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Behavior

Protocolo de baixo custo de análise da pegada e caixa de teste de suspensão para ratos aplicada o retenção crônica de estresse

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/59027
Automatic Translation
1, 1
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

Summary

O protocolo de baixo custo, composto por análise de pegada e teste de caixa de suspensão após estresse de contenção é útil para avaliar os distúrbios do movimento do modelo do rato.

Abstract

Perturbação da marcha é frequentemente observada em pacientes com distúrbios do movimento. Em modelos do rato usados para distúrbios de movimento, análise da marcha é importante teste comportamental para determinar se os ratos imitam os sintomas dos pacientes. Déficit motor muitas vezes é induzida por estresse quando não fenótipo motor espontâneo é observado em modelos do rato. Portanto, a análise da marcha, seguido de estresse de carregamento seria um método sensível para avaliar o fenótipo motor em modelos do rato. No entanto, os pesquisadores enfrentam a exigência de um aparelho caro para obter resultados quantitativos automaticamente a partir da análise da marcha. Para estresse, estresse por métodos simples de carregamento sem aparelhos caros necessários para choque elétrico e forçado a correr é desejável. Portanto, apresentamos um protocolo simples e de baixo custo, consistindo em análise de pegada com papel e tinta, teste de caixa para avaliar a função motora de suspensão, e carga de estresse definido pela moderação com um tubo cónico. O déficit motor de ratos com êxito foram detectado pelo presente protocolo.

Introduction

Distúrbios do movimento são definidos como distúrbios do sistema nervoso, mostrando um excesso ou escassez de movimentos voluntários ou automática1. Em particular, distúrbio da marcha é frequentemente documentado entre os pacientes com distúrbios de movimento2,3,4. Portanto, a análise da marcha é um teste comportamental adequado para a validação de modelos animais de distúrbios do movimento. Em camundongos, análises automatizadas da marcha foram realizadas para andar em velocidade natural5 e em velocidades ajustáveis por esteira6,7. Essas análises fornecem resultados quantitativos de marcha automaticamente. Um método alternativo para detectar o distúrbio da marcha é chamado análise da pegada. Depois rotulando as solas dos pés com tinta, ratos andar no papel, e as pegadas são analisadas. Inicialmente, vaselina e carvão em pó foram utilizados para visualizar a pegada8e então foram substituídos por tinta sobre papel de polígrafo9 e colaborador fotográfico em papel fotográfico10. Um método mais barato e menos tóxico, usando a tinta e o papel do que os outros métodos permanece até à data de11. Análise de pegada é menos caro em comparação com a análise automatizada de5,6,7 e seria útil para avaliar os distúrbios do movimento em modelos do rato para os pesquisadores sem fundos de pesquisa abundante .

O enforcamento teste de caixa é uma espécie de quatro testes de suspensão de membro usando fio gaiola tampa12 e malha de arame de tela13. A caixa é um aparelho com malha rotatable tampa no topo da caixa ao longo de um bar do centro. Além de análise de marcha, o teste pode ser barata e facilmente executado. Portanto, foi realizado o enforcamento teste de caixa para avaliar a força de preensão e equilíbrio, além para a análise de pegada no presente protocolo.

Estresse induz os sintomas de distúrbios de movimento14,15. Déficit motor muitas vezes é induzida por vários estresses crônicas mesmo quando nenhum fenótipo motor espontâneo é observado nos modelos do rato de um movimento transtorno16,17,18. Moderação é um dos métodos comumente usados para o stress, porque o animal não é fisicamente prejudicado19 e custo é menos em comparação com outros métodos, como choque elétrico com aparelhos dedicados a carregar em camundongos e forçado a correr com o uso de uma escada rolante. Contenção por um tubo, que é interpretada por confinar um rato em um tubo cônico de 50ml furada, é mais fácil do que outros métodos, como fio de malha coador, membro gravado e envoltura de animal com gaze (revista20). Neste artigo, resumimos os protocolos do espaço de análise e a caixa de suspensão teste após a contenção por um tubo. Este protocolo nos ajudaria a usar modelos de rato de distúrbios do movimento sem fenótipo motor espontâneo.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de uma forma humana. O institucional Animal experimento Comité de Jichi universidade médica aprovado o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o Regulamento institucional para experimento Animal e diretriz Fundamental para a boa conduta do Animal experimento e actividades conexas em instituições acadêmicas de pesquisa sob a jurisdição do MEXT do Japão. Os ratos utilizados neste protocolo tem sido descrito anteriormente21.

1. caixa de teste de suspensão

  1. Registro do peso de cada rato. Marcar a cauda por caneta de marcação para a discriminação individual (por exemplo., uma linha dupla linhas e linhas triplas).
    Nota: Curvas de crescimento são utilizadas para um índice de saúde geral22.
  2. Coloque os ratos no quarto experimental pelo menos 30 min antes do teste comportamental. Defina a caixa de suspensão, que consiste de uma caixa clara (25 x 25 x 40 cm3) com uma tampa de rotatable malha na parte superior (Figura 1). A tampa de malha pode ser girada ao longo de uma barra central para que o topo é invertido 180 graus.
  3. Põe um rato no centro da tampa do engranzamento. Cuidadosamente Abaixe a tampa de malha lateral.
  4. Medi a latência de queda (tempo de suspensão) do mouse da tampa malha.
    Nota: Se o mouse não se enquadra dentro de 5 min, grave a latência como 5 min.
  5. Retorne o rato da gaiola em casa. Limpe a caixa de suspensão com etanol a 70% após cada teste.

2. pegada análise

Nota: Após a enforcamento de caixa de teste, realizar a análise de pegada.

  1. Configurar o Runway (Figura 2A).
    1. Corte um pedaço de papel branco (29,7 cm x 42 cm x 0,09 mm) longitudinalmente em três comprimentos de igual largura. Defina um pedaço de papel branco (9,9 cm x 42 cm) em cima da mesa.
    2. Ponha a caixa gol escuro na extremidade distal do papel. Coloque outra caixas (aproximadamente o mesmo comprimento que o papel) com as paredes de ambos os lados da pista, impedindo a fuga dos ratos.
    3. Colocar tinta preta e tinta vermelha em separado de Petri (35 mm de diâmetro).
  2. Sessão de treinamento.
    Nota: Realize a sessão de treinamento apenas em 4 semanas de idade.
    1. Colocar um rato na extremidade proximal do papel (Face a cabeça em direção a caixa do gol). Acompanho o mouse da extremidade proximal à caixa de objetivo. Remova o mouse da caixa objetivo. Se o mouse parar sobre o papel, empurre suavemente o mouse para a caixa do gol pelo dedo.
    2. Segure o mouse segurando a nuca entre o polegar e o indicador para limitar o movimento das patas dianteiras. Então, segure as costas e a cauda entre a esfera do polegar e os outros dedos para limitar o movimento dos membros posteriores.
      Nota: Exploração insuficiente de um rato resulta em borrões de tinta na roupa.
    3. Mergulhe as partes inferiores das patas dianteiras em tinta vermelha e as partes inferiores dos membros traseiros em tinta preta. Imediatamente, coloque o mouse na extremidade proximal do papel (Face a cabeça em direção a caixa do gol). Acompanho o mouse da extremidade proximal à caixa de objetivo. Se o mouse parar sobre o papel, empurre suavemente o mouse para a caixa do gol pelo dedo.
    4. Remova o mouse da caixa objetivo. Vá para a sessão de teste.
  3. Sessão de teste.
    1. Após a sessão de treinamento, configurar a pista para pegadas com um novo pedaço de papel branco.
    2. Segure o mouse segurando a nuca entre o polegar e o indicador para limitar o movimento das patas dianteiras. Então, segure as costas e a cauda entre a esfera do polegar e os outros dedos para limitar o movimento dos membros posteriores.
    3. Mergulhe as partes inferiores das patas dianteiras em tinta vermelha e as partes inferiores dos membros traseiros em tinta preta. Imediatamente, coloque o mouse na extremidade proximal do papel. Acompanho o mouse da extremidade proximal à caixa de objetivo.
      Nota: Porque os ratos preferem o escuro, andar se torna mais estável conforme o mouse se aproxima da caixa escura objetivo. Se o mouse parar sobre o papel, empurre suavemente o mouse para a caixa do gol pelo dedo. Então, se pegadas de confiança não são obtidas por análise (ver passo 2.4. Análise de pegadas para detalhes) porque o mouse parou, repetir a sessão de teste.
    4. Retorne o rato da gaiola em casa da caixa de objetivo. Limpe a caixa do gol com etanol a 70% após cada sessão de teste. Secar o papel impresso de pé.
  4. Análise de pegadas
    1. Obter três medidas de cada parâmetro (stride comprimentos dos membros dianteiros e larguras de base membros traseiros, dianteiros e traseiros, sobreposição entre o membro anterior e membro posterior, Figura 2B) com uma régua de papel impresso de pé.
      Nota: Porque pegadas de extremidades proximais e distais frequentemente mostram grandes variações devido à parada ou correr, escolher a parte com um padrão de marcha constante de pegadas. O parte do meio do pé-impresso papel geralmente será adequado para a análise.
      1. Para o comprimento do passo, medir as distâncias entre as mesmas partes da pata (pata almofada de dedo do pé).
      2. Para a largura da base frontal, traçar uma linha entre consecutivas pegadas frontais direita (ou esquerdas). Em seguida, meça o comprimento da linha vertical da almofada da pegada frontal esquerda (ou direita) para a linha desenhada entre as pegadas de direita (ou esquerdas).
      3. Para a patas traseira largura base, traçar uma linha entre consecutivas pegadas traseiras direita (ou esquerdas). Em seguida, meça o comprimento da linha vertical da almofada da pegada traseira esquerda (ou direita) para a linha desenhada entre as pegadas de direita (ou esquerdas).
      4. Para sobreposição, medir a distância entre as almofadas de esquerda (ou direita) dianteira e traseiras pegadas.
    2. Média de três medições para cada indivíduo. Use a média individual de cada parâmetro para a análise estatística.
      1. Para o comprimento do passo, use a média das médias individuais dos avanços da esquerda e direita.
      2. Para a assimetria do comprimento do passo, use o valor absoluto da diferença entre as médias individuais do membro esquerdo e comprimento do passo de membro direito.
      3. Para a análise estatística dos outros parâmetros (largura de base da frente, traseira largura base e sobreposição), use a média individual diretamente.

3. retenção tensão de carregamento

  1. Preparação dos tubos de contenção.
    1. Faz 16 buracos (cerca de 2 mm de diâmetro) em um tubo cônico de 50 ml (30 mm de diâmetro x 115 mm de comprimento) ao longo das marcas de escala (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) e a parte traseira de cada escala marcar por broca quadrada (Figura 3). Faça um buraco na ponta do tubo cónico de 50 mL (aproximadamente 5 mm de diâmetro) para respirar, cortando a ponta. Faça um buraco (aproximadamente 4 mm de diâmetro) na tampa do tubo para passar a cauda de ratos.
  2. Carga de estresse
    1. Coloque os ratos na sala experimental.
    2. Mantenha um mouse segurando a nuca entre o polegar e o indicador. Digite o mouse dentro do tubo de contenção da cabeça. Passe a cauda através do orifício na tampa. Feche a tampa.
      Nota: Limitar o movimento do membro anterior, porque ratos rejeitaram inserindo o tubo pelas patas dianteiras.
    3. Manter o mouse delimitado por 2 h em uma mesa à temperatura ambiente. Remova o tubo de retenção para o mouse e voltar para a gaiola em casa.
      Nota: Os tubos de retenção podem ser reutilizados após uma lavagem e seca.

4. experimental horário (Figura 4):

  1. Executar a suspensão da caixa teste e a análise de pegada no mesmo dia em 4 semanas de idade (Veja o passo 1. Teste de caixa de suspensão e o passo 2. Análise de pegada para detalhes) como uma medida de referência em todos os ratos antes do agrupamento em «grupo de stress» e um «grupo de anti-stress».
    Nota: Aproximadamente 8-10 ratos em ninhadas de 2-3 podem ser adequados para uso em um experimento. Análise de pegada em 4 semanas de idade consiste em sessões de treinamento e teste.
  2. Aleatoriamente, divida os ratos em um grupo de' stress' e um 'grupo de anti-stress'.
    Nota: Quando os ratos são utilizados consistindo de várias ninhadas, divida littermates uniformemente em ambos os grupos. Número em cada grupo é composto de aproximadamente 4-5 ratos.
  3. Aplicar o esforço de contenção ao grupo' stress', 6 vezes ao longo de duas semanas (consulte a etapa 3. Retenção tensão carregando para detalhes).
    Nota: 6 vezes de retenção são aplicadas a cada duas semanas, seguido por um enforcamento caixa análise de teste e pegada de 6-12 semanas de idade. Não aplique o esforço de contenção no dia do enforcamento teste caixa teste e a análise de pegada.
  4. Executar a suspensão da caixa teste e a sessão de testes de análise de pegada no mesmo dia em 6, 8, 10 e 12 semanas de idade.

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Representative Results

Os camundongos machos heterozigotos de Atp1a3 (Atp1a3+ −) que são o modelo do rato para início rápido distonia parkinsonismo e selvagem-tipo littermates foram utilizados no presente protocolo. Atp1a3+ − mostrou significativamente menor comprimento dos passos do membro anterior e membro posterior do que aqueles do tipo selvagem em 4 semanas de idade (Figura 5A e Figura 5B, abra o círculo e quadrado). 'Estressado' Atp1a3+ − mostrou significativamente menor comprimento dos passos de ambos os membros do que aqueles de 'não-forçado' Atp1a3+ − em 8 semanas de idade (Figura 5A e Figura 5B, círculo fechado e aberto). Assimetrias do comprimento dos passos de ambos os membros não foram significativamente diferentes em todos os grupos de ratos em todos os tempos (Figura 5 e Figura 5). A base frontal e sobreposições de ambos os membros eram também semelhantes em todos os grupos de idades (Figura 5EG, H). A base posterior era significativamente maior no 'estressado' Atp1a3+ − do que os ratos selvagem-tipo 'estressados' em 10 semanas de idade (Figura 5F, círculo fechado e praça). Assim, estresse de contenção causou déficit motor (stride curta e ampla base) de Atp1a3+ −.

O enforcamento caixa teste foi realizado para avaliar a força de preensão e equilíbrio sobre o dia do teste de análise de pegada. Não houve diferença significativa no tempo de suspensão foram observada nas semanas de 4 a 10 ratos velhos (Figura 6). Em 12 semanas de idade, o tempo de suspensão de rato do selvagem-tipo 'estressado' foi significativamente mais do que os outros grupos (Figura 6, fechado, quadrado). Stress de retenção prolongado tempo de suspensão em ratos do selvagem-tipo só, mas não em Atp1a3+ −. Assim, o déficit motor de Atp1a3+ − era distinguível do selvagem-tipo ratos por estresse de restrição.

Peso corporal é um índice de saúde geral22. Nós medimos o peso corporal de ratos no dia do enforcamento teste teste de caixa e análise de pegada e sem diferenças significativas foram observadas em todos os grupos de ratos em todas as idades (Figura 7). Assim, esforço de contenção não afetou a saúde geral dos ratos.

Figure 1
Figura 1: aparelho de caixa com uma tampa de malha rotatable de suspensão. Um rato foi colocado no centro da tampa do engranzamento, e então a tampa da malha foi recusada o lado. A latência de queda do mouse da tampa malha está a ser medido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise da pegada. (A) pista para a análise de pegada. Um rato pé-pintado (patas dianteiras: tinta vermelha; membros traseiros: tinta preta) era permitido andar da extremidade proximal à caixa de objetivo. (B) imagem representativa da pegada e medição de parâmetros. Três medidas de cada parâmetro (membro anterior e membro posterior stride comprimentos, larguras de frente e base de cerva, sobreposição entre o membro anterior e membro posterior) foram obtidos a partir de papel impresso de pé. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: estresse de contenção por tubo cônico furada 50ml. O tubo de retenção tem um furo para respirar, um buraco para passar a cauda e 16 furos para circulação de ar. Rato foi mantido no tubo para 2 h à temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: cronograma Experimental do enforcamento caixa teste e a análise de pegada com a carga de estresse de retenção crônica. Análise de pegada e a caixa de suspensão de teste foram realizadas em 4 semanas de idade. Em seguida, os ratos foram divididos em grupos 'non-stressed' e 'estressado'. Para o grupo 'estressado', aplicou-se o esforço de contenção 6 vezes em 2 semanas até 12 semanas de idade. Para ambos os grupos, análise de pegada e a caixa de enforcamento teste foram realizados uma vez por 2 semanas até 12 semanas de idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: resultados representativos das análises de pegada. Pegada a análise foi realizada com 4 semanas de idade Atp1a3+ − (a3) e selvagem-tipo (wt) ratos (N = 19 e 17, respectivamente). Em seguida, Atp1a3+ − e o selvagem-tipo ratos foram divididos em grupos de 'estressados' e 'non-stressed'. Realizou-se análise de pegada para 'non-stressed' Atp1a3+ −, 'non-stressed' selvagem-tipo, 'estressado' Atp1a3+ −e 'estressado' selvagem-tipo ratos de 6-12 semanas de idade (abrir círculos, N = 9; abrir praças, N = 8; círculos sólidos , N = 10; quadrados de sólido, N = 9, respectivamente). (A) comprimento do membro anterior do passo. (B) comprimento do membro posterior do passo. (C) assimetria de comprimento de avanços do membro anterior. (D) assimetria de comprimento de avanços do membro posterior. (E) largura entre membros dianteiros. (F) largura entre membros traseiros. (G) sobreposição entre o membro anterior esquerdo e membro posterior. (H) sobreposição entre o membro anterior direito e membro posterior. Os dados são da média ± análises estatísticas de SD. (t -teste para os ratos de 4 semanas de idade) e emparelhadas t -teste com o método de ajuste de Holm para ratos 6-12-week-old foram realizadas por R23. # p <.05, para 'non-stressed' Atp1a3+ − e 'non-stressed' ratos de tipo selvagem. p <.05, para 'estressado' Atp1a3+ − e 'estressado' wild-type mice. + p <.05, para 'non-stressed' e 'estressado' Atp1a3+ − ratos. Figura 5A -F foi modificado da referência18 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: resultados representativos de pendurar testes caixa. O enforcamento caixa teste foi realizado com Atp1a3+ − (a3) e ratos do selvagem-tipo (wt) em 4 semanas de idade. Em seguida, Atp1a3+ − e o selvagem-tipo ratos foram divididos em grupos de 'estressados' e 'non-stressed'. Tempo de 4 semanas de suspensão Atp1a3+ − (abrir círculos, N = 19) e o selvagem-tipo (abrir praças, N = 17) ratos e tempo de 6-12-semanas de suspensão 'non-stressed' Atp1a3+ / − (abrir círculos, N = 9), 'non-stressed' tipo selvagem (quadrados abertos N = 8), 'estressado' Atp1a3+ − (círculos sólidos, N = 10) e 'estressado' tipo selvagem (praças sólidas, N = 9) ratos foram plotados em uma escala logarítmica. Os dados são da média ± análises estatísticas de SD. (t -teste para os ratos de 4 semanas de idade) e emparelhadas t -teste com o método de ajuste de Holm para ratos 6-12-week-old foram realizadas por R23. p <.05, para 'estressado' Atp1a3+ − e 'estressado' wild-type mice. $ p <.05, para 'non-stressed' e 'estressados' ratos de tipo selvagem. + p <.05, para 'non-stressed' Atp1a3+ − e 'estressado' wild-type mice. Dados foi reimpresso de referência18 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: resultados representativos das curvas de crescimento. Pesos de corpo foram medidos de Atp1a3+ − (a3) e ratos do selvagem-tipo (wt) em 4 semanas de idade (abrir círculos, N = 19; abrir praças, N = 17, respectivamente). Em seguida, Atp1a3+ − e o selvagem-tipo ratos foram divididos em grupos de 'estressados' e 'non-stressed'. Corpo de pesos entre 6 e 12 semanas de idade de 'non-stressed' Atp1a3+ / − (abrir círculos, N = 9), 'non-stressed' selvagem-tipo (abrir praças, N = 8), 'estressado' Atp1a3+ / − (círculos sólidos, N = 10) e 'estressado' selvagem-tipo (sólido quadrados, N = 9) ratos foram medidos. Os dados são da média ± análises estatísticas de SD. (t -teste para os ratos de 4 semanas de idade) e emparelhadas t -teste com o método de ajuste de Holm para ratos 6-12-week-old foram realizadas por R23. Figura 7 foi modificado da referência18 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A análise de pegada e a caixa de suspensão de teste são simples e pouco dispendiosos testes comportamentais para a função motora dos ratos. Os fenótipos neurocomportamentais em vários modelos de mouse foram detectados com êxito por esses testes. Por exemplo, encurtou o comprimento do passo em esclerose lateral amiotrófica24, aumento do comprimento do passo assimétrico em ataxia-telangiectasia25, aumento do comprimento de sobreposição na doença de Huntington distonia de26 e27, e base ampliada em ataxia28,29, Angelman síndrome distonia e30 31 foram demonstradas pela análise de pegada. Além disso, observou-se no modelo do rato da distrofia muscular de Duchenne32tempo de suspensão menor do que os ratos controle. Assim, ambos os testes descritos neste trabalho seria útil para avaliar a disfunção motora dos ratos.

Há uma etapa crítica do presente protocolo para obter as pegadas nítidas. É muito importante a colocar um rato no papel imediatamente após a imersão as partes inferiores dos membros na tinta para evitar a secagem. É preciso terminar os aspergimento passos (2.2.3 e 2.3.3) em um curto espaço de tempo. Uma desvantagem deste protocolo de análise de pegada é que os parâmetros obtidos limitam-se a mais simples que não incluem informações temporais (por exemplo, a duração da marcha ciclo e passo a sequência de cada pé) e informações físicas (por exemplo, pressão de pegada com base no painel de LED sensível ao toque). Quando são necessárias informações temporais e físicas, deve ser utilizado um aparelho de análise automatizada da marcha. Alternativamente, informações temporais do padrão de marcha podem ser obtidas pela câmera de alta velocidade de33. Outra desvantagem é que medir os parâmetros no papel impresso de pé é mais trabalhoso do que análise automatizada da marcha. Para aplicação futura, o desenvolvimento de um programa de coleta de dados automatizado ou semiautomated de papel impresso pé deverão diminuir os parâmetros de medição do esforço dispendido.

Para o carregamento de estresse, podem ser variados número total e duração por sessão no presente protocolo. Stress de contenção tem sido conduzida com diferentes durações e número de aplicações (por exemplo., única por 5 min34, solteiro por 24 h35, 12 h x 5 sessões36e 6 h x 31 sessões37, revisto em ref. 20). A nosso conhecimento, nenhum estudo sistemático concerne os efeitos do número total e duração por sessão sobre a função motora dos ratos. A atividade de ratos em campo aberto é afetada pelo estresse único carregamento de 1h38 ou 2 h, mas não por isso 15 min19. Duração prolongada da carga de estresse pode levar a graves déficits motor. Para o número de cargas de estresse, a postura dos ratos torna-se mais ampla do que a dos não-forçado ratos após 36 vezes de stress (duas vezes por semana 1h) a carregar, mas não após 30 vezes39. Stress de retenção crônica (6h por dia durante 31 dias consecutivos) agrava rotarod desempenho no modelo do rato da doença de Parkinson,37. Nossos resultados mostraram que o tempo de suspensão de 'estressado' Atp1a3+ − ratos tornou-se mais curto do que dos ratos selvagem-tipo 'estressados' depois de 24 vezes de stress tempos de carregamento (em 12 semanas de idade), mas não depois 18 ou menos (em 4, 6, 8 e 10 semanas de idade). Portanto, carga de estresse repetido é necessária para indução de certos déficits motor em ratos, embora a indução de déficits motor após um longo período desde o início de uma única ou várias vezes da carga de estresse não pode ser excluída. Quando ratos não mostram um fenótipo Neurocomportamentais neste protocolo, a recomendação é aumentar o número total e a duração do estresse carregando por sessão. Por outro lado, quando os ratos mostram anormalidade da marcha de uma única ou várias vezes da carga de estresse, duração e número podem ser diminuídas.

Finalmente, o desempenho de caminhar e andar pode ser afetado por personagens comportamentais emocionais (por exemplo, ansiedade e atividade) que não sejam de disfunção motora. Ratos com alta ansiedade e hiperatividade frequentemente executar (em vez de pé) para a caixa do gol. Ratos, mostrando o comportamento de depressão podem andar com paragens frequentes. Consequentemente, um padrão aberrante pegada não pode ser devido ao déficit motor. Assim, para confirmar a anormalidade da marcha resultante somente de déficit motor, realizando adicionais testes que avaliar características emocionais (atividade: teste de campo aberto; ansiedade: abrir campo e elevado além de teste de labirinto; comportamento de depressão: forçado a nadar teste) depois que este protocolo conforme descrito anteriormente18 é aconselhável.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI JSPS (sociedade de Japão para a promoção da ciência) (subsídio para C de investigação científica), conceder número 18K 07373 (HS) e subsídios para as universidades privadas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanging box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking pen ZEBRA MO-120-MC-BK
Goal box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/ Accessory for apparatus of balanced beam test
Boxes O’hara & Co. - Side wall of runway
Black ink Shin-asahi -
Red ink Maruyamakogyo BC-6
Disposable Petri Dish Corning 351008 Petri dishes (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3 Askul 701-712 White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tube Corning 430829
Square drill KAKURI Corporation DIY FACTORY (K32-0313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warner, T. T. Movement disorders. Practical Guide to Neurogenetics. , Elsevier Health Sciences. (2008).
  2. Brashear, A., DeLeon, D., Bressman, S. B., Thyagarajan, D., Farlow, M. R., Dobyns, W. B. Rapid-onset dystonia-parkinsonism in a second family. Neurology. 48 (4), 1066-1069 (1997).
  3. Linazasoro, G., Indakoetxea, B., Ruiz, J., Van Blercom, N., Lasa, A. Possible sporadic rapid-onset dystonia-parkinsonism. Movement Disorders. 17 (3), 608-609 (2002).
  4. Svetel, M., Ozelius, L. J., et al. Rapid-onset dystonia-parkinsonism: case report. Journal of Neurology. 257 (3), 472-474 (2010).
  5. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. T. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. PAIN. 102 (1), 203-209 (2003).
  6. Berryman, E. R. DigigaitTM quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  7. Beare, J. E., Morehouse, J. R., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
  8. Rushton, R., Steinberg, H., Tinson, C. Effects of a single experience on subsequent reactions to drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 20, 99-105 (1963).
  9. Lee, C. C., Peters, P. J. Neurotoxicity and behavioral effects of thiram in rats. Environmental health perspectives. 17, 35-43 (1976).
  10. van der Zee, C. E., Schuurman, T., Traber, J., Gispen, W. H. Oral administration of nimodipine accelerates functional recovery following peripheral nerve damage in the rat. Neuroscience Letters. 83 (1-2), 143-148 (1987).
  11. Leroy, T., Stroobants, S., Aerts, J. -M., D'Hooge, R., Berckmans, D. Automatic analysis of altered gait in arylsulphatase A-deficient mice in the open field. Behavior Research Methods. 41 (3), 787-794 (2009).
  12. Sango, K., McDonald, M. P., et al. Mice lacking both subunits of lysosomal beta-hexosaminidase display gangliosidosis and mucopolysaccharidosis. Nature Genetics. 14 (3), 348-352 (1996).
  13. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments. (76), e2610 (2013).
  14. Djamshidian, A., Lees, A. J. Can stress trigger Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgey, and Psychiatry. 85 (8), 879-882 (2014).
  15. Brashear, A., Dobyns, W. B., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3. Brain. 130 (Pt 3), 828-835 (2007).
  16. Kirshenbaum, G. S., Saltzman, K., Rose, B., Petersen, J., Vilsen, B., Roder, J. C. Decreased neuronal Na+,K+-ATPase activity in Atp1a3 heterozygous mice increases susceptibility to depression-like endophenotypes by chronic variable stress. Genes, Brain and Behavior. 10 (5), 542-550 (2011).
  17. DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioral Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
  18. Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioral Brain Research. 272, 100-110 (2014).
  19. Zimprich, A., Garrett, L., et al. A robust and reliable non-invasive test for stress responsivity in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 125 (2014).
  20. Buynitsky, T., Mostofsky, D. I. Restraint stress in biobehavioral research: recent developments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (7), 1089-1098 (2009).
  21. Ikeda, K., Satake, S., et al. Enhanced inhibitory neurotransmission in the cerebellar cortex of Atp1a3-deficient heterozygous mice. The Journal of Physiology. 591 (13), 3433-3449 (2013).
  22. Crawley, J. N. Motor functions. What's Wrong with My Mouse?. , John Wiley & Sons. (2007).
  23. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.R-project.org/ (2014).
  24. Wils, H., Kleinberger, G., et al. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3858-3863 (2010).
  25. Eilam, R., Peter, Y., et al. Selective loss of dopaminergic nigro-striatal neurons in brains of Atm-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12653-12656 (1998).
  26. Lin, C. -H., Tallaksen-Greene, S., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  27. Dang, M. T., Yokoi, F., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
  28. Glynn, D., Drew, C. J., Reim, K., Brose, N., Morton, A. J. Profound ataxia in complexin I knockout mice masks a complex phenotype that includes exploratory and habituation deficits. Human Molecular Genetics. 14 (16), 2369-2385 (2005).
  29. Becker, E. B. E., Oliver, P. L., et al. A point mutation in TRPC3 causes abnormal Purkinje cell development and cerebellar ataxia in moonwalker mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (16), 6706-6711 (2009).
  30. Heck, D. H., Zhao, Y., Roy, S., LeDoux, M. S., Reiter, L. T. Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Human Molecular Genetics. 17 (14), 2181-2189 (2008).
  31. Kirshenbaum, G. S., Dawson, N., et al. Alternating hemiplegia of childhood-related neural and behavioural phenotypes in Na+,K+-ATPase α3 missense mutant mice. PLoS ONE. 8 (3), e60141 (2013).
  32. Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioral Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
  33. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3 (Pt 7), e1175 (2015).
  34. Cecchi, M., Khoshbouei, H., Morilak, D. A. Modulatory effects of norepinephrine, acting on alpha1 receptors in the central nucleus of the amygdala, on behavioral and neuroendocrine responses to acute immobilization stress. Neuropharmacology. 43 (7), 1139-1147 (2002).
  35. Chu, X., Zhou, Y., et al. 24-hour-restraint stress induces long-term depressive-likephenotypes in mice. Scientific Reports. 6, 32935 (2016).
  36. Freeman, M. L., Sheridan, B. S., Bonneau, R. H., Hendricks, R. L. Psychological Stress Compromises CD8+ T cell control of latent herpes simplex virus type 1 infections. The Journal of Immunology. 179 (1), 322-328 (2007).
  37. Lauretti, E., Di Meco, A., Merali, S., Praticò, D. Chronic behavioral stress exaggerates motor deficit and neuroinflammation in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Translational Psychiatry. 6, e733 (2016).
  38. Quartermain, D., Stone, E. A., Charbonneau, G. Acute stress disrupts risk assessment behavior in mice. Physiology and Behavior. 59 (4-5), 937-940 (1996).
  39. Bannon, D. The Behavioural effects of stress and aluminum toxicity on a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Parkinsonism-dementia complex. , 1-186 (2015).

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