Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

تطبيق البروتوكول منخفضة التكلفة لتحليل البصمة والمعلق اختبار مربع للفئران الإجهاد المزمن من ضبط النفس

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/59027
Automatic Translation
1, 1
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

Summary

بروتوكول منخفضة التكلفة تتكون من تحليل البصمة والمعلق اختبار مربع بعد ضبط النفس الإجهاد مفيد لتقييم اضطرابات الحركة من طراز الماوس.

Abstract

اضطراب مشيه كثيرا ما لوحظ في المرضى الذين يعانون من اضطرابات الحركة. تحليل مشيه في الماوس النماذج المستخدمة لاضطرابات الحركة، اختبار سلوكية هامة لتحديد ما إذا كانت الفئران تحاكي أعراض المرضى. العجز الحركي هي غالباً الناجمة عن الإجهاد عندما يلاحظ لا النمط الظاهري الحركية العفوية في نماذج الماوس. ولذلك، سيكون تحليل مشيه متبوعاً بالإجهاد تحميل طريقة حساسة لتقييم النمط الظاهري موتور في نماذج الماوس. ومع ذلك، تواجه الباحثين شرط جهاز مكلفة للحصول على النتائج الكمية تلقائياً من تحليل مشيه. للإجهاد، والإجهاد تحميل بأساليب بسيطة دون التجهيزات باهظة الثمن المطلوب لصدمة كهربائية وأجبر على تشغيل مرغوب فيه. ولذلك، نقدم بروتوكول بسيط ومنخفض التكلفة تتكون من تحليل البصمة مع الورق والحبر، والمعلق اختبار مربع لتقييم الوظيفة الحركية، والإجهاد تحميل تعريف بضبط النفس مع أنبوب مخروطي. تم الكشف عن حالات العجز الحركي من الفئران بنجاح بموجب هذا البروتوكول.

Introduction

يتم تعريف اضطرابات الحركة كاضطرابات الجهاز العصبي تبين فائض أو ندرة الحركات الطوعية أو التلقائي1. على وجه الخصوص، كثيرا ما يتم توثيق اضطراب مشيه بين المرضى الذين يعانون من حركة اضطرابات2،،من34. ولذلك، يتم تحليل مشيه اختبار سلوكية مناسبة للتحقق نماذج حيوانية من اضطرابات الحركة. في الفئران، تم إجراء تحليلات مشيه الآلي للمشي على سرعة الطبيعية5 وبسرعة قابل للتعديل بحلقة مفرغة6،7. هذه التحليلات تقديم النتائج الكمية من مشيه تلقائياً. يتم استدعاء أسلوب بديل للكشف عن اضطراب مشيه تحليل البصمة. بعد وضع العلامات القيعان من القدمين مع الحبر، الفئران سيرا على الأقدام على الورق، ويتم تحليل آثار أقدام. في البداية، فازلين ومسحوق الفحم النباتي واستخدمت لتصور البصمة8، وثم استعيض بالحبر على الورق جهاز كشف الكذب9 والمطور التصوير على ورق فوتوغرافي10. ويظل أسلوب أرخص وأقل سمية باستخدام الحبر والورق من الأساليب الأخرى حتى الآن11. تحليل البصمة هو أقل تكلفة بالمقارنة مع التحليل الآلي5،،من67 وسيكون مفيداً لتقييم اضطرابات الحركة في نماذج الماوس للباحثين دون أموال وفيرة للبحث .

معلقة خانة الاختبار نوع من أطرافهم الأربعة شنقاً الاختبارات باستخدام أسلاك القفص غطاء12 وسلك مش شاشة13. المربع جهاز مع شبكة للتدوير الغطاء العلوي من مربع على طول شريط مركز. بالإضافة إلى تحليل مشيه، يمكن تكون غير مكلفة وسهولة الاختبار. ولذلك، أجرينا الشنق خانة الاختبار لتقييم قوة قبضة والتوازن، وبالإضافة إلى ذلك في تحليل البصمة في هذا البروتوكول.

الإجهاد يؤدي إلى أعراض اضطرابات حركة14،15. العجز الحركي هي غالباً ما فعل عدة تؤكد المزمنة حتى عندما يلاحظ لا النمط الظاهري الحركية العفوية في نماذج الماوس حركة اضطراب16،،من1718. ضبط النفس هو أحد الأساليب المستخدمة عادة للإجهاد تحميل في الفئران، لأن الحيوان لا أذى جسديا19 وتكلفة أقل مقارنة بالأساليب الأخرى مثل الصدمات الكهربائية مع جهاز مخصص وأجبر قيد التشغيل باستخدام حلقة مفرغة. ضبط النفس من جانب أنبوب، التي تتم بقصره بماوس في أنبوب مخروطي حملتها 50 مل، أسهل من الطرق الأخرى مثل الأسلاك مش مصفاة واطرافهم مسجلة والتفاف للحيوان مع شاش (استعرض20). في هذه الورقة، يمكننا تلخيص بروتوكولات البصمة اختبار تحليل ومربع شنقاً بعد ضبط النفس بأنبوب. وسيساعد هذا البروتوكول لنا باستخدام نماذج الماوس من اضطرابات الحركة دون النمط الظاهري الحركية العفوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بطريقة إنسانية. المؤسسية الحيوان تجربة اللجنة من جيتشي الطبية الجامعة الموافقة على الدراسة. أجريت الدراسة وفقا "لائحة مؤسسية" في "التجربة الحيوانية" و "المبدأ التوجيهي الأساسي" للسلوك السليم للحيوان التجربة والأنشطة ذات الصلة في "مؤسسات البحوث الأكاديمية" هي من اختصاص يأمرون في اليابان. وكانت الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول الموصوفة سابقا21.

1-المعلق اختبار مربع

  1. سجل وزن كل الماوس. علامة الذيل بوسم القلم للتمييز الفردية (على سبيل المثال., خط وخطوط مزدوجة، وخطوط ثلاثية).
    ملاحظة: وتستخدم منحنيات النمو لفهرس للصحة العامة22.
  2. وضع الفئران في غرفة تجريبية على الأقل 30 دقيقة قبل اختبار سلوكية. تعيين مربع شنقاً، الذي يتألف من مربع واضحة (25 x 25 x 40 سم3) مع غطاء مش للتدوير في الجزء العلوي (الشكل 1). يمكن تدويرها الغطاء مش على طول شريط مركزية حيث أن الجزء العلوي هو انقلبت 180 درجة.
  3. ضع ماوس في وسط غطاء مش. بعناية دورة غطاء مش حتى الجانب.
  4. قياس الكمون الخريف (معلقة وقت) الفأرة من الغطاء مش.
    ملاحظة: إذا كان الماوس لا تدخل ضمن مدة 5 دقائق، سجل الكمون ك 5 دقيقة.
  5. العودة الماوس إلى القفص المنزل. تنظيف المربع معلقة مع الإيثانول 70% بعد كل اختبار.

2. تحليل البصمة

ملاحظة: وبعد مربع معلقة اختبار، إجراء تحليل البصمة.

  1. قم بإعداد على المدرج (الشكل 2A).
    1. قص قطعة من الورق الأبيض (29.7 سم × 42 سم × 0.09 ملم) طوليا إلى ثلاثة أطوال متساوية العرض. تعيين على قطعة من الورق الأبيض (9.9 سم × 42 سم) في الجدول.
    2. وضع مربع الهدف الظلام في نهاية الورقة البعيدة. وضع الآخر مربعات (تقريبا نفس الطول كما أن الورقة) مع الجدران على جانبي المدرج، ومنع هروب الفئران.
    3. وضع الحبر الأسود والحبر الأحمر في أطباق بتري منفصلة (35 ملم في القطر).
  2. الدورة التدريبية.
    ملاحظة: تنفيذ الدورة التدريبية فقط في 4 أسابيع عمر.
    1. وضع ماوس على نهاية الدانية من الورقة (وجه رأسه نحو مربع الهدف). واسمحوا الماوس سيرا على الأقدام من النهاية الدانية إلى مربع الهدف. إزالة الماوس من مربع الهدف. إذا توقف الماوس على الورق، بلطف دفع الماوس على مربع الهدف بالإصبع.
    2. أمسك الماوس باستيعاب القفا بين الإبهام والسبابة للحد من حركة واﻷمامية. ثم أمسك ظهره وذيله بين كرة الإبهام والأصابع الأخرى للحد من حركة هيندليمبس.
      ملاحظة: نتائج عقد غير كافية بالماوس في البقع الحبر على الملابس.
    3. تزج قيعان واﻷمامية بالحبر الأحمر وقيعان هيندليمبس بالحبر الأسود. وضع الماوس على الفور في النهاية الدانية من الورقة (وجه رأسه نحو مربع الهدف). واسمحوا الماوس سيرا على الأقدام من النهاية الدانية إلى مربع الهدف. إذا توقف الماوس على الورق، بلطف دفع الماوس على مربع الهدف بالإصبع.
    4. إزالة الماوس من مربع الهدف. الانتقال إلى جلسة الاختبار.
  3. اختبار الدورة.
    1. عقب الدورة التدريبية، إعداد المدرج لإقدام مع قطعة قطع جديدة من الورقة البيضاء.
    2. أمسك الماوس باستيعاب القفا بين الإبهام والسبابة للحد من حركة واﻷمامية. ثم أمسك ظهره وذيله بين كرة الإبهام والأصابع الأخرى للحد من حركة هيندليمبس.
    3. تزج قيعان واﻷمامية بالحبر الأحمر وقيعان هيندليمبس بالحبر الأسود. وضع الماوس على الفور في نهاية الورقة الدانية. واسمحوا الماوس سيرا على الأقدام من النهاية الدانية إلى مربع الهدف.
      ملاحظة: نظراً لأن الفئران تفضل الظلام، المشي يصبح أكثر ثباتا مع اقتراب الماوس في مربع الهدف الظلام. إذا توقف الماوس على الورق، بلطف دفع الماوس على مربع الهدف بالإصبع. ثم، إذا لم يتم الحصول على أقدام موثوق لتحليل (راجع الخطوة 2، 4. تحليل لآثار أقدام لتفاصيل) نظراً لتوقف الماوس، إعادة المحاولة الدورة اختبار.
    4. العودة الماوس إلى القفص الرئيسية من مربع الهدف. تنظيف مربع الهدف مع الإيثانول 70% بعد كل جلسة الاختبار. أيردري الورقة المطبوعة سيرا على الأقدام.
  4. تحليل لآثار أقدام
    1. الحصول على ثلاثة مقاييس لكل معلمة (خطوة أطوال الأمامية وعرض قاعدة هيندليمبس والجبهة وهند، والتداخل بين فوريليمب واللكتات، الشكل 2) مع مسطرة من الورق المطبوعة سيرا على الأقدام.
      ملاحظة: نظراً لأن آثار أقدام الغايات القريبة والبعيدة بشكل متكرر تظهر اختلافات كبيرة بسبب توقف أو قيد التشغيل، اختر الجزء مع نمط مطرد مشيه من أقدام. الجزء الأوسط من الورقة المطبوعة القدم عادة ما ستكون مناسبة للتحليل.
      1. طول برايد، قياس المسافات بين أجزاء نفس مخلب (مثل، لوحة مخلب أو أخمص القدمين).
      2. لعرض قاعدة الجبهة، رسم خط بين أقدام الجبهة اليمين (أو اليسار) على التوالي. ثم قياس طول الخط العمودي من لوحة البصمة الجبهة (أو الأيسر) للخط الذي رسمته بين آثار أقدام (أو الأيسر).
      3. لعرض قاعدة هند، رسم خط بين أقدام هند اليمين (أو اليسار) على التوالي. ثم قياس طول الخط العمودي من لوحة البصمة هند (أو الأيسر) للخط الذي رسمته بين آثار أقدام (أو الأيسر).
      4. للتداخل، وقياس المسافة بين الجبهة منصات لليمين (أو اليسار) وآثار أقدام هند.
    2. متوسط ثلاثة مقاييس لكل فرد. استخدام المتوسط الفردي لكل معلمة للتحليل الإحصائي.
      1. طول برايد، استخدم متوسط المعدلات الفردية لخطوات اليسار واليمين.
      2. لعدم تناسق طول برايد، استخدم القيمة المطلقة للفرق بين المتوسطات الفردية من أطرافه اليسرى وطول برايد أطرافهم اليمنى.
      3. للتحليل الإحصائي لمعلمات أخرى (عرض قاعدة استقبال وعرض قاعدة هند والتداخل)، استخدم متوسط الفرد مباشرة.

3-ضبط النفس الإجهاد تحميل

  1. إعداد أنابيب من ضبط النفس.
    1. جعل الثقوب 16 (حوالي 2 ملم في القطر) في أنبوب 50 مل مخروطية (30 ملم في القطر x 115 مم في الطول) وفقا لعلامات مقياس (5، 10، 15، 20، 25، 30، 35، 40 مل) والمؤخر لكل نطاق الاحتفال بحفر مربعة (الشكل 3). جعل حفرة على طرف الأنبوبة المخروطية 50 مل (حوالي 5 مم في القطر) للتنفس بقطع الحافة. جعل ثقب (حوالي 4 ملم في القطر) في أنبوب الغطاء لتمرير ذيل الفئران.
  2. تحميل الإجهاد
    1. وضع الفئران في الغرفة التجريبية.
    2. اضغط بماوس باستيعاب القفا بين الإبهام والسبابة. أدخل الماوس في أنبوب ضبط النفس من الرأس. تمرير الذيل من خلال الثقب في عملية النداء الموحد. أغلق الغطاء.
      ملاحظة: الحد من حركة فوريليمب، نظراً لأن الفئران رفض دخول الأنبوب بالإمامية.
    3. الاحتفاظ بالماوس المغلقة ح 2 على مكتبي في درجة حرارة الغرفة. إزالة الماوس من الأنبوب من ضبط النفس والعودة إلى القفص المنزل.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام أنابيب ضبط النفس بعد أن يغسل والجافة.

4-الجدول التجريبية (الشكل 4):

  1. نفذ شنقاً في مربع اختبار وتحليل البصمة في نفس اليوم الساعة 4 أسابيع عمر (راجع الخطوة 1. اختبار مربع معلقة والخطوة 2. تحليل البصمة للحصول على تفاصيل) كقياس خط أساس على جميع الفئران قبل التجميع في 'الإجهاد مجموعة' و 'مجموعة غير الإجهاد'.
    ملاحظة: حوالي 8-10 الفئران في 2-3 ليتر قد تكون مناسبة للاستخدام في تجربة. تحليل البصمة في 4 أسابيع عمر يتكون من دورات التدريب والاختبار.
  2. تقسيم الفئران عشوائياً إلى مجموعة ضغط ومجموعة غير الإجهاد.
    ملاحظة: عندما تستخدم الفئران تتألف من عدة ليتر، تقسيم ليتيرماتيس بالتساوي في كلا الفريقين. العدد في كل مجموعة تتكون من حوالي 4-5 الفئران.
  3. تطبيق ضبط النفس الإجهاد إلى 'مجموعة الضغط' 6 مرات على مدى أسبوعين (راجع الخطوة رقم 3. ضبط النفس الإجهاد تحميل للحصول على التفاصيل).
    ملاحظة: 6 مرات من ضبط النفس وتطبق كل أسبوعين، تليها شنقاً مربع تحليل البصمة واختبار من 6-12 أسبوعا عمر. لا يتم تطبيق الضغط النفس اليوم اختبار للشنق مربع اختبار وتحليل البصمة.
  4. نفذ شنقاً في المربع الاختبار والدورة اختبار لتحليل البصمة في نفس اليوم الساعة 6، 8، 10، و 12 أسبوعا من العمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ذكور الفئران متخالف من Atp1a3 (Atp1a3+ −) التي هي نموذج الماوس لخلل السريعة الحدوث واستخدمت باركينسون والبرية من نوع ليتيرماتيس في هذا البروتوكول. Atp1a3+ − أظهرت أطوال برايد أقصر بكثير من فوريليمب واللكتات من تلك التي من نوع البرية في 4 أسابيع عمر (الشكل 5A و 5B الشكل، فتح الدائرة وساحة). 'وأكد' Atp1a3+ − أظهرت أطوال برايد أقصر بكثير من كل أطرافه من تلك 'غير أكد' Atp1a3+ − في 8 أسابيع عمر (الشكل 5A و الشكل 5B، الدائرة المغلقة والمفتوحة). أوجه عدم الاتساق في أطوال واسعة من كل أطرافه لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا في جميع الفئات من الفئران في جميع الإعمار (الشكل 5 و الشكل 5). قاعدة الجبهة والتداخل من كل أطرافه مماثلة أيضا في جميع الفئات في جميع الإعمار (الشكل 5E، ز، ح). قاعدة هند كان أوسع نطاقا إلى حد كبير في 'شدد على' Atp1a3+ − من ذلك في الفئران البرية من نوع 'أكد' في 10 أسابيع عمر (الشكل 5F، دائرة مغلقة وساحة). وهكذا، ضبط النفس الإجهاد بسبب العجز الحركي (خطوة قصيرة وقاعدة واسعة) من Atp1a3+ −.

المعلقة وأجرى اختبار مربع لتقييم قوة قبضة والتوازن في يوم اختبار تحليل البصمة. لم توجد فروق مهمة في معلقة وقت لوحظت في 4 إلى 10 أسابيع الفئران القديمة (الشكل 6). في 12 أسبوعا عمر، كان الوقت معلقة من الفئران البرية من نوع 'شدد على' أطول بكثير من المجموعات الأخرى (الشكل 6، أغلق مربع). ضبط النفس الإجهاد لفترات طويلة الوقت شنقاً في الفئران البرية من نوع فقط، ولكن ليس في Atp1a3+ −. وهكذا، عجز موتور Atp1a3+ − وكان يمكن تمييزها من الفئران البرية من نوع من ضبط النفس الإجهاد.

وزن الجسم مؤشر الصحة العامة22. قمنا بقياس وزن الجسم في الفئران في يوم الاختبار الشنق لوحظت مربع اختبار وتحليل البصمة، ولا توجد اختلافات كبيرة في جميع الفئات من الفئران في جميع الإعمار (الشكل 7). وهكذا، ضبط النفس الإجهاد لا تؤثر على الصحة العامة للفئران.

Figure 1
رقم 1: معلق الجهاز مربع مع غطاء مش للتدوير- وضع ماوس في وسط غطاء مش، وثم تحولت الغطاء مش حتى الجانب. الكمون سقوط الماوس من الغطاء مش يمكن قياسها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل البصمة. (أ) المدرج لتحليل البصمة. ماوس رسمت بالقدم (الأمامية: الحبر الأحمر؛ هيندليمبس: الحبر الأسود) كان يسمح لهم بالتجول من النهاية الدانية إلى مربع الهدف. (ب) صورة تمثيلية البصمة وقياس البارامترات. ثلاثة مقاييس لكل معلمة (فوريليمب واللكتات أطوال، عرض الجبهة وهند قاعدة واسعة، والتداخل بين فوريليمب واللكتات) تم الحصول عليها من ورقة مطبوعة سيرا على الأقدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: ضبط النفس الإجهاد بأنبوب مخروطي حملتها 50 مل. أنبوب ضبط النفس قد حفرة للتنفس، وحفرة لتمرير الذيل وثقوب 16 لدوران الهواء. أبقى الماوس في الأنبوب ح 2 في درجة حرارة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الجدول الزمني التجريبي للشنق مربع اختبار وتحليل البصمة مع تحميل الإجهاد المزمن من ضبط النفس. تحليل البصمة ومربع المعلق اختبار أجريت في 4 أسابيع عمر. ثم، تم تقسيم الفئران إلى 'شدد على' و 'عدم التشديد على' المجموعات. لمجموعة 'أكد'، تم تطبيق ضبط النفس الإجهاد 6 مرات في 2 أسابيع حتى 12 أسبوعا عمر. لكل الفئات، وتحليل البصمة ومربع معلقة تم إجراء الاختبار مرة كل أسبوعين حتى 12 أسبوعا عمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نتائج تحليل البصمة الممثل. تم إجراء تحليل البصمة مع عمرها 4 الأسبوع Atp1a3+ − (a3) والفئران البرية من نوع (wt) (N = 19 و 17 عاماً على التوالي). ثم، Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع انقسمت إلى مجموعات 'أكد' و 'عدم التشديد على'. أجرى تحليل البصمة على 'عدم التشديد على' Atp1a3+ −، 'عدم التشديد على' البرية من نوع، 'وأكد' Atp1a3+ −، و 'شدد على' الفئران البرية من نوع من 6-12 أسبوعا عمر (فتح الدوائر، ن = 9؛ وفتح المربعات، N = 8؛ دوائر صلبة ، N = 10؛ المربعات الصلبة، N = 9، على التوالي). (أ) خطوة طول فوريليمب. (ب) خطوة طول اللكتات. (ج) عدم تماثل طول خطوات فوريليمب. (د) عدم تماثل طول خطوات اللكتات. (ه) عرض بين الأمامية. (و) العرض بين هيندليمبس. (ز) التداخل بين فوريليمب اليسرى واللكتات. (ح) التداخل بين الحق فوريليمب واللكتات. البيانات هي ± يعني أجريت التحاليل الإحصائية التنمية المستدامة. (t-للفئران منذ 4 أسابيع) واختبار العشوائية t-مع أسلوب التكيف هولم للفئران البالغ من العمر 6-12 أسبوع من ص23. # ف <.05، عن 'عدم التشديد على' Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع 'غير أكد'. ف <.05، عن 'شدد على' Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع 'أكد'. + ف <.05، عن 'عدم التشديد على' و 'شدد على' Atp1a3+ − الفئران. الشكل 5A تم تعديل و من المرجع18 بإذن السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: نتائج تمثيلية شنقاً اختبارات مربع. المعلقة وأجرى اختبار مربع مع Atp1a3+ − (a3) والفئران البرية من نوع (wt) في 4 أسابيع عمر. ثم، Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع انقسمت إلى مجموعات 'أكد' و 'عدم التشديد على'. معلقة وقت عمرها 4 الأسبوع Atp1a3+ − (فتح الدوائر، ن = 19) والبرية من نوع (فتح المربعات، N = 17) الفئران ومعلقة وقت العمر 6-12 أسبوع 'غير-شدد على' Atp1a3+ − (فتح الدوائر، ن = 9)، 'عدم التشديد على' البرية من نوع (الساحات المفتوحة ، N = 8)، 'شدد على' Atp1a3+ − (دوائر صلبة، N = 10)، و 'شدد على' البرية من نوع (المربعات الصلبة، N = 9) الفئران تم رسمها على مقياس لوغاريتمي. البيانات هي ± يعني أجريت التحاليل الإحصائية التنمية المستدامة. (t-للفئران منذ 4 أسابيع) واختبار العشوائية t-مع أسلوب التكيف هولم للفئران البالغ من العمر 6-12 أسبوع من ص23. ف <.05، عن 'أكد' Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع 'أكد'. $ p <.05، للفئران البرية من نوع 'غير أكد' و 'أكد'. + ف <.05، عن 'عدم التشديد على' Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع 'أكد'. وقد تم طبع البيانات من مرجع18 بإذن السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: نتائج تمثيلية لمنحنيات النمو. تم قياس أوزان الجسم من Atp1a3+ − (a3) والفئران البرية من نوع (wt) في 4 أسابيع عمر (فتح الدوائر، N = 19؛ وفتح المربعات، N = 17، على التوالي). ثم، Atp1a3+ − والفئران البرية من نوع انقسمت إلى مجموعات 'أكد' و 'عدم التشديد على'. الجسم الأوزان بين 6 و 12 أسبوعا من العمر من 'عدم التشديد على' Atp1a3+ − (فتح الدوائر، ن = 9)، 'عدم التشديد على' البرية من نوع (فتح المربعات، N = 8)، 'وأكد' Atp1a3+ − (دوائر صلبة، ن = 10)، و 'شدد على' البرية من نوع (الصلبة مربعات، N = 9) وقيست الفئران. البيانات هي ± يعني أجريت التحاليل الإحصائية التنمية المستدامة. (t-للفئران منذ 4 أسابيع) واختبار العشوائية t-مع أسلوب التكيف هولم للفئران البالغ من العمر 6-12 أسبوع من ص23. تم تعديل الرقم 7 من مرجع18 بإذن السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل البصمة ومربع المعلق اختبار اختبارات سلوكية بسيطة وغير مكلفة للدالة السيارات من الفئران. تم اكتشاف تعمل السلوك العصبي في عدة نماذج الماوس بهذه الاختبارات بنجاح. على سبيل المثال، تقصير طول برايد في التصلب العضلي الجانبي24، ازدياد طول خطوة غير متناظرة في ترنح-توسع الشعريات25، ازدياد طول التداخل في مرض هنتنغتون26 وخلل27، و اتسعت قاعدة في ترنح28،29، Angelman متلازمة خلل و30 31 قد تجلى في تحليل البصمة. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أقصر من الوقت معلقة من أن الفئران التحكم في الماوس نموذج دوشين ضمور العضلات32. وبالتالي، سيكون من المفيد تقييم الضعف الحركي من الفئران كل الاختبارات المبينة في هذه الورقة.

وهناك خطوة حاسمة لهذا البروتوكول للحصول على آثار أقدام حادة. من المهم جداً وضع ماوس على الورق مباشرة بعد غمر القيعان من أطرافه بالحبر لتجنب التجفيف. من الضروري الانتهاء من خطوات غمر (الخطوات 2.2.3 و 2.3.3) في فترة زمنية قصيرة. عيب هذا البروتوكول لتحليل البصمة هي أن المعلمات التي تم الحصول عليها محدودة لتلك البسيطة التي لا تتضمن المعلومات الزمنية (مثلاً، مدة مشيه دورة والخطوة تسلسل لكل قدم) والمعلومات المادية (مثل ضغط بصمة استناداً إلى لوحة اللمس LED). عندما تكون المعلومات الزمنية والمادية المطلوبة، يجب استخدام جهاز تحليل مشيه الآلي. وبدلاً من ذلك، يمكن الحصول على المعلومات الزمنية لنمط مشيه كاميرا عالية السرعة33. وثمة عيب آخر أن قياس المعلمات على الورقة المطبوعة القدم أكثر شاقة من تحليل مشيه الآلي. لتطبيقها في المستقبل، سيتعين أن وضع برنامج لجمع البيانات الآلي أو سيميوتوماتيد من الورقة المطبوعة القدم إنقاص المعلمات قياس الجهد المبذول.

لتحميل الضغط، يمكن أن تختلف مجموع عدد ومدة كل دورة في هذا البروتوكول. ضبط النفس الإجهاد قد أجريت مع مدد وعدد من التطبيقات المختلفة (على سبيل المثال.، واحد لمدة 5 دقائق34، واحد ح 2435و 12 ح x 5 دورات36ح 6 × 31 الدورات37، استعرض في الرقم 20). على حد علمنا، لا دراسة منهجية تتعلق بآثار من مجموع عدد ومدة كل دورة على الوظيفة الحركية للفئران. نشاط الفئران في حقل مفتوح تتأثر بالإجهاد واحدة تحميل ح 138 أو ح 2 ولكن ليس بأن19من 15 دقيقة. مدة طويلة لتحميل الإجهاد قد يؤدي إلى العجز الحركي الشديد. لعدد أحمال الإجهاد، يصبح موقف الفئران أوسع من أن الفئران غير أكد بعد 36 مرة من الإجهاد تحميل (ح 1 مرتين أسبوعيا)، ولكن ليس بعد 30 مرة39. تفاقم الإجهاد المزمن من ضبط النفس (6 ساعات يوميا لمدة 31 يوما متتالية) أداء روتارود في نموذج الفأر من مرض باركنسون37. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها وقت معلقة 'شدد على' Atp1a3+ − الفئران أصبح أقصر من الفئران البرية من نوع 'أكد' بعد 24 مرة من الإجهاد (في 12 أسبوعا عمر)، لكن ليس بعد 18 مرات التحميل أو أقل (في 4، 6، 8، و 10 أسابيع من العمر). ولذلك، تحميل الإجهاد المتكررة مطلوب لتحريض بعض العجز الحركي في الفئران، على الرغم من أن لا يمكن استبعاد تقلد العجز الحركي بعد فترة طويلة من بدء واحد أو عدة مرات للتأكيد على تحميل. عندما لا تظهر الفئران النمط الظاهري السلوك العصبي في هذا البروتوكول، التوصية لزيادة عدد ومدة الإجهاد تحميل كل دورة. وفي المقابل، عندما تظهر الفئران شذوذ مشيه من واحدة أو عدة مرات للتأكيد على تحميل، مدة وعدد يمكن تقليلها.

أخيرا، يمكن أن تتأثر أداء المشي ومعلقة أحرف السلوكية العاطفية (مثل القلق والنشاط) عدا من اختلال وظيفي في السيارات. وكثيراً ما تشغيل الفئران مع القلق عالية ومع فرط النشاط (بدلاً من سيرا على الأقدام) إلى مربع الهدف. قد سيرا على الفئران تبين السلوك مثل الاكتئاب مع توقف متكررة. ولذلك، قد لا يكون نمطاً بصمة شاذة بسبب العجز في السيارات. وهكذا، لتأكيد شذوذ مشيه الناجمة عن العجز الحركي فقط، إجراء إضافية الاختبارات التي تقييم الخصائص العاطفية (النشاط: اختبار حقل مفتوح؛ والقلق: فتح المجال ومرتفعة بالإضافة إلى اختبار المتاهة؛ والسلوك مثل الاكتئاب: اضطرت السباحة اختبار) بعد هذا البروتوكول كما هو موضح سابقا18 من المستحسن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها JSPS (الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم) كاكينهي (معونات ج البحوث العلمية)، منح رقم 18 ك 07373 (النظام المنسق)، والإعانات المالية للجامعات الخاصة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanging box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking pen ZEBRA MO-120-MC-BK
Goal box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/ Accessory for apparatus of balanced beam test
Boxes O’hara & Co. - Side wall of runway
Black ink Shin-asahi -
Red ink Maruyamakogyo BC-6
Disposable Petri Dish Corning 351008 Petri dishes (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3 Askul 701-712 White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tube Corning 430829
Square drill KAKURI Corporation DIY FACTORY (K32-0313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warner, T. T. Movement disorders. Practical Guide to Neurogenetics. , Elsevier Health Sciences. (2008).
  2. Brashear, A., DeLeon, D., Bressman, S. B., Thyagarajan, D., Farlow, M. R., Dobyns, W. B. Rapid-onset dystonia-parkinsonism in a second family. Neurology. 48 (4), 1066-1069 (1997).
  3. Linazasoro, G., Indakoetxea, B., Ruiz, J., Van Blercom, N., Lasa, A. Possible sporadic rapid-onset dystonia-parkinsonism. Movement Disorders. 17 (3), 608-609 (2002).
  4. Svetel, M., Ozelius, L. J., et al. Rapid-onset dystonia-parkinsonism: case report. Journal of Neurology. 257 (3), 472-474 (2010).
  5. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. T. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. PAIN. 102 (1), 203-209 (2003).
  6. Berryman, E. R. DigigaitTM quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  7. Beare, J. E., Morehouse, J. R., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
  8. Rushton, R., Steinberg, H., Tinson, C. Effects of a single experience on subsequent reactions to drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 20, 99-105 (1963).
  9. Lee, C. C., Peters, P. J. Neurotoxicity and behavioral effects of thiram in rats. Environmental health perspectives. 17, 35-43 (1976).
  10. van der Zee, C. E., Schuurman, T., Traber, J., Gispen, W. H. Oral administration of nimodipine accelerates functional recovery following peripheral nerve damage in the rat. Neuroscience Letters. 83 (1-2), 143-148 (1987).
  11. Leroy, T., Stroobants, S., Aerts, J. -M., D'Hooge, R., Berckmans, D. Automatic analysis of altered gait in arylsulphatase A-deficient mice in the open field. Behavior Research Methods. 41 (3), 787-794 (2009).
  12. Sango, K., McDonald, M. P., et al. Mice lacking both subunits of lysosomal beta-hexosaminidase display gangliosidosis and mucopolysaccharidosis. Nature Genetics. 14 (3), 348-352 (1996).
  13. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments. (76), e2610 (2013).
  14. Djamshidian, A., Lees, A. J. Can stress trigger Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgey, and Psychiatry. 85 (8), 879-882 (2014).
  15. Brashear, A., Dobyns, W. B., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3. Brain. 130 (Pt 3), 828-835 (2007).
  16. Kirshenbaum, G. S., Saltzman, K., Rose, B., Petersen, J., Vilsen, B., Roder, J. C. Decreased neuronal Na+,K+-ATPase activity in Atp1a3 heterozygous mice increases susceptibility to depression-like endophenotypes by chronic variable stress. Genes, Brain and Behavior. 10 (5), 542-550 (2011).
  17. DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioral Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
  18. Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioral Brain Research. 272, 100-110 (2014).
  19. Zimprich, A., Garrett, L., et al. A robust and reliable non-invasive test for stress responsivity in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 125 (2014).
  20. Buynitsky, T., Mostofsky, D. I. Restraint stress in biobehavioral research: recent developments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (7), 1089-1098 (2009).
  21. Ikeda, K., Satake, S., et al. Enhanced inhibitory neurotransmission in the cerebellar cortex of Atp1a3-deficient heterozygous mice. The Journal of Physiology. 591 (13), 3433-3449 (2013).
  22. Crawley, J. N. Motor functions. What's Wrong with My Mouse?. , John Wiley & Sons. (2007).
  23. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.R-project.org/ (2014).
  24. Wils, H., Kleinberger, G., et al. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3858-3863 (2010).
  25. Eilam, R., Peter, Y., et al. Selective loss of dopaminergic nigro-striatal neurons in brains of Atm-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12653-12656 (1998).
  26. Lin, C. -H., Tallaksen-Greene, S., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  27. Dang, M. T., Yokoi, F., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
  28. Glynn, D., Drew, C. J., Reim, K., Brose, N., Morton, A. J. Profound ataxia in complexin I knockout mice masks a complex phenotype that includes exploratory and habituation deficits. Human Molecular Genetics. 14 (16), 2369-2385 (2005).
  29. Becker, E. B. E., Oliver, P. L., et al. A point mutation in TRPC3 causes abnormal Purkinje cell development and cerebellar ataxia in moonwalker mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (16), 6706-6711 (2009).
  30. Heck, D. H., Zhao, Y., Roy, S., LeDoux, M. S., Reiter, L. T. Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Human Molecular Genetics. 17 (14), 2181-2189 (2008).
  31. Kirshenbaum, G. S., Dawson, N., et al. Alternating hemiplegia of childhood-related neural and behavioural phenotypes in Na+,K+-ATPase α3 missense mutant mice. PLoS ONE. 8 (3), e60141 (2013).
  32. Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioral Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
  33. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3 (Pt 7), e1175 (2015).
  34. Cecchi, M., Khoshbouei, H., Morilak, D. A. Modulatory effects of norepinephrine, acting on alpha1 receptors in the central nucleus of the amygdala, on behavioral and neuroendocrine responses to acute immobilization stress. Neuropharmacology. 43 (7), 1139-1147 (2002).
  35. Chu, X., Zhou, Y., et al. 24-hour-restraint stress induces long-term depressive-likephenotypes in mice. Scientific Reports. 6, 32935 (2016).
  36. Freeman, M. L., Sheridan, B. S., Bonneau, R. H., Hendricks, R. L. Psychological Stress Compromises CD8+ T cell control of latent herpes simplex virus type 1 infections. The Journal of Immunology. 179 (1), 322-328 (2007).
  37. Lauretti, E., Di Meco, A., Merali, S., Praticò, D. Chronic behavioral stress exaggerates motor deficit and neuroinflammation in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Translational Psychiatry. 6, e733 (2016).
  38. Quartermain, D., Stone, E. A., Charbonneau, G. Acute stress disrupts risk assessment behavior in mice. Physiology and Behavior. 59 (4-5), 937-940 (1996).
  39. Bannon, D. The Behavioural effects of stress and aluminum toxicity on a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Parkinsonism-dementia complex. , 1-186 (2015).

Tags

السلوك، العدد 143، تحليل البصمة، المعلق اختبار مربع، ضبط النفس الإجهاد، اختبار سلوكية، والماوس، والوظيفة الحركية
تطبيق البروتوكول منخفضة التكلفة لتحليل البصمة والمعلق اختبار مربع للفئران الإجهاد المزمن من ضبط النفس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost… More

Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. J. Vis. Exp. (143), e59027, doi:10.3791/59027 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter