Summary
양적 방법 확인 하 고 자동으로 꼬마 선 충의 phenotypic 프로 파일링 분석 하 여 화학 물질의 급성 독성 예측 개발 되었습니다. 이 프로토콜 384-잘 접시에 화학 물질과 웜 치료, 비디오, 캡처 및 독물학 관련된 고기를 계량 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
쥐 또는 쥐와 같은 더 높은 주문 유기 체에 화학 물질의 독성 시험 적용 시간과 비싼, 그들의 긴 수명 및 유지 보수 문제 때문입니다. 선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 독성 시험을 위한 이상적인 선택 있도록 장점이 오히려: 짧은 수명, 쉽게 경작, 및 효율적인 복제. 여기, 우리는 자동 phenotypic 프로 파일링 C. 선 충 의 384-잘 접시에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 선 충 벌레 액체 매체 및 화학 치료, 384-잘 접시에 교양 있으며 동영상 33 웜 기능에 화학적 영향을 계량 하기 각 잘 찍힌다. 실험 결과 계량된 형 기능 분류 및 다른 화합물에 대 한 급성 독성을 예측 하 고 설정할 수 더 전통적인 화학 독성 평가 시험에 대 한 우선 순위 목록을 설치류 모델에서을 보여 줍니다.
Introduction
산업 생산 및 사람들의 일상 생활에 적용 하는 화합물의 급속 한 발전, 함께 그것은 독성 화학 물질에 대 한 모델을 테스트를 공부 하는 것이 중요. 대부분의 경우, 설치류 동물 모델 건강에 다른 화학 물질의 잠재적 독성을 평가 하기 위해 채택 된다. 일반적으로, 치명적인 농도 (즉, assayed 50% 치 사 량 [LD50] 다른 화학 물질의) 결정 시간이 소요 되 고 매우 비싼 vivo에서, 설치류 (쥐/마우스) 모델에서 전통적인 매개 변수로 사용 됩니다. 또한, 감소, 수정, 또는 교체는 동물 복지 및 윤리 중심 (3R) 원리, 더 높은 동물의 교체는 과학 연구1,2,3 가치를 허용 하는 새로운 방법 . C. 선 충 은 토양에서 격리 되어 자유 롭 살아있는 선 충 류 이다. 그것은 널리 사용 되었습니다 실험실에서 연구 유기 체로 짧은 수명, 쉽게 재배, 효율적인 복제 등의 유익한 특성 때문에. 또한, C. 선 충 에 기본적인 생리 적 프로세스 및 스트레스 응답을 포함 하 여 많은 기본적인 생물 학적 경로 높은 포유류4,5,,67 에 보존 됩니다. , 8. 우리와 다른 사람 만든 비교에, C. 선 충 독성 및 독성 설치류9관찰 사이 좋은 색인 이다. 이 모든 게 선 충 C. 화학 독성 vivo에서의 효과 테스트 하는 좋은 모델.
최근, 일부 연구 정량 C. 선 충의 phenotypic 특징. 화학2,,310 의 독성 벌레11의 노화를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 경작 시스템 및 이미지 분석 시스템, 벌레는 다른 화학 치료12에서 384-잘 접시에 교양 있는 액체 벌레를 결합 하는 방법을 개발. 이 양적 기술 액체 매체와 384-잘 접시에 화학 치료의 12-24 h 후 C. 선 충의 33 매개 변수를 자동으로 분석 개발 되었습니다. 자동화 된 현미경 단계 실험 비디오 수집에 사용 됩니다. 벌레의 이동 행동에 관련 된 33 기능 계량 및 동영상 사용자 정의 설계 프로그램에 의해 처리 됩니다. 메서드는 10 화합물의 치료에서 벌레 고기를 계량 하는 데 사용 됩니다. 결과 표시 다른 독성 C. 선 충의 고기를 변경할 수 있습니다. 이러한 계량된 고기를 식별 하 여 다른 화합물의 급성 독성 예측 사용할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 관찰과 실험 액체 문화에서 C. 선 충 의 phenotypic 정량화를 촉진. 이 메서드는 화학 독성 평가에 다른 화합물의 급성 독성을 예측 하 고 대 한 우선 순위 목록을 설정 형 quantifications C. 선 충 의 응용 프로그램에 대 한 더 전통적인 화학 독성 평가 설치류 모델에서 테스트합니다. 또한,이 방법은 독성 검사 및 식품 첨가제 에이전트 오염, pharmacautical 화합물, 환경 외 인 화합물, 그리고에 새로운 화학 물질 또는 화합물의 테스트에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
프로토콜 질병 예방 및 중국에 있는 컨트롤에 대 한 베이징 센터의 동물 윤리 위원회의 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 화학 준비
- 화학 물질을 (표 1 및 표의 재료)를 가져옵니다.
- 100% 치 (LC100, 24 h)의 최소 농도 웜 100 %nonlethality (LC0, 24 h)의 최대 농도 대 한 개별 화학 물질의 최고 및 최저 복용량을 결정 합니다. (표 1)의 높은 농도의 6 희석 사용 합니다.
참고: LC100와 LC0는 새로운 화학 물질에 대 한 복용량을 결정 하기 위해 예비 웜 치 테스트9 실시 합니다. - 필요한 농도 x 2 K-중간 (자료 테이블)과 각 화학 물질을 희석. 컨트롤 K-매체를 사용 하 여 화학 물질에 의해 발생 하는 표현 형 변경 비교.
- 예를 들어 카드뮴 염화 (CdCl2)의 7 그라데이션 농도 준비 (표 1). 2 배를 준비 하 높은 집중 된 수성 해결책 (4.64 mg/mL), K-중간의 8 ml에서 CdCl2 고체 분말의 92.8 mg를 녹이 고 가루는 완전히 해산 후 최대 10 mL를 채우기. K-매체와 희석 하 여 다른 농도 준비 합니다.
- 화학에서 모든 농도 대 한 8 개의 병렬 우물을 준비 합니다. 각 잘 화학 솔루션 x 2의 50 µ L를 포함합니다. (표 2) 컨트롤로 K-중간의 8 개의 병렬 우물의 적어도 3 개 그룹을 준비 합니다.
참고: 간단 하 게, 작업 솔루션 x 2의 500 µ L의 볼륨은 각 화학의 단일 투여에 필요한.
2. 웜 준비
- 야생-타입 N2 웜 및 대장균 OP50 긴장 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다.
- 동기화 된 L4 벌레를 얻을.
- 조 흔 격판덮개에서 대장균 OP50의 단일 식민지를 선택 하십시오. Aseptically LB 국물의 100 mL에 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 그것을 성장합니다
참고: 대장균 OP50 솔루션은 이제 선 충 성장 매체 (NGM, 테이블의 재료) 판 시드를 위한 준비. - NGM 90 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오. 각 씨앗 플레이트 대장균 OP50 솔루션의 300 µ L를 붓는 후 하루. 약 2-3 일 벌레의 대부분에는 성인 무대에 도달 했습니다 때까지 20 ° C에서 OP50는 NGM 접시에 N2 벌레를 품 어.
- 살 균 H2o. 15 mL 원뿔 메 마른 분리기 관으로 수확 벗 웜 웜 2 분 이상에 대 한 진정, H2O, 발음 및 표 백제 버퍼 (자료 테이블)의 5 mL을 추가 하자.
- 소용돌이 관 5 분 동안 회전 30 튜브 (1300 x g)에 계란, 작은 하는 상쾌한 삭제.
- 워시 살 균 H2O와 소용돌이의 5 mL와 함께 계란 튜브 5 s. 원심 분리기 튜브 30 (에서 1300 x g) s, 상쾌한, 제거 하 고 세척에 대 한에 대 한 다시.
- OP50와 새로운 NGM 접시에 계란 플라스틱 20 ° c.에서 그들을 품 어 모니터 부 화 L1 벌레 다음 아침; 벌레 약 40 h에서 L4 단계를 도달할 것 이다.
- 조 흔 격판덮개에서 대장균 OP50의 단일 식민지를 선택 하십시오. Aseptically LB 국물의 100 mL에 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 그것을 성장합니다
- 워시 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 K-매체와 90 mm 페 트리 접시에서 L4 벌레. 벌레는 stereomicroscope에서 K-매체의 100 µ L 당 40 동물의 농도 조정 합니다. 384-잘 접시의 각 음에 50 µ L (~ 20 벌레)를 추가 합니다. 이 동기화 된 벌레 (L4 단계) 화학 물질에 의해 다음 치료에 대 한 준비가 되었습니다.
3. 화학 처리 및 비디오 캡처
참고: 384-잘 접시에 웜 (각 잘에서 50 µ L) 6 7 복용량의 개별 화학 (표 1)에 처리 됩니다. 8 병렬 웰 스, 각 (8 우물 가득 같은 화학 및 동일한 농도, 표 2) 모든 복용량에 대 한 화학 솔루션 x 2의 50 µ L을 포함 준비. 모든 비디오는 거꾸로 한 현미경 (자료 테이블)에 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 화학 치료 실험 24 시간 동안 지속 된다. 24 h 화학 치료 실험 기간 동안 각 잘에 세균성 음식을 추가 하지 마십시오.
- 화학 물질을 추가 하기 전에 자동 무대에 동기화 된 웜 384-잘 접시를 설정 하 고 프로그램된 인수 절차와 각의 동영상 (2 초당 7 프레임 s 스캔 각 접시 ~ 25 분 소요).
- 섹션 1 각 음 (표 2)에 따라 준비 하는 화학 주식 x 2의 50 µ L를 추가 합니다. 시간 0 h 지점으로 설정 합니다.
- 20 ° C에서 384-잘 접시를 품 어 고 인큐베이터 셰이 커에 80 rpm에서 그것을 흔들어.
- 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 자동 단계에 그것을 전송. 걸릴 동영상의 전체 판의 각 잘과 24 h, 12 h K-중간에 각 특정 화학 치료에 대 한 벌레의 고기를 확인. 약 25 분이 한 접시 화면에 대 한 필요 합니다.
4. 실험 비디오 처리
참고: 실험 비디오 및 이미지 처리 프로그램 작성 되었고 포장. 그것은 ( 재료의 표참조) 자유롭게 다운로드 될 수 있다. 실험적인 비디오 이미지 프레임 시퀀스의 형태로 저장 되며 각 비디오의 프레임 시퀀스는 특정 디렉토리에 저장 됩니다. 프로그램 벌레를 인식 하 고 자동으로 고기를 계량 수 있습니다.
- 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI, 그림 1)에서 프레임 시퀀스 디렉터리, 출력 디렉터리, 웜 크기 매개 변수 움직임 임계값 매개 변수 등의 매개 변수를 추가 합니다. 실험적 이미지 처리 분석 버튼을 클릭 합니다.
- 소스 이미지 디렉터리를 선택 하려면 선택 단추를 클릭 합니다.
- 인터페이스에서 중간 결과 디렉터리를 추가 합니다.
참고: 중간 결과 포함 된 이미지. 이러한 중간 결과 처리 된 이미지의 시각적 관찰에 대 한 유용 합니다. - 인터페이스에서 최종 결과 디렉터리를 추가 합니다.
- 인터페이스에서 웜 크기 textbox에서 평균 웜 크기 매개 변수를 추가 합니다.
참고: 실험에 사용 된 크기 매개 변수는 2000. - 이동된 비율의 인터페이스에 추가 합니다.
참고: 비율 실험에 사용 되는 0.93입니다. - 이미지 처리를 시작 하려면 분석 버튼을 클릭 합니다. 추가 매개 변수를 재설정 버튼을 클릭 합니다.
참고: 정의 및 벌레에 대 한 계량 33 기능이 있습니다. 모든 정의 된 고기 ( 표 3에 나열 된) 범주에 의해 정렬 됩니다. 이러한 기능 실험 이미지에서 측정할 수 있습니다. 이러한 기능을 비교 하 여 다른 독성 있는 다른 화학 물질 중 양적 비교를 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
10 개 이상의 화학 물질12의 다른 농도에 노출 하는 벌레의 고기 테스트 했습니다. 테스트에서 33 가지 기능 (0 h, 12 h, 그리고 24 h) 3 시간 시점에 각 화합물에 대 한 정량 했다. 이전에 매뉴얼 및 수명 분석 결과의 자동 분석 비교11,12이루어졌다. 이 분석 결과에서 우리는 화학 물질과 농도 영향을 미칠 수 웜 고기 발견. 이 방법의 개요는 그림 2에 표시 됩니다.
(그림 3 및 그림 4c, d) 결과 벌레 빨리 화학 농도 증가 죽 었다는 것을 보여주었다. 높은 농도, 벌레 똑바로 고 덜 보다 낮은 농도에서 또는 제어 그룹 (그림 3 및 그림 4b) 곡선. (0 h)에서 시작 하 여, 제어 (K-매체) 및 모든 고기에 대 한 화학 치료 사이의 큰 차이 없었다. 주어진된 화학 복용량과 치료의 12 h, 후 벌레의 고기 제어 및 다른 농도 그룹 간의 차이의 다른 정도 보여주었다. 예를 들어 주요 축 길이 증가 하는 시간으로 증가 했다. 높은 화학 농도 더 낮은 그라데이션 추세 이기도합니다. 다른 화학 농도의 그라데이션 동향은 또한 작은 축 길이에 중요 한 (그림 4a, b).
이 분석 결과에서 벌레의 운동 지역 이동 하는 웜 및 운동 성 비율 (그림 4c, d)에 따라 두 가지 방법으로 계산 됩니다. 두 가지 방법의 운동 성 결과 비슷한 패턴을 보였다. 다양 한 농도 (0 h 시간 시점)에서 처음에 제어 그룹 간의 웜 운동 성의 상당한 차이가 있었다. 시간이 지날수록 보여 안정적인 제어 그룹에서 벌레의 운동 성 감소. 12 h 다른 농도에서 화학 치료를 받았다 벌레 운동 성 제어 그룹에 비해 큰 차이가 보였다. 또한, 높은 집중 치료에서 벌레 낮은 농도 치료에서 벌레에 비해 약한 운동 성을 보여주었다. 이 높은 농도 치료에서 벌레 덜 운동 되었다 하 고 빠른 (그림 4c, d) 사망 나타냅니다. 이 결과 설계 메서드는 화학 독성 평가, C. 선 충 의 정량된 고기 화학 독성 식별에 대 한 유용한 마커는 것이 좋습니다.
그림 1 : 소프트웨어의 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 꼬마 선 충의 자동화 된 phenotypic 프로 파일링 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과의 파이프라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 다른 시간 지점에서 4.64 mg/mL CdCl2 (위 패널), 0.464 mg/mL CdCl2 (중간 패널), 및 K-중간 (하단 패널), 벌레의 실험적인 이미지. 이미지에 시간에 걸쳐 384-잘 접시의 한 대표 잘 웜 화학 치료 또는 제어 그룹에서의 상태 변화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 웜 CdCl2의 다른 농도에서 정량된 기능. (한) 정량된 주요 축 길이. (b) 정량된 부 축 길이. (c)는 이동에 의해 정량된 운동 지역. (d)는 이동에 의해 정량된 운동 지역/웜 크기입니다. 바 작 단일 벌레에 각 기능에 대 한 평균 정량화를 표시. 오차 막대는 ± 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 농도 단위 = mg/mL. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 384-잘-접시 10 화학 물질의 노출 농도 C. 선 충 급성 독성 테스트
표 2:는 회로도 384-잘 접시 레이아웃의
표 3: 벌레의 고기 정의.
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Discussion
C. 선 충 의 장점은 독극물9, 모두 기계 연구와 높은 처리량 검열 방법의 증가 사용에 이르렀다. 독물학 연구에서 다른 모델 시스템 보완에 C. 선 충 에 대 한 증가 역할은 최근 몇 년 동안, 특히 새로운 화학 물질의 급속 한 독성 평가 대 한 놀라운 되었습니다. 이 문서에는 자동 식별 및 화학 독성의 평가 대 한 384-잘 접시에 고기를 벌레의 높은 처리량, 양적 심사의 새로운 분석 결과 제공합니다. 이 분석 결과 24 시간 내 화학 물질의 급성 독성 시험 고 subacute 독성 테스트도 더 많은 시간 포인트 데이터 수집 및 벌레에 음식 소스 (OP50)을 제공 하는 경우에 적용할 수 있습니다.
화학 물질을 희석 사용 매체가 다를 수 있습니다; 우리는 소피외. 를 참조 하 여 분석 결과에 K-매체를 선택 13. 웜 제어 및 화학 치료 그룹 K 매체에 교양 있었다. 인공 민물 솔루션 또는 낮은 이온 강도 가진 토양 솔루션 K-매체에 대 한 일 수 있었다.
다른 독성을 가진 화학 제품 다른 패턴에 C. 선 충 의 고기를 변경할 수 있습니다. 이 테스트에서 사용 된 화학 물질 세계 조화 시스템의 분류와 라벨의 화학 물질 (GHS)의 6 세 번째 카테고리에서 선정 됐다. C. 선 충 0%-100% 사망률 복용량 범위를 커버 하는 6 개 이상의 복용량 수준에서 화학 물질에 노출 되었다. 낮은 물 가용성을 가진 화학 물질, 위해 DMSO 물에 화학 해체를 촉진 하는 것이 좋습니다. DMSO의 높은 농도 웜 개발 및 수명14에 영향을 미칠 수 있습니다, 0.2 %DMSO 보다 더 수 중 테스트를 위해 사용 되어야 한다.
자동으로 정량된 기능 벌레의 정량된이 고기는 매우 독성 화학 물질의 식별에 유용 하 게 보여 주는 다른 독성 중에서 상당한 차이 보여줍니다. 그것은 phenotypic 프로 파일링 하는 것이 보존된 기능 분류는 vivo에서 모델 생물으로 선 충 C. 선 충 을 사용 하 여 다른 화학 물질의 독성을 예측 하 였음을 가리킨다.
미국 국립 독성 프로그램 (NTP) 미국 환경 보호국 (EPA는)와 국립 보건원 (NIH) 화학 유전체학 센터, 지금은 국립 센터 양해 각 서를 통해 Tox21 커뮤니티 설립 번역 적인 과학 (NCATS) 발전. Tox21 인간 독물학 응답의 예측 모델을 개발 하 고 추가 vivo에서 독성 테스트를 위해 화학 물질을 우선 순위를 높은 처리량 체 외 검사 및 독성의 메커니즘을 식별 하기 위해 테스트 vivo에서 대체 동물 모델을 사용 합니다. 그 노력의 일환으로 선 충 C. EPA의 ToxCast 단계 I와 단계 II 라이브러리를 선도 하는 화학 물질에 대 한 각각 292 고 676 화학 물질을 포함 하는 애벌레의 개발 및 성장15감소에 사용 되었다. COPAS (복잡 한 개체 파라미터 분석기 및 정렬) 플랫폼도 사용 하 고 웜 독물학 심사 연구2에 대 한. 그러나, COPAS 플랫폼만 웜 폭, 웜 길이, 형광 강도 등 몇 가지 기능을 단정. 이 메서드는 현재 방법 벌레를 사용 하 여 새로운 화학 물질의 독성을 신속 하 게 제공 하는 개선 이다.
몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서: 384-잘 접시, 화학 치료, 실험 이미지 캡처 및 표현 형 정량화에 벌레 문화. 전통적인 독성 평가 방법에 비해,이 프로토콜 수동으로 계산 하기 어렵고 운동 성 웜, 웜 폭, 웜 크기, 회색 등 모든 화학 물질의 독성을 반영 하기 위해 유용한 벌레의 몇 가지 고기를 계량 수 있습니다. 강도입니다. 분명히,이 높은 처리량 분석 결과 화학 독성의 예측을 위한 귀중 한 독성 모델 접근 되며 prescreening 설치류 동물 실험 하기 전에 화학 물질의 사용 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 기술은 여러 분야에서 급속 한 독성 평가에 방법을 포장 한다. 연구원은 독성 음식 관련 중독증, 제약 화합물의 안전 평가로 급성 독성 검사의 긴급 분석 및 새로운 화학 물질과 환경 외 인 화합물의 검출 메서드를 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 친절 하 게 보내는 C. 선 충 CGC를 감사 합니다. 이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705);에 의해 지원 되었다 중국 그랜트 (#31401025, #81273108, #81641184), 자본 건강 연구와 베이징 (#2011-1013-03), 환경 독물학 (# 베이징 주요 연구실의 오프닝 기금에에서 특별 한 프로젝트의 개발의 국가 자연과학 기초 2015HJDL03), 산 동성, 중국 (ZR2017BF041)의 자연 과학 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
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