und pulverisierter Kohle wurden verwendet, um den Fußabdruck8visualisieren, und wurden dann durch Tinte auf Polygraph Papier9 und fotografische Entwickler auf Fotopapier10ersetzt. Eine billigere und weniger toxische Methode mit Tinte und Papier als die anderen Methoden bleibt bislang11. Footprint Analysen ist weniger teuer im Vergleich mit automatisierten Analyse5,6,7 und wäre sinnvoll, die Bewegungsstörungen in Mausmodellen für die Forscher ohne reichlich Forschungsgelder bewerten .
Das hà ¤ ngen-Box-Test ist eine Art von vier Gliedmaßen hängen Tests mit Draht Käfig Deckel12 und Maschendraht Bildschirm13. Die Box ist eine Vorrichtung mit drehbaren Mesh Deckel auf der Oberseite Box entlang einen Mittelsteg. Neben Ganganalyse kann der Test kostengünstig und einfach durchgeführt werden. Daher führten wir das hà ¤ ngen-Box-Test, Griffstärke und Balance, zusätzlich zu den Footprint Analysen in diesem Protokoll zu bewerten.
Stress induziert die Symptome der Bewegung Störungen14,15. Motorische Defizite werden oft von mehreren chronischen Spannungen induziert, auch wenn keine spontane motor Phänotyp in Mausmodellen eine Bewegung Störung16,17,18beobachtet wird. Zurückhaltung ist eine der häufigsten verwendeten Methoden für Stress bei Mäusen, laden, weil das Tier nicht körperlich geschädigten19 und Kosten ist weniger im Vergleich mit anderen Methoden wie Stromschläge mit eigenen Apparat und gezwungen, mit Einsatz von einem Laufband laufen. Zurückhaltung mit einer Röhre, die durchgeführt wird, durch die Beschränkung einer Maus in eine gelochte 50 mL konische Rohr ist einfacher als andere Methoden wie z. B. Draht Sieb, getapten Bein und Verhüllung des Tieres mit Gaze (bewertete20 Mesh). In diesem Artikel fassen wir die Protokolle des Footprint Analysen und die hängenden Box testen nach Zurückhaltung durch ein Rohr. Dieses Protokoll würde helfen, Maus-Modellen von Bewegungsstörungen ohne spontane motor Phänotyp zu verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden auf humane Weise durchgeführt. Der institutionellen Tier Experiment Ausschuss des Jichi medizinischen Universität bewilligt. Die im Einklang mit den institutionellen Verordnung für Tier-Experiment und grundlegende Leitlinie für die ordnungsgemäße Durchführung der Tier Experiment und damit zusammenhängende Tätigkeiten in akademischen Forschungseinrichtungen unter der Gerichtsbarkeit des MEXT Japan Studie wurde. In diesem Protokoll verwendeten Mäuse wurden21beschrieben.
(1) hängen-Box-Test
- Nehmen Sie das Gewicht jeder Maus. Markieren Sie das Heck durch Markierung Feder für individuelle Diskriminierung (z.B.., eine Linie, Linien und drei Zeilen).
Hinweis: Wachstumskurven sind für einen Index der allgemeinen Gesundheit22verwendet. - Legen Sie die Mäuse im Versuchsraum mindestens 30 min vor dem behavioral Test. Legen Sie die hängende Feld, bestehend aus einer klaren Box (25 X 25 X 40 cm3) mit einem drehbaren Mesh Deckel auf der Oberseite (Abbildung 1). Die Netz-Deckel kann entlang einer zentralen Bar gedreht werden, so dass oben 180 Grad gekippt wird.
- Setzen Sie eine Maus in der Mitte des Deckels Netz. Drehen Sie vorsichtig den Mesh Deckel Seite nach unten.
- Messen Sie die Herbst-Latenz (hängende Zeit) der Maus aus dem Netz-Deckel.
Hinweis: Wenn die Maus nicht innerhalb von 5 min fällt, notieren Sie die Latenz als 5 min. - Die Maus zu Hause Käfig zurück. Reinigen Sie die hängenden Kasten mit 70 % Ethanol nach jedem Test.
2. Footprint Analysen
Hinweis: Im Anschluss an die hängenden Box test, Footprint Analysen durchführen.
-
Einrichten die Start-und Landebahn (Abbildung 2A).
- Schneiden Sie ein Stück weißes Papier (29,7 x 42 cm x 0,09 mm) längs in drei Längen von gleicher Breite. Legen Sie ein Stück weißes Papier (9,9 x 42 cm) auf dem Tisch.
- Setzen Sie die dunklen Ziel Kasten am distalen Ende des Papiers. Setzen Sie andere Boxen (etwa die gleiche Länge wie die des Papiers) mit den Wänden auf beiden Seiten der Start-und Landebahn, die Flucht von Mäusen zu verhindern.
- Schwarze Tinte und roter Tinte in separaten Petrischalen (35 mm Durchmesser) genommen.
-
Trainingseinheit.
Hinweis: Führen Sie das Training nur bei 4 Wochen alt.- Setzen Sie eine Maus am proximalen Ende des Papiers (Gesicht der Kopf auf den Ziel-Quader). Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen. Entfernen Sie die Maus aus dem Ziel-Feld. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger.
- Halten Sie die Maus durch das Greifen des Genicks zwischen Daumen und Zeigefinger um die Bewegung der Vorderbeine zu begrenzen. Greifen Sie dann, den Rücken und die Rute zwischen den Ball mit dem Daumen und die anderen Finger, die Bewegung der Hintergliedmaßen zu begrenzen.
Hinweis: Unzureichende Durchführung eines Maus-führt zu Flecken der Tinte auf Kleidung. - Tauchen Sie die Böden der Vorderbeine in roter Tinte und die Böden der Hinterbeine in schwarzer Tinte. Sofort setzen Sie die Maus auf das proximale Ende des Papiers (Gesicht der Kopf auf den Ziel-Quader). Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Ziel-Feld. Gehen Sie zu den Test-Session.
-
Sitzung zu testen.
- Nach der Trainingseinheit, richten Sie die Start-und Landebahn für Spuren mit einem neuen Schnitt Stück weißes Papier.
- Halten Sie die Maus durch das Greifen des Genicks zwischen Daumen und Zeigefinger um die Bewegung der Vorderbeine zu begrenzen. Greifen Sie dann, den Rücken und die Rute zwischen den Ball mit dem Daumen und die anderen Finger, die Bewegung der Hintergliedmaßen zu begrenzen.
- Tauchen Sie die Böden der Vorderbeine in roter Tinte und die Böden der Hinterbeine in schwarzer Tinte. Sofort setzen Sie die Maus auf das proximale Ende des Papiers. Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen.
Hinweis: Da Mäuse Dunkeln bevorzugen, wird das Wandern gleichmäßiger als die Maus Feld dunkle Ziel nähert. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger. Dann, wenn zuverlässige Fußabdrücke für die Analyse nicht erhalten werden (siehe Punkt 2.4. Analyse der Footprints für details) weil die Maus gestoppt, wiederholen Sie die Test-Session. - Die Maus zu Hause Käfig aus dem Ziel-Feld zurück. Reinigen Sie das Ziel-Feld mit 70 % Ethanol nach jedem Test-Session. Trocknen Sie die Fuß-bedruckte Papier an der Luft.
-
Analyse der Spuren
- Erhalten Sie drei Messungen der einzelnen Parameter (Länge der Vorderbeine und Hinterbeine, Vorder- und Hinterbeine Basis breiten zu schreiten, Überschneidung von Vorderbein und Megalosauridae, Abb. 2 b) mit einem Lineal von Fuß-bedruckte Papier.
Hinweis: Da Spuren der proximalen und distalen enden häufig große Unterschiede wegen Beendigung zeigen oder ausgeführt wird, wählen Sie den Teil mit einem stetigen Gangbild von Fußspuren. Der mittlere Teil des Fuß-bedruckten Papiers werden in der Regel geeignet für die Analyse.- Messen Sie für die Schrittlänge die Abstände zwischen den gleichen Teilen von der Pfote (z. B. Pfote Pad oder Zehe).
- Zeichnen Sie für die vorderen Basisbreite eine Linie zwischen aufeinander folgenden rechts (oder links) vordere Fußabdrücke. Dann messen Sie die Länge der vertikalen Linie aus dem Pad des linken (oder rechten) vordere Footprints auf der Linie zwischen den Spuren rechten (oder linken).
- Zeichnen Sie für die Hinterbeine Basisbreite eine Linie zwischen aufeinander folgenden rechts (oder links) hinteren Fußspuren. Dann messen Sie die Länge der vertikalen Linie aus dem Pad des linken (oder rechten) hinteren Footprints auf der Linie zwischen den Spuren rechten (oder linken).
- Überlappung messen Sie den Abstand zwischen Pads von links (oder rechts) Vorder- und Hinterbeine Fußabdrücke.
- Durchschnitt der drei Messungen für jeden einzelnen. Verwenden Sie die einzelnen Durchschnitt der einzelnen Parameter für die statistische Auswertung.
- Verwenden Sie für die Schrittlänge den Durchschnittswert der einzelnen Durchschnitte von der linken und rechten Fortschritte.
- Verwenden Sie für Asymmetrie der Schrittlänge der Absolute Wert der Differenz zwischen einzelnen Durchschnitte der linken Extremität und rechten Extremität Schrittlänge.
- Verwenden Sie für die statistische Auswertung der anderen Parameter (vordere Basisbreite, Hinterbeine Basisbreite und Überlappung) den individuellen Durchschnitt direkt.
- Erhalten Sie drei Messungen der einzelnen Parameter (Länge der Vorderbeine und Hinterbeine, Vorder- und Hinterbeine Basis breiten zu schreiten, Überschneidung von Vorderbein und Megalosauridae, Abb. 2 b) mit einem Lineal von Fuß-bedruckte Papier.
3. Zurückhaltung Stress be-
-
Vorbereitung der Zurückhaltung Röhren.
- 16 Löcher (ca. 2 mm im Durchmesser) in einem 50 ml konische Röhrchen (30 mm Durchmesser X 115 mm in der Länge) entlang der Skala Markierungen zu machen (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) und die Rückseite jeder Skala Markieren von quadratischen Bohrmaschine (Abbildung 3). Machen Sie ein Loch an der Spitze von 50 mL konische Rohr (ca. 5 mm Durchmesser) für die Atmung durch das Abschneiden der Spitze. Machen Sie ein Loch (ca. 4 mm im Durchmesser) in der Röhre Kappe, das Ende der Mäuse zu übergeben.
-
Stress-Belastung
- Legen Sie die Mäuse in den Versuchsraum.
- Halten Sie eine Maus durch das Genick zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger greifen. Geben Sie die Maus in der Zurückhaltung Rohr aus dem Kopf. Übergeben Sie das Heck durch das Loch in der Kappe. Schließen Sie den Deckel.
Hinweis: Schränken die Bewegung der Vordergliedmaße, weil Mäuse ablehnen, Eintritt in das Rohr durch die Vorderbeine. - Halten Sie die Maustaste 2 h auf dem Schreibtisch bei Raumtemperatur eingeschlossen. Entfernen Sie die Maus aus der Tube Zurückhaltung und dem Hause Käfig zurück.
Hinweis: Die Zurückhaltung Rohre können nach dem Waschen und trocken wiederverwendet werden.
4. experimentelle Zeitplan (Abbildung 4):
- Führen Sie das hà ¤ ngen box-Test und den Footprint Analysen am selben Tag im Alter von 4 Wochen (siehe Schritt 1. Hängende Boxentest und Schritt 2. Footprint Analysen für Details) als eine Basismessung auf alle Mäuse vor die Gruppierung in "Stress-Gruppe" und "non-Stress-Gruppe".
Hinweis: Ca. 8-10 Mäuse in 2-3 Würfe geeignet sein können, in einem Experiment zu verwenden. Footprint Analysen im Alter von 4 Wochen besteht aus Trainings und Test. - Teilen Sie nach dem Zufallsprinzip die Mäuse in ein "Stress-Gruppe" und "non-Stress-Gruppe".
Hinweis: Wenn die Mäuse verwendet werden, bestehend aus mehreren Würfen teilen Sie Wurfgeschwistern gleichmäßig in beide Gruppen. In jeder Gruppe besteht aus ca. 4-5 Mäusen. - Zuweisen des Zurückhaltung-Stress "Stress-Gruppe" 6-Mal im Laufe von zwei Wochen (siehe Schritt 3. Zurückhaltung Stress Laden für Details).
Hinweis: 6 Mal Zurückhaltung gelten alle zwei Wochen, gefolgt von einer hängenden box Test und Footprint Analysen von 6-12 Wochen alt. Gelten nicht die Zurückhaltung Stress am Testtag der hängenden box Test und den Footprint Analysen. - Führen Sie das hà ¤ ngen box Test und Test-Session des Footprint Analysen am selben Tag bei 6, 8, 10 und 12 Wochen alt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die heterozygoten männliche Mäuse Atp1a3 (Atp1a3+ / −), die im Mausmodell für schnellen Wirkungseintritt Dystonie Parkinsonismus und Wildtyp Wurfgeschwistern wurden in dieses Protokoll verwendet. Atp1a3+ / − zeigte deutlich kürzere Schrittlängen der Vordergliedmaße und Megalosauridae als der Wildtyp bei 4 Wochen alt (Abb. 5A und 5 b Abbildung, Kreis und Quadrat öffnen). "Gestresst" Atp1a3+ / − zeigte deutlich kürzere Schrittlängen der beiden Glieder als die "betont" Atp1a3+ / − 8 Wochen alt (Abbildung 5A und 5 b herauszufinden, geschlossene und offene Kreis). Asymmetrien der Schrittlängen der beiden Glieder unterschieden sich nicht signifikant in allen Gruppen von Mäusen überhaupt im Alter (Abbildung 5 und Abbildung 5). Die vordere Basis und Überschneidungen der beiden Glieder waren auch in allen Gruppen ähnlich Alter (Abb. 5EG, H). Die hintere Basis war deutlich breiter in der "betont" Atp1a3+ / − als die in den "gestressten" Wildtyp Mäusen bei 10 Wochen alt (Abbildung 5F, geschlossenen Kreis und Quadrat). Also Zurückhaltung Stress verursacht motorische Defizite (kurze Schrittlänge und breite Basis) der Atp1a3+ / −.
Das hà ¤ ngen-Box-Test wurde durchgeführt, um die Griffstärke und Gleichgewicht am Testtag der Footprint Analysen zu bewerten. Keine signifikanten Unterschiede in hängenden Zeit beobachtet in 4 bis 10 Wochen alte Mäusen (Abbildung 6). Im Alter von 12 Wochen war das hängende Mal von "gestresst" Wildtyp Mäusen deutlich länger als die der anderen Fraktionen (Abbildung 6, quadratische geschlossen). Zurückhaltung Stress verlängert hängenden Zeit in Wildtyp Mäusen nur, aber nicht in Atp1a3+ / −. So die motorischen Defizit von Atp1a3+ / − wurde von Wildtyp Mäusen durch Zurückhaltung Stress zu unterscheiden.
Körpergewicht ist ein Index der allgemeinen Gesundheit22. Wir messen das Körpergewicht von Mäusen am Testtag des Behangs Boxentest und Footprint Analysen und keine signifikanten Unterschiede beobachtet in allen Gruppen von Mäusen in allen Altersgruppen (Abbildung 7). So Zurückhaltung Stress keinen Einfluss auf die allgemeine Gesundheit von Mäusen.
Abbildung 1: hängende Box Apparat mit einem drehbaren Mesh Deckel. Eine Maus war in der Mitte des Deckels Netz platziert, und dann der Mesh-Deckel war aufgedreht Seite nach unten. Die Herbst-Latenz der Maus aus dem Netz-Deckel soll gemessen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Footprint Analysen. (A) Start-und Landebahn für Footprint Analysen. Ein Fuß malte Maus (Vorderbeine: roter Tinte; Hintergliedmaßen: schwarze Tinte) durfte aus dem proximalen Ende der Ziel-Box laufen. (B) repräsentatives Bild der Fußabdruck und Messung von Parametern. Drei Messungen der einzelnen Parameter (Vordergliedmaße und Megalosauridae Längen, breiten der vorderen und hinteren Basis zu schreiten, Überschneidung von Vorderbein und Megalosauridae) wurden von Fuß-bedruckte Papier erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zurückhaltung Belastung durch konische Rohr gelocht 50 mL. Die Zurückhaltung Schlauch hat ein Loch zum Atmen, ein Loch für das Bestehen der Schweif und 16 Löcher für die Luftzirkulation. Maus wurde in der Röhre für 2 h bei Raumtemperatur aufbewahrt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: experimentelle Zeitplan der hängenden box-Test und den Footprint Analysen mit dem chronischen Zurückhaltung Stress laden. Footprint Analysen und die hängenden Box testen wurden im Alter von 4 Wochen durchgeführt. Dann wurden die Mäuse "gestresst" und "unterstrichen" Gruppen aufgeteilt. Für die "gestresst" Gruppe war die Zurückhaltung Belastung 6 Mal in 2 Wochen bis zum Alter von 12 Wochen angewendet. Für Gruppen, Footprint Analysen sowohl der hängenden Box Test wurden einmal pro 2 Wochen bis zum Alter von 12 Wochen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: repräsentative Ergebnisse der Footprint Analysen. Footprint Analysen erfolgte mit 4 Wochen alten Atp1a3+ / − (a3) und Wildtyp (wt) Mäuse (N = 19 und 17, beziehungsweise). Dann, Atp1a3+ / − und Wildtyp Mäusen wurden in "gestresst" und "unterstrichen" Gruppen aufgeteilt. Footprint Analysen führte für "unterstrichen" Atp1a3+ / −, "betonte" Wildtyp, "gestresst" Atp1a3+ / −, und "gestresst" Wildtyp Mäusen von 6-12 Wochen alt (Öffnen Kreise, N = 9; öffnen Quadrate, N = 8; solide Kreise , N = 10; feste Plätze, N = 9, beziehungsweise). (A) Länge der Vordergliedmaße zu schreiten. (B) Länge der Megalosauridae zu schreiten. (C) Asymmetrie der Vordergliedmaße schreitet Länge. (D) Asymmetrie der Megalosauridae schreitet Länge. (E) Breite zwischen Vorderbeine. (F) Breite zwischen Hintergliedmaßen. (G) Überschneidungen zwischen linken Vorderbein und Megalosauridae. (H) Überschneidungen zwischen rechten Vorderbein und Megalosauridae. Daten sind der Mittelwert ± SD statistische Analysen (t -Test für 4 Wochen alten Mäusen) und paarweise t -Test mit dem Holm Anpassungsverfahren für 6-12 Wochen alten Mäusen wurden durch R23durchgeführt. # p <.05, für "betont" Atp1a3+ / − und "gestresst" Wildtyp Mäusen. p <.05, für "betont" Atp1a3+ / − und "gestresst" Wildtyp Mäusen. + p <.05, für "unterstrichen" und "unterstrichen" Atp1a3+ / − Mäuse. Abbildung 5A -F wurde von Referenz18 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: repräsentative Ergebnisse der hängenden Kasten Tests. Das hà ¤ ngen-Box-Test erfolgte mit Atp1a3+ / − (a3) und Wildtyp (wt) Mäuse im Alter von 4 Wochen. Dann, Atp1a3+ / − und Wildtyp Mäusen wurden in "gestresst" und "unterstrichen" Gruppen aufgeteilt. Hängen Zeit von 4 Wochen altes Baby Atp1a3+ / − (öffnen Sie Kreise, N = 19) und Wildtyp (öffnen Quadrate, N = 17) Mäuse und hängen Zeit von 6-12 Wochen alten "nicht gestressten' Atp1a3+ / − (Öffnen Kreise, N = 9),"betont"Wildtyp (offenen Plätzen N = 8), "betont" Atp1a3+ / − (solid Kreise, N = 10), und "gestresst" Wildtyp (feste Plätze, N = 9) Mäuse wurden auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Daten sind der Mittelwert ± SD statistische Analysen (t -Test für 4 Wochen alten Mäusen) und paarweise t -Test mit dem Holm Anpassungsverfahren für 6-12 Wochen alten Mäusen wurden durch R23durchgeführt. p <.05, für 'gestresste' Atp1a3+ / − und "gestresst" Wildtyp Mäusen. $ p <.05, für "unterstrichen" und "gestresst" Wildtyp Mäusen. + p <.05, für "betont" Atp1a3+ / − und "gestresst" Wildtyp Mäusen. Daten hat von Referenz18 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: repräsentative Ergebnisse der Wachstumskurven. Körpergewicht wurden gemessen, der Atp1a3+ / − (a3) und Wildtyp (wt) Mäuse im Alter von 4 Wochen (öffnen Sie Kreise, N = 19; öffnen Quadrate, N = 17, beziehungsweise). Dann, Atp1a3+ / − und Wildtyp Mäusen wurden in "gestresst" und "unterstrichen" Gruppen aufgeteilt. Gewichte zwischen 6 und 12 Wochen des Alters von nicht belasteten Körper Atp1a3+ / − (Öffnen Kreise, N = 9), "betont" Wildtyp (öffnen Sie Quadrate, N = 8), "gestresst" Atp1a3+ / − (solid Kreise, N = 10), und "gestresst" Wildtyp (massiv Quadrate, N = 9) Mäuse wurden gemessen. Daten sind der Mittelwert ± SD statistische Analysen (t -Test für 4 Wochen alten Mäusen) und paarweise t -Test mit dem Holm Anpassungsverfahren für 6-12 Wochen alten Mäusen wurden durch R23durchgeführt. Abbildung 7 wurde von Referenz18 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Footprint Analysen und die hängenden Box testen sind einfache und kostengünstige Verhaltens Tests für die Motorik von Mäusen. Die Neurobehavioral Phänotypen in verschiedenen Mausmodellen wurden erfolgreich durch diese Tests nachgewiesen. Z. B. verkürzte Schrittlänge Amyotrophe Lateralsklerose24, Zunahme der Länge asymmetrische Schrittlänge in Ataxie-Teleangiektasie25, Zunahme der Länge der Überlappung in Huntington-Krankheit26 und Dystonie27, und verbreiterte Basis Ataxie28,29, Angelman Syndrom30 und Dystonie31 wurden durch den Footprint Analysen demonstriert. Darüber hinaus wurde im Mausmodell der Duchenne-Muskeldystrophie-32hängenden kürzer als bei der Kontroll-Mäusen beobachtet. Beide Tests, die in diesem Dokument beschriebenen wäre so nützlich für die Bewertung der motorischen Dysfunktion von Mäusen.
Es ist ein entscheidender Schritt dieses Protokolls, die scharfen Footprints zu erhalten. Es ist sehr wichtig, eine Maus zu Papier zu bringen, sofort nach dem Eintauchen der Böden der Gliedmaßen in Tinte trocknen zu vermeiden. Es ist notwendig, deutschsprachiger Schritte (2.2.3 und 2.3.3) in kurzer Zeit zu beenden. Ein Nachteil dieses Protokolls Footprint Analysen ist, dass die Parameter erhalten auf einfachsten beschränken, die keine zeitliche Informationen beinhalten (z. B. Dauer des Gehens Zyklus und Abfolge von jedem Fuß Schritt) und physischen Informationen (z. B. Druck von Fußabdruck basierend auf berührungsempfindliche LED-Panel). Bei der zeitlichen und physischen Informationen erforderlich ist, muss eine automatisierte Gangart Analyse Vorrichtung verwendet werden. Alternativ erhalten Sie von High-Speed-Kamera33Zeitinformationen an Gangbild. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Messung der Parameter auf dem Fuß-gedruckten Papier mühsamer als automatisierte Ganganalyse ist. Für zukünftige Anwendung müssen die Entwicklung eines Programms zur parallelisierter oder automatisierte Datenerfassung von Fuß-bedruckte Papier, die Messparameter Aufwand zu verringern.
Für die Stress-Belastung können die Gesamtzahl und die Dauer pro Sitzung in diesem Protokoll variiert werden. Zurückhaltung Stress mit verschiedenen Laufzeiten und Anzahl der Anwendungen durchgeführt wurde (z. B.., für 5 min34, einzeln für 24 h35, 12 h x 5 Sitzungen36und 6 h x 31 Sitzungen37, überprüft in Ref. 20). Nach unserer Kenntnis betrifft keine systematische Studie die Auswirkungen der Gesamtzahl und Dauer pro Sitzung auf die Motorik von Mäusen. Die Aktivität von Mäusen in das freie Feld wird durch einzelne Stress Laden von 1 h38 oder 2 h aber nicht durch die von 15 min19beeinflusst. Längere Dauer der Stress-Belastung kann zu schweren motorischen Defizite führen. Für die Anzahl der Stress-Belastungen wird die Haltung von Mäusen breiter als die des nicht belasteten Mäuse nach 36 Mal Stress laden (1 h zweimal in der Woche), aber nicht nach 30 Mal39. Chronische Zurückhaltung Stress (6 h pro Tag für 31 aufeinanderfolgenden Tagen) verschlimmert Rotarod Leistung im Mausmodell der Parkinson-Krankheit37. Unsere Resultate zeigten die hängenden Tageszeit "betont" Atp1a3+ / − Mäuse wurden kürzer als die von der "gestressten" Wildtyp Mäusen nach 24 Mal von Stress Ladezeiten (bei 12 Wochen alt), aber nicht nach 18 oder weniger (bei 4, 6, 8 und 10 Wochen alt). Daher ist wiederholter Belastung Belastung erforderlich für die Induktion von bestimmten motorischen Defizite bei Mäusen, obwohl die Induktion der motorischen Defizite nach einer langen Periode von Anfang an eines oder mehrere Male von Stress laden nicht ausgeschlossen werden kann. Wenn Mäuse einen Neurobehavioral Phänotyp nicht in dieses Protokoll angezeigt werden, empfiehlt es sich, die Gesamtzahl und die Dauer der Belastung pro Sitzung laden zu erhöhen. Im Gegensatz dazu, wenn die Mäuse Gangart Anomalie aus einer oder mehrere Male von Stress laden zeigen, können Dauer und Anzahl verringert werden.
Schließlich kann Leistung von Wander- und hängen durch emotionale Verhaltensstörungen Zeichen (z. B. Angst und Aktivität) als denen der motorische Störungen beeinträchtigt werden. Mäuse mit hoher Angst und Hyperaktivität oft (statt zu Fuß) bis das Ziel-Feld laufen. Depression-ähnliches Verhalten zeigen Mäuse können mit häufigen Stopps Fuß. Daher möglicherweise eine aberrante Fußabdruck-Muster nicht durch motorische Defizite. Somit bestätigen die Gangart Anomalie nur motorische Defizite infolge Durchführung zusätzliche tests, emotionale Merkmale zu bewerten (Aktivität: Freiland-Test; Angst: offener Bereich und erhöhter plus Labyrinth Test; Depression-ähnliches Verhalten: schwimmen gezwungen Test) nach diesem Protokoll wie oben beschrieben18 ratsam ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS (Japan Society for Promotion of Science) KAKENHI (Beihilfe für wissenschaftliche Forschung C), Nummer 18K 07373 (HS) und Subventionen für Private Universitäten zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanging box | O’hara & Co. | http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/ | |
| Marking pen | ZEBRA | MO-120-MC-BK | |
| Goal box | O’hara & Co. | http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/ | Accessory for apparatus of balanced beam test |
| Boxes | O’hara & Co. | - | Side wall of runway |
| Black ink | Shin-asahi | - | |
| Red ink | Maruyamakogyo | BC-6 | |
| Disposable Petri Dish | Corning | 351008 | Petri dishes (35 mm in diameter) |
| Askul Multipaper Super White J Monochrome A3 | Askul | 701-712 | White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm) |
| 50 mL Conical tube | Corning | 430829 | |
| Square drill | KAKURI Corporation | DIY FACTORY (K32-0313) |
References
- Warner, T. T. Movement disorders. Practical Guide to Neurogenetics. , Elsevier Health Sciences. (2008).
- Brashear, A., DeLeon, D., Bressman, S. B., Thyagarajan, D., Farlow, M. R., Dobyns, W. B. Rapid-onset dystonia-parkinsonism in a second family. Neurology. 48 (4), 1066-1069 (1997).
- Linazasoro, G., Indakoetxea, B., Ruiz, J., Van Blercom, N., Lasa, A.
- Svetel, M., Ozelius, L. J., et al.
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. T. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. PAIN. 102 (1), 203-209 (2003).
- Berryman, E. R. DigigaitTM quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Beare, J. E., Morehouse, J. R., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
- Rushton, R., Steinberg, H., Tinson, C. Effects of a single experience on subsequent reactions to drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 20, 99-105 (1963).
- Lee, C. C., Peters, P. J. Neurotoxicity and behavioral effects of thiram in rats. Environmental health perspectives. 17, 35-43 (1976).
- van der Zee, C. E., Schuurman, T., Traber, J., Gispen, W. H. Oral administration of nimodipine accelerates functional recovery following peripheral nerve damage in the rat. Neuroscience Letters. 83 (1-2), 143-148 (1987).
- Leroy, T., Stroobants, S., Aerts, J. -M., D'Hooge, R., Berckmans, D. Automatic analysis of altered gait in arylsulphatase A-deficient mice in the open field. Behavior Research Methods. 41 (3), 787-794 (2009).
- Sango, K., McDonald, M. P., et al. Mice lacking both subunits of lysosomal beta-hexosaminidase display gangliosidosis and mucopolysaccharidosis. Nature Genetics. 14 (3), 348-352 (1996).
- Deacon, R. M. J.
- Djamshidian, A., Lees, A. J. Can stress trigger Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgey, and Psychiatry. 85 (8), 879-882 (2014).
- Brashear, A., Dobyns, W. B., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3. Brain. 130 (Pt 3), 828-835 (2007).
- Kirshenbaum, G. S., Saltzman, K., Rose, B., Petersen, J., Vilsen, B., Roder, J. C. Decreased neuronal Na+,K+-ATPase activity in Atp1a3 heterozygous mice increases susceptibility to depression-like endophenotypes by chronic variable stress. Genes, Brain and Behavior. 10 (5), 542-550 (2011).
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioral Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioral Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Zimprich, A., Garrett, L., et al. A robust and reliable non-invasive test for stress responsivity in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 125 (2014).
- Buynitsky, T., Mostofsky, D. I. Restraint stress in biobehavioral research: recent developments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (7), 1089-1098 (2009).
- Ikeda, K., Satake, S., et al. Enhanced inhibitory neurotransmission in the cerebellar cortex of Atp1a3-deficient heterozygous mice. The Journal of Physiology. 591 (13), 3433-3449 (2013).
- Crawley, J. N. Motor functions. What's Wrong with My Mouse?. , John Wiley & Sons. (2007).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.R-project.org/ (2014).
- Wils, H., Kleinberger, G., et al. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3858-3863 (2010).
- Eilam, R., Peter, Y., et al. Selective loss of dopaminergic nigro-striatal neurons in brains of Atm-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12653-12656 (1998).
- Lin, C. -H., Tallaksen-Greene, S., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
- Dang, M. T., Yokoi, F., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Glynn, D., Drew, C. J., Reim, K., Brose, N., Morton, A. J. Profound ataxia in complexin I knockout mice masks a complex phenotype that includes exploratory and habituation deficits. Human Molecular Genetics. 14 (16), 2369-2385 (2005).
- Becker, E. B. E., Oliver, P. L., et al. A point mutation in TRPC3 causes abnormal Purkinje cell development and cerebellar ataxia in moonwalker mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (16), 6706-6711 (2009).
- Heck, D. H., Zhao, Y., Roy, S., LeDoux, M. S., Reiter, L. T. Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Human Molecular Genetics. 17 (14), 2181-2189 (2008).
- Kirshenbaum, G. S., Dawson, N., et al. Alternating hemiplegia of childhood-related neural and behavioural phenotypes in Na+,K+-ATPase α3 missense mutant mice. PLoS ONE. 8 (3), e60141 (2013).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioral Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3 (Pt 7), e1175 (2015).
- Cecchi, M., Khoshbouei, H., Morilak, D. A. Modulatory effects of norepinephrine, acting on alpha1 receptors in the central nucleus of the amygdala, on behavioral and neuroendocrine responses to acute immobilization stress. Neuropharmacology. 43 (7), 1139-1147 (2002).
- Chu, X., Zhou, Y., et al. 24-hour-restraint stress induces long-term depressive-likephenotypes in mice. Scientific Reports. 6, 32935 (2016).
- Freeman, M. L., Sheridan, B. S., Bonneau, R. H., Hendricks, R. L. Psychological Stress Compromises CD8+ T cell control of latent herpes simplex virus type 1 infections. The Journal of Immunology. 179 (1), 322-328 (2007).
- Lauretti, E., Di Meco, A., Merali, S., Praticò, D. Chronic behavioral stress exaggerates motor deficit and neuroinflammation in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Translational Psychiatry. 6, e733 (2016).
- Quartermain, D., Stone, E. A., Charbonneau, G. Acute stress disrupts risk assessment behavior in mice. Physiology and Behavior. 59 (4-5), 937-940 (1996).
- Bannon, D. The Behavioural effects of stress and aluminum toxicity on a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Parkinsonism-dementia complex. , 1-186 (2015).
