Summary
Количественный метод был разработан для выявления и прогнозирования острой токсичности химических веществ, автоматически анализируя фенотипического профилирование Caenorhabditis elegans. Этот протокол описывает, как для лечения червей с химическими веществами в 384-ну пластине, захвата видео и количественно токсикологические связанных фенотипов.
Abstract
Применяя тестирование токсичности химических веществ в высших организмов порядка, такие как мышей или крыс, длительным и дорогостоящим, из-за их долговечность и проблемы обслуживания. Напротив, нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) имеет преимущества, чтобы сделать его идеальным выбором для тестирования токсичность: эффективное воспроизведение короткий срок и легко культивирования. Здесь мы описываем протокол для автоматического фенотипические профилирования C. elegans в 384-ну пластине. Черви нематоды культивировали в 384-ну плита с жидким средних и химические лечения, и видео взяты из каждой скважины для количественного определения химического влияния на 33 особенности червя. Экспериментальные результаты показывают, что количественных фенотип функции можно классифицировать и предсказать острой токсичности для различных химических соединений и создать список приоритетных для дальнейших испытаний оценки традиционных химическая токсичность в модели грызунов.
Introduction
Наряду с быстрым развитием химических соединений, для промышленного производства и повседневной жизни людей важно для изучения токсичности тестирования моделей для химических веществ. Во многих случаях грызун животную модель используется для оценки потенциальной токсичности различных химических веществ на здоровье человека. В целом определение концентраций смертельной (т.е. Оксиметрический анализ 50% смертельная доза [ЛД50] различных химических веществ) используется в качестве параметра традиционной модели грызунов (крысы/мыши) в естественных условиях, которая является длительным и очень дорого. Кроме того вследствие сокращения, уточнить, или заменить (3R) принцип, который имеет центральное значение для благополучия животных и этики, новые методы, которые позволяют замену высших животных являются ценными для научных исследований1,2,3 . C. elegans это Свободноживущие нематоды, который был изолирован от почвы. Он широко используется как организм исследований в лаборатории из-за его полезных характеристики, такие как эффективное воспроизведение короткий срок и легко культивирования. Кроме того многие основные биологические пути, включая основные физиологические процессы и реакции стресса в C. elegans, сохраняются в высших млекопитающих4,5,6,7 , 8. в нескольких сравнений, сделали мы и другие, есть хороший конкорданцию C. elegans токсичности и токсичности в грызунов9. Все это делает C. elegans хорошая модель для проверки эффектов химической токсичности в естественных условиях.
Недавно некоторые исследования количественно Фенотипические особенности C. elegans. Функции могут использоваться для анализа токсичности химических веществ2,3,10 и старение червей11. Мы также разработали метод, который сочетает в себе жидкого червь, культивирования и системы анализа изображений, в котором червей культивировали в 384-ну плита под12различных химических обработок. Этот количественный метод был разработан для автоматически анализировать 33 параметры C. elegans после 12-24 ч химической обработки в 384-ну плита с жидкой среды. Автоматизированный микроскопа используется для экспериментальных видео приобретения. Видео обрабатываются программой специально, и количественно 33 особенности, связанные с движущейся поведение червей. Этот метод используется для количественного определения червь фенотипов под лечения 10 соединений. Результаты показывают, что различные токсичность может изменить фенотипов C. elegans. Эти количественные фенотипов может использоваться для выявления и прогнозирования острая токсичность различных химических соединений. Общая цель этого метода заключается в содействии наблюдения и фенотипические количественной оценки экспериментов с C. elegans в жидком культуры. Этот метод полезен для применения C. elegans в оценках токсичности химических и фенотип количественной, которые помогают предсказать острая токсичность различных химических соединений и создать список приоритетных для дальнейшего традиционных Химическая токсичность оценки тестов в модели грызунов. Кроме того этот метод может применяться к токсичности скрининг и тестирование новых химических веществ или соединения как пищевой добавки агент загрязнения, pharmacautical соединений, экологические внешние соединения и так далее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует животных ухода руководящие принципы Комитета по этике животных центра Пекина для профилактики заболеваний и управления в Китае.
1. Химическая подготовка
- Получения химических веществ (Таблица 1 и Таблица материалов).
- Определите, высокие и низкие дозы отдельных химических веществ для минимальной концентрации 100% летальности (LC100, 24 ч) и максимальная концентрация 100% nonlethality (LC0, 24 h) для червей. Используйте по крайней мере шесть разведений высокой концентрации (Таблица 1).
Примечание: Провести предварительный червь летальность тест9 исследовать LC100 и LC0 для нового химического вещества, чтобы определить дозировку. - Разбавляют до 2 x требуемой концентрации каждого химического вещества с K-средних (Таблица материалов). Используйте K-средних как элемент управления для сравнения фенотип изменения, вызванные химическими веществами.
- Например, подготовить 7 градиента концентрации кадмия хлорида (2CdCl) (Таблица 1). Подготовить 2 x высокий концентрированный водный раствор (4.64 мг/мл), растворяют 92,8 мг CdCl2 твердых порошка в 8 мл K-средних и заполнить до 10 мл, после того, как порошок полностью не растворится. Подготовьте другие уровни концентрации разбавления с K-средних.
- Подготовка восьми параллельных скважин для каждого концентрация химического градиента. Каждый хорошо содержит 50 мкл 2 x химический раствор. Подготовьте по крайней мере три группы восьми параллельных скважин K-средних как элементы управления (Таблица 2).
Примечание: В краткой, объем 500 мкл 2 x рабочий раствор необходимо для однократной дозы каждого химического вещества.
2. червь подготовка
- Одичал тип N2 червей и получите ОР50 штаммов Escherichia coli от Caenorhabditis центр генетики (CGC).
- Получите синхронизированные L4 червей.
- Выберите одного Колония E. coli ОР50 от полосу плиты. Асептически прививок колонии в 100 мл LB отвара и вырастить его на ночь в 37 ° C.
Примечание: E. coli ОР50 решение теперь готов для заполнения нематоды роста среднего (NGM, Таблица материалов) пластины. - Налейте NGM 90 мм пластиковая пластина Петри. Семя каждой пластины с 300 мкл раствора E. coli ОР50 на следующий день после заливки. Инкубируйте N2 червей на NGM пластины с ОР50 при 20 ° C около 2-3 дней до тех пор, пока большинство червей достигли взрослой стадии.
- Урожай беременных червей в 15 мл стерильного конические пластиковых пробирок с стерильных H2O. Пусть черви поселиться на по крайней мере 2 мин, аспирационная H2O и добавить 5 мл отбеливателя буфера (Таблица материалов).
- Вихревой трубки для 5 мин, спина трубки для 30 сек (при 1300 x g) пеллет яйца, и отбросить супернатант.
- Яйца с 5 мл стерильной H2O и вихревой трубе для 5 s. центрифуги трубки для 30 сек (при 1300 x g), удалить супернатант и мыть снова Вымойте.
- Пипетка яйца на новой NGM пластину с ОР50. Инкубировать их в 20 ° C. Монитор, насиженными L1 червей утром следующего дня; черви достигнет стадии L4 в приблизительно 40 ч.
- Выберите одного Колония E. coli ОР50 от полосу плиты. Асептически прививок колонии в 100 мл LB отвара и вырастить его на ночь в 37 ° C.
- Вымойте L4 червей у плиты Петри 90 мм с K-средних в 50 мл стерильного Конические трубки. Отрегулируйте концентрацию черви ~ 40 особей на 100 мкл K-средних под стереомикроскопом. Добавьте 50 мкл (~ 20 черви) в каждой скважине 384-ну пластины. Эти синхронизированные черви (L4 этап) готовы следующих обращения с химическими веществами.
3. Химическая обработка и захвата видео
Примечание: В 384-ну плита, черви (50 мкл в каждой скважине) обрабатываются с шести до семи дозы индивидуального химического (Таблица 1). Подготовка восьми параллельных скважин, каждая из которых содержит 50 мкл 2 x химический раствор для каждой дозы (восемь скважин заполнены с то же самое химическое и такой же концентрации, Таблица 2). Все видео собраны с помощью цифровой камеры, прикрепленной к инвертированным микроскопом (Таблица материалов). Химическая обработка эксперимент длится 24 ч. Не добавляйте бактериальных продуктов питания для каждой скважины во время эксперимента химической обработки 24 h.
- Перед добавлением химических веществ, установите пластину 384-колодец с синхронизированной червей на автоматическое сцену и снимать видео каждой скважины с процедурой запрограммированных приобретения (7 кадров в секунду для 2 s; ~ 25 минут для сканирования каждой пластины).
- Добавьте 50 мкл 2 x химических запасов, подготовленный в соответствии с разделом 1 для каждой скважины (Таблица 2). Установите время как точки 0 h.
- Инкубировать 384-ну пластины при 20 ° C и встряхните его на 80 об/мин в шейкер инкубатор.
- Снять пластину из инкубатора и передать его на автоматическое стадии. Снимайте видео каждой скважины целую тарелку, в 12 ч. и 24 ч, чтобы проверить фенотипов червей для каждой конкретной химической обработки в K-средних. Около 25 мин требуются на экране одного планшета.
4. эксперимент обработка видео
Примечание: Программа для экспериментальной видео и обработки изображений была написана и упакованы. Он может быть свободно загружен (см. Таблицу материалы). Экспериментальное видео хранится в виде последовательности изображений кадра, и последовательность кадров каждого видео хранится в определенном каталоге. Программа может признать червей и количественно фенотипов автоматически.
- В графическом интерфейсе пользователя (GUI, рис. 1) добавьте параметры, такие как кадр последовательности каталога, в выходной каталог, червь параметр size и параметр порога движения. Нажмите кнопку Analyze для обработки экспериментальной изображений.
- Нажмите кнопку выбрать для выбора каталога исходного изображения.
- Добавьте каталог, средний результат в интерфейсе.
Примечание: Средняя результаты включают сегментирована изображения. Эти средние результаты являются полезными для визуального наблюдения обработанных изображений. - Добавьте каталог, конечный результат в интерфейсе.
- Добавьте параметр средняя червь размер в поле Размер червя в интерфейсе.
Примечание: Параметр size, используемый в экспериментах составляет 2000. - Добавление порога перемещения соотношения в интерфейсе.
Примечание: Соотношение, используемых в экспериментах — 0,93. - Нажмите кнопку Analyze для начала обработки изображений. Нажмите кнопку Сброс , чтобы очистить добавленных параметров.
Примечание: Есть 33 и количественно определенные для червей. Все определенные фенотипов сортируются по категориям (перечислены в таблице 3). Эти функции могут быть количественно из экспериментальной изображений. Количественное сравнение среди различных химических веществ, которые имеют различные токсичности, может быть сделано путем сравнения этих функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы протестировали фенотипов червей, воздействию различных концентраций более чем 10 химических веществ12. В тесте 33 отличительные черты были количественно для каждого химического соединения в трех точках времени (0 h, 12 h и 24 h). Ранее сравнение между ручной и автоматический анализ пробирного срок было сделано11,12. В этот assay мы обнаружили, что химические вещества и концентрации могут влиять червь фенотипов. Обзор этого метода показан на рисунке 2.
Результаты (рис. 3 и рис. 4c, d) показало, что черви быстро, как химических увеличилась концентрация умер. При более высоких концентрациях червей стал ровнее и менее изогнутый, чем при более низких концентрациях или в контрольных группах (bрис. 3 и рис. 4). В начале (0 ч), был не значительная разница между управления (K-средних) и химических обработок для всех фенотипов. После 12 h лечения с данного химического дозировка фенотипы червей показал разной степени различия между контролем и различные концентрации группами. Например как увеличить время увеличена длина главной оси. Существует также тенденция градиента от нижней в более высокой концентрации химических веществ. Градиент тенденция концентрации различных химических веществ также был значительным в малой оси длина (рис. 4, б).
В этот assay червя моторики рассчитывалось двумя способами, основанный на области червь, переехал и коэффициент подвижности (рис. 4c, d). Подвижность обоих способов результатам аналогичных моделей. Существовали никаких значимых отличий червь подвижности среди различной концентрации и контрольными группами в начале (в момент времени 0 h). Поскольку время прошло, червей в контрольных группах показал стабильную снижение подвижности. В 12 ч черви, которые прошли химических обработок в различных концентрациях показали значительные различия в подвижности, по сравнению с контрольными группами. Кроме того червей под более высокие концентрации лечение показали слабые моторики, по сравнению с червей под нижней концентрации лечение. Это означает, что черви под более высокие концентрации лечение стало менее подвижные и умер быстрее (рис. 4c, d). Эти результаты показывают, что разработанный метод полезен для оценки токсичности химических, и количественных фенотипов C. elegans являются полезным маркеров для идентификации химическая токсичность.
Рисунок 1 : Интерфейс программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Трубопровод высокой пропускной способности анализа для прогнозирования химической токсичности автоматизированных фенотипические профилирования Caenorhabditis elegans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Экспериментальная изображения червей под 4.64 мг/мл CdCl2 (Верхняя панель), 0.464 мг/мл CdCl2 (средняя группа) и K-средних (Нижняя панель), в разное время точках. Изображения показывают изменения статуса червей под химической обработки или в группе управления в один представитель хорошо 384-ну пластины на протяжении времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Количественные характеристики червей под разные концентрации CdCl2. () Длина количественных главной оси. (b) Длина количественных малой оси. (c) количественных подвижности в перемещении области. Размер области/червь (d) количественных подвижности в перемещении. Бар участки показывают средний количественная оценка для каждого компонента на одном червей. Планки погрешностей обозначим ± стандартное отклонение (SD). Концентрация единица = мг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: концентрация воздействия 10 химических веществ для 384-хорошо пластины C. elegans test. острой токсичности
Таблица 2: Схема макета 384-ну пластины.
Таблица 3: Определение фенотипов червей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества C. elegans привели к его рост использования в токсикологии9, как механистической исследований и высокопроизводительного скрининга подходов. Повышение роли C. elegans дополняя другие модели систем в токсикологических исследований был замечательным в последние годы, особенно для быстрого токсичности оценки новых химических веществ. Эта статья предусматривает новый пробирного высокой пропускной способностью, количественных скрининга червя фенотипы в пластине 384-ну автоматической идентификации и оценки токсичности химических. Этот assay идеально подходит для тестирования острой токсичности химических веществ в течение 24 часов, и он может быть применен к подострой токсичности, а также тестирования, когда больше времени точки данных собираются и источником питания (ОР50) поставляется для червей.
Средство, используемое для разбавления химических веществ может варьироваться; Мы выбрали K-средних в assay, ссылаясь на Софии др. 13. червей были культивировали в K-средних в группах лечения как химических, так и управления. Искусственные пресной воды решения или почвенного раствора с низкой ионной силы могут быть альтернативы K-средних.
Химические вещества с различными токсичность может изменить фенотипов C. elegans в различных моделей. Химические вещества, используемые в данном тесте были выбраны из третьей-шестой категории глобально согласованной системы классификации и маркировки химических веществ (СГС). C. elegans были подвергается воздействию химических веществ на шесть или более уровнях дозировки, которые охватывают диапазон дозировки 0% - 100% смертности. Для этих химических веществ с низкой растворимостью ДМСО рекомендуется содействовать химического растворения в воде. Как высокая концентрация ДМСО может повлиять на развитие червя и продолжительность жизни14, не более 0,2% ДМСО должны использоваться для водных испытаний.
Автоматически количественные характеристики показывают существенные различия между различными токсичность, который демонстрирует, что эти количественные фенотипов червей очень полезны в определении токсичности химических веществ. Он указал, что Фенотипическая профилирования показали сохранение функций для классификации и прогнозирования токсичность различных химических веществ, с использованием нематоды C. elegans как в естественных условиях модели организма.
США программа национального токсикологии (NTP) учредил Tox21 сообщество через меморандум о взаимопонимании с агентством по охране окружающей среды США (EPA) и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) химического геномики центром, теперь Национальный центр Выдвигаясь трансляционная наук (NCATS). Tox21 использует высокопроизводительного скрининга в пробирке и в естественных условиях альтернативные модели на животных тестирование для выявления механизмов токсичности, расставить химических веществ для тестирования дополнительных токсичности в естественных условиях и для разработки моделей прогнозирования реакции человека токсикологических. В рамках этих усилий C. elegans был использован для экрана ЕРА ToxCast этапа I и этапа II библиотек, которые содержат химические вещества, 292 и 676, соответственно, для химических веществ, ведущих к снизился для развития и роста личинок15. COPAS (сложный объект параметрический анализатор и сортировщик) платформа была также использована для червь токсикологические скрининг исследований2. Однако платформа COPAS только количественно несколько функций, таких как ширина червя, червя длину и интенсивности флуоресценции. Этот метод является улучшение нынешних методов с использованием червей для быстро prescreen токсичность новых химических веществ.
Существует несколько важных шагов в рамках протокола: червь культуры в 384-ну пластины, химической обработки, экспериментальной изображений и количественного определения фенотипа. По сравнению с традиционными токсичности методов оценки, этот протокол может подсчитать некоторые фенотипов червей, которые трудно рассчитать вручную и полезны для отражения токсичности каждого химического вещества, как червь моторики, ширина червь, размер червя и серый интенсивность. Очевидно этот assay высокой пропускной способностью для прогнозирования химическая токсичность будет ценным токсичности модель подход и могут быть использованы для биографии химических веществ до грызунов эксперименты на животных.
В целом этот метод открывает путь на быстрое токсичности оценки в различных областях. Исследователи могут применять метод чрезвычайных анализа токсичности пищевых токсикозов, оценки безопасности фармацевтических соединений, а также острой токсичности скрининг и обнаружения новых химических веществ и экологических внешних соединений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят CGC за любезно отправки C. elegans. Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Фонд национальной естественных наук Китая Грант (#31401025, #81273108, #81641184), столицы медицинских исследований и разработка специального проекта в Пекине (#2011-1013-03), открытие Фонда Пекин ключевых Лаборатория экологической токсикологии (# 2015HJDL03) и фонд естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2017BF041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
