Summary
एक मात्रात्मक विधि की पहचान करने के लिए और रसायनों की तीव्र विषाक्तता स्वचालित रूप से केनोरहब्डिटिस एलिगेंसकी लक्षणप्ररूपी रूपरेखा का विश्लेषण द्वारा विकसित किया गया है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक ३८४-well थाली में रसायनों के साथ कीड़े के इलाज के लिए, वीडियो पर कब्जा है, और विषाक्तता संबंधित phenotypes यों तो ।
Abstract
इस तरह के चूहों या चूहों के रूप में उच्च क्रम जीवों में रसायनों का विषाक्तता परीक्षण लागू करने, समय लेने वाली और महंगी है, उनकी लंबी उम्र और रखरखाव के मुद्दों के कारण. इसके विपरीत, सूत्रकृमि केनोराहैब्डिटिस एलीगेंस (सी. एलिगेंस) को यह विषाक्तता परीक्षण के लिए एक आदर्श विकल्प बनाने के लिए फायदे हैं: एक छोटी उम्र, आसान खेती, और कुशल प्रजनन । यहां, हम एक ३८४ में सी एलिगेंस की स्वत: लक्षणप्ररूपी रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-अच्छी तरह से थाली । सूत्रकृमि कीड़े तरल माध्यम और रासायनिक उपचार के साथ एक ३८४-वेल प्लेट में सुसंस्कृत हैं, और वीडियो एक अच्छी तरह से ३३ कृमि सुविधाओं पर रासायनिक प्रभाव यों तो करने के लिए ले रहे हैं । प्रयोगात्मक परिणाम दर्शाते हैं कि मात्रा निर्धारित phenotype सुविधाएँ वर्गीकृत कर सकते हैं और विभिन्न रासायनिक यौगिकों के लिए तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी और एक कृंतक मॉडल में आगे पारंपरिक रासायनिक विषाक्तता मूल्यांकन परीक्षणों के लिए एक प्राथमिकता सूची स्थापित.
Introduction
औद्योगिक उत्पादन और लोगों के दैनिक जीवन के लिए लागू रासायनिक यौगिकों के तेजी से विकास के साथ-साथ, यह रसायनों के लिए विषाक्तता परीक्षण मॉडल का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. कई मामलों में, रोडेंट पशु मॉडल स्वास्थ्य पर विभिन्न रसायनों की संभावित विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित है. सामान्य तौर पर, घातक सांद्रता का निर्धारण (यानी, विभिन्न रसायनों के असायद ५०% घातक खुराक [LD50]) को विवो में पारंपरिक पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, जो कि समय लेने वाला और बहुत महंगा है । इसके अलावा, के कारण कम, परिष्कृत, या (3r) सिद्धांत है कि पशु कल्याण और नैतिकता के लिए केंद्रीय है की जगह, नए तरीकों कि उच्च पशुओं के प्रतिस्थापन के लिए अनुमति वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए मूल्यवान है1,2,3 . C. एलिगेंस एक मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि है कि मिट्टी से अलग किया गया है. यह व्यापक रूप से अपनी लाभकारी विशेषताओं की वजह से प्रयोगशाला में एक अनुसंधान जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, जैसे एक छोटी उम्र, आसान खेती, और कुशल प्रजनन. इसके अलावा, सी. एलिगेंस में बुनियादी शारीरिक प्रक्रियाओं और तनाव प्रतिक्रियाओं सहित कई मौलिक जैविक रास्ते, उच्च स्तनधारियों में संरक्षित हैं4,5,6,7 , 8. तुलना के एक जोड़े में हम और दूसरों को बनाया है, वहां C. एलिगेंस विषाक्तता और विषाक्तता में मनाया के बीच एक अच्छा क़बूल है9कृंतकों । इस सब के सब है C. एलिगेंस एक अच्छा मॉडल vivo में रासायनिक toxicities के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए ।
हाल ही में, कुछ अध्ययनों सी एलिगेंसकी लक्षणप्ररूपी सुविधाओं मात्रा निर्धारित. सुविधाओं का उपयोग रसायनों के विषाक् ताओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है2,3,10 और कीड़े की उम्र11. हम यह भी एक तरीका है कि एक तरल कीड़ा संवर्धन प्रणाली और एक छवि विश्लेषण प्रणाली है, जिसमें कीड़े एक ३८४ में सुसंस्कृत अलग रासायनिक उपचार12के तहत अच्छी तरह से तैयार कर रहे है को जोड़ती है विकसित की है । यह मात्रात्मक तकनीक स्वचालित रूप से तरल माध्यम के साथ एक ३८४-अच्छी थाली में रासायनिक उपचार के 12-24h के बाद C. एलिगेंस के ३३ मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है । एक स्वचालित माइक्रोस्कोप चरण प्रयोगात्मक वीडियो अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है । वीडियो एक कस्टम डिजाइन कार्यक्रम द्वारा संसाधित कर रहे हैं, और ३३ ' कीड़े चलती व्यवहार से संबंधित सुविधाओं quantified हैं । विधि 10 यौगिकों के उपचार के तहत कृमि phenotypes यों तो करने के लिए प्रयोग किया जाता है । परिणाम बताते है कि विभिंन toxicities सी एलिगेंसके phenotypes बदल सकते हैं । इन मात्रा निर्धारित phenotypes की पहचान करने और विभिन्न रासायनिक यौगिकों की तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इस विधि का समग्र लक्ष्य एक तरल संस्कृति में C. एलिगेंस के साथ प्रयोगों के अवलोकन और लक्षणप्ररूपी प्रमाणन की सुविधा के लिए है. यह विधि रासायनिक विषाक्तता मूल्यांकन और phenotype क्वांटीकरण में सी. एलिगेंस के आवेदन के लिए उपयोगी है, जो विभिन्न रासायनिक यौगिकों की तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने और आगे के पारंपरिक के लिए एक प्राथमिकता सूची स्थापित करने में मदद करता है रासायनिक विषाक्तता एक कृंतक मॉडल में मूल्यांकन परीक्षण । इसके अलावा, इस विधि विषाक्तता स्क्रीनिंग और नए रसायनों या खाद्य additive एजेंट प्रदूषण के रूप में यौगिक का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है, फार्माऑक्सीटिकल यौगिकों, पर्यावरण exogenous यौगिक, और इतने पर.
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Protocol
प्रोटोकॉल चीन में रोग की रोकथाम और नियंत्रण के लिए बीजिंग केंद्र के पशु नैतिकता समिति के पशु देखभाल दिशानिर्देश इस प्रकार है ।
1. रासायनिक तैयारी
- रसायन (तालिका 1 और सामग्री की तालिका) प्राप्त करें ।
- १००% lethality (LC100, 24 एच) की एक ंयूनतम एकाग्रता के लिए व्यक्तिगत रसायनों के उच्चतम और ंयूनतम खुराक का निर्धारण और १००% nonlethality की एक अधिकतम एकाग्रता (LC0, 24 एच) कीड़े के लिए । सबसे अधिक एकाग्रता (तालिका 1) के कम से छह dilutions का प्रयोग करें ।
नोट: एक प्रारंभिक कृमि lethality परीक्षण9 एक नए रसायन के लिए LC100 और LC0 का पता लगाने के लिए, खुराक निर्धारित करने के लिए आचरण । - आवश्यक एकाग्रता 2x करने के लिए K-मध्यम (सामग्री की तालिका) के साथ प्रत्येक रासायनिक पतला । रसायन की वजह से phenotype परिवर्तन की तुलना करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कश्मीर माध्यम का उपयोग करें.
- उदाहरण के लिए, कैडमियम क्लोराइड (सीडीसीएल2) (तालिका 1) की 7 ढाल सांद्रता तैयार करें । 2x उच्चतम केंद्रित जलीय घोल (४.६४ मिलीग्राम/एमएल) तैयार करने के लिए, सीडीसीएल 2 के ९२.८ मिलीग्राम को1 मिलीलीटर में ठोस पाउडर के माध्यम से भंग करें और पाउडर पूरी तरह से घुल जाने के बाद 10 मिलीलीटर तक भरें । कश्मीर माध्यम के साथ कमजोर पड़ने से अन्य एकाग्रता के स्तर को तैयार.
- रासायनिक ढाल में हर एकाग्रता के लिए आठ समानांतर कुओं को तैयार करें । प्रत्येक अच्छी तरह से 2x रासायनिक समाधान के ५० μl शामिल हैं । नियंत्रण (तालिका 2) के रूप में K-मध्यम के आठ समानांतर कुओं के कम से तीन समूहों को तैयार करें ।
नोट: संक्षेप में, 2x कार्य समाधान के ५०० μl की एक मात्रा प्रत्येक रसायन की एक खुराक के लिए आवश्यक है ।
2. कृमि तैयारी
- कैनोरहब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से जंगली प्रकार के N2 कीड़े और एस्चेरीच्या कोलाई OP50 खिंचाव प्राप्त करें ।
- सिंक्रनाइज़ किए गए L4 वर्म प्राप्त करें ।
- लकीर की थाली से ई. कोलाई OP50 की एक एकल कॉलोनी उठाओ । इस कॉलोनी को पौंड शोरबा के १०० मिलीलीटर में तैयार करना और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकसित करना ।
नोट: ई. कोलाई OP50 समाधान अब सूत्रकृमि विकास मध्यम (एनजीएम, सामग्री तालिका) प्लेटों को बोने के लिए तैयार है । - एक ९० मिमी प्लास्टिक पेट्री प्लेट में एनजीएम डालो । ई. कोलाई OP50 समाधान के ३०० μl के साथ प्रत्येक थाली बीज डालने के बाद दिन । एनजीएम प्लेटों पर OP50 के साथ 2-3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक N2 कीड़े के अधिकांश कीड़े वयस्क अवस्था तक पहुंच चुके हैं ।
- स्टेरिल एच2ओ के साथ एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंकु अपकेंद्रीज ट्यूब में फसल अंडपूर्ण कीड़े । कीड़े के लिए नीचे बसने दो कम से 2 मिनट, महाप्राण एच2ओ, और ब्लीच बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें (सामग्री की तालिका).
- भंवर 5 मिनट के लिए ट्यूब, 30 एस के लिए ट्यूब स्पिन (१,३०० एक्स जी) के लिए अंडे गोली, और supernatant त्यागें ।
- एच2ओ के 5 मिलीलीटर और भंवर के साथ अंडे धोने 5 एस के लिए ट्यूब (१,३०० एक्स जीपर) 30 एस के लिए ट्यूब अपकेंद्री, supernatant निकालें, और फिर से धो लें ।
- OP50 के साथ एक नई एनजीएम प्लेट पर अंडे पिपेट । उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं । अगली सुबह रची L1 कीड़े की निगरानी; कीड़े लगभग ४० एच में L4 मंच तक पहुंच जाएगा ।
- लकीर की थाली से ई. कोलाई OP50 की एक एकल कॉलोनी उठाओ । इस कॉलोनी को पौंड शोरबा के १०० मिलीलीटर में तैयार करना और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकसित करना ।
- ९० मिमी पेट्री प्लेट्स को K-मीडियम से ५० मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब में बंद कर L4 कीड़े धोएं । एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत K-मध्यम के १०० μl प्रति ~ ४० पशुओं के लिए कीड़े की एकाग्रता को समायोजित करें । ३८४-अच्छी थाली के प्रत्येक कुआं में ५० μl (~ 20 कीड़े) जोड़ें । ये सिंक्रनाइज़ कीड़े (L4 स्टेज) रसायनों द्वारा निम्नलिखित उपचार के लिए तैयार हैं ।
3. रासायनिक उपचार और वीडियो कैप्चर
नोट: एक ३८४-अच्छी थाली में, कीड़े (एक अच्छी तरह से ५० μl) एक व्यक्ति रासायनिक (तालिका 1) के छह से सात खुराकों के लिए इलाज कर रहे हैं । आठ समानांतर कुओं तैयार, प्रत्येक प्रत्येक खुराक के लिए 2x रासायनिक समाधान के ५० μl युक्त (आठ कुओं एक ही रासायनिक और एक ही एकाग्रता के साथ भर रहे हैं, तालिका 2). सभी वीडियो एक डिजिटल एक औंधा माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) से जुड़े कैमरे का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं । रासायनिक उपचार प्रयोग 24 एच के लिए रहता है । 24 एच रासायनिक उपचार प्रयोग के दौरान एक अच्छी तरह से बैक्टीरियल भोजन न जोड़ें ।
- रसायनों को जोड़ने से पहले, स्वचालित मंच पर सिंक्रनाइज़ कीड़े के साथ ३८४-अच्छी थाली सेट और क्रमादेशित अधिग्रहण प्रक्रिया के साथ एक अच्छी तरह से प्रत्येक के वीडियो ले (7 फ्रेम प्रति सेकंड के लिए 2 s; यह लेता है ~ 25 प्रत्येक थाली स्कैन करने के लिए मिनट).
- एक अच्छी तरह से (तालिका 2) के लिए धारा 1 के अनुसार तैयार 2x रासायनिक स्टॉक के ५० μl जोड़ें । 0 h बिंदु के रूप में समय सेट करें ।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर ३८४-वेल प्लेट को सेते हैं और इसे ८० आरपीएम पर एक इनकुबेटर शेखर में मिलाते हैं ।
- इनकोबेटर से प्लेट निकालें और इसे एक ऑटोमैटिक स्टेज पर ट्रांसफर करें । पूरे थाली के प्रत्येक कुआं के वीडियो ले लो, 12 एच में और 24 एच पर, कश्मीर में प्रत्येक विशिष्ट रासायनिक उपचार के लिए कीड़े के phenotypes की जांच करने के लिए मध्यम । लगभग 25 मिनट एक थाली स्क्रीन के लिए आवश्यक हैं ।
4. प्रयोग वीडियो प्रसंस्करण
नोट: प्रयोगात्मक वीडियो और छवियों प्रसंस्करण के लिए एक कार्यक्रम लिखा और पैक किया गया था । यह स्वतंत्र रूप से डाउनलोड किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें). प्रयोगात्मक वीडियो एक छवि फ्रेम अनुक्रम के रूप में संग्रहीत किया जाता है, और प्रत्येक वीडियो के फ्रेम अनुक्रम एक विशिष्ट निर्देशिका में संग्रहीत किया जाता है । कार्यक्रम कीड़े को पहचान सकते हैं और phenotypes स्वचालित रूप से यों तो.
- ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI, चित्र 1) में, पैरामीटर्स, जैसे फ़्रेम अनुक्रम निर्देशिका, आउटपुट निर्देशिका, वर्म आकार पैरामीटर, और आंदोलन थ्रेशोल्ड पैरामीटर जोड़ें । प्रयोगात्मक छवियों को संसाधित करने के लिए विश्लेषण बटन पर क्लिक करें ।
- स्रोत छवियां निर्देशिका चुनने के लिए चुनें बटन क्लिक करें ।
- इंटरफ़ेस में मध्य परिणाम निर्देशिका जोड़ें ।
नोट: मध्य परिणामों में सेगमेंट की छवियां शामिल होती हैं. इन मध्य परिणाम प्रसंस्कृत छवियों के दृश्य अवलोकन के लिए उपयोगी होते हैं । - इंटरफ़ेस में अंतिम परिणाम निर्देशिका जोड़ें ।
- इंटरफ़ेस में वर्म आकार पाठ बॉक्स में औसत वर्म आकार पैरामीटर जोड़ें ।
नोट: प्रयोगों में उपयोग किया गया आकार पैरामीटर २,००० है । - इंटरफ़ेस में स्थानांतरित अनुपात की थ्रेशोल्ड जोड़ें ।
नोट: प्रयोगों में उपयोग किया गया अनुपात ०.९३ है । - क्लिक करें विश्लेषण बटन छवि प्रसंस्करण शुरू करने के लिए । जोड़े गए पैरामीटर्स को साफ़ करने के लिए रीसेट बटन क्लिक करें ।
नोट: कीड़े के लिए परिभाषित और मात्रा निर्धारित ३३ विशेषताएं हैं. सभी परिभाषित phenotypes श्रेणियों के आधार पर क्रमबद्ध हैं ( तालिका 3में सूचीबद्ध). इन सुविधाओं प्रयोगात्मक छवियों से मात्रा निर्धारित जा सकता है । विभिन्न रसायनों के बीच एक मात्रात्मक तुलना, जो विभिन्न toxicities है, इन सुविधाओं की तुलना द्वारा किया जा सकता है.
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Representative Results
हम 10 से अधिक रसायनों12के विभिंन सांद्रता को उजागर कीड़े के phenotypes परीक्षण किया है । परीक्षण में, ३३ अलग विशेषताएं तीन समय अंक (0 एच, 12 एच, और 24 एच) में प्रत्येक रासायनिक यौगिक के लिए मात्रा निर्धारित थे । पहले, एक मैनुअल और एक उंर परख के एक स्वत: विश्लेषण के बीच एक तुलना11,12किया गया था । इस परख में, हमने पाया कि रसायन और सांद्रता कृमि phenotypes को प्रभावित कर सकते हैं । इस विधि का एक ओवरव्यू चित्रा 2में दिखाया गया है ।
परिणाम (चित्रा 3 और चित्रा 4सी, डी) से पता चला कि कीड़े जल्दी मर गया के रूप में रासायनिक एकाग्रता में वृद्धि हुई । उच्च सांद्रता पर, कीड़े straighter बन गया है और कम सांद्रता या नियंत्रण समूहों में (चित्रा 3 और चित्रा 4बी) से अधिक घुमावदार । प्रारंभ में (0 h पर), नियंत्रण (K-मध्यम) और सभी phenotypes के लिए रासायनिक उपचार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था । एक दिए गए रासायनिक खुराक के साथ उपचार के 12 ज के बाद, कीड़े के phenotypes नियंत्रण और विभिन्न एकाग्रता समूहों के बीच मतभेद के विभिन्न डिग्री दिखाया. उदाहरण के लिए, प्रमुख अक्ष लंबाई वृद्धि हुई समय के रूप में वृद्धि हुई है । वहां भी कम से उच्च रासायनिक सांद्रता के लिए एक ढाल प्रवृत्ति है । विभिंन रासायनिक सांद्रता की ढाल प्रवृत्ति भी मामूली धुरी लंबाई में महत्वपूर्ण था (चित्रा 4ए, बी) ।
इस परख में, कीड़ा गतिशीलता दो मायनों में गणना की गई थी क्षेत्र कृमि में चले गए और गतिशीलता अनुपात (चित्रा 4सी, डी) पर आधारित है । दोनों तरीकों से गतिशीलता परिणाम समान पैटर्न दिखाया । शुरुआत में विभिन्न सांद्रता और नियंत्रण समूहों के बीच कीड़ा गतिशीलता के कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे (0 एच समय बिंदु पर) । जैसे-जैसे समय बीत रहा था, नियंत्रण समूहों में कीड़े ने गतिशीलता में एक स्थिर कमी दिखाई । 12 एच में, कीड़े है कि विभिंन सांद्रता पर रासायनिक उपचार के नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में गतिशीलता में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया गया । इसके अलावा, उच्च एकाग्रता उपचार के तहत कीड़े कम एकाग्रता उपचार के तहत कीड़े की तुलना में कमजोर गतिशीलता दिखाया । यह इंगित करता है कि उच्च एकाग्रता उपचार के तहत कीड़े कम गतिशील हो गया और जल्दी मर गया (चित्रा 4सी, डी). इन परिणामों का सुझाव है कि डिजाइन विधि रासायनिक विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी है, और सी एलिगेंस के मात्रा निर्धारित phenotypes रासायनिक विषाक्तता की पहचान के लिए उपयोगी मार्कर हैं.
चित्रा 1 : सॉफ्टवेयर का इंटरफेस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2 : केनोरहब्डिटिस एलिगेंसकी स्वचालित लक्षणप्ररूपी रूपरेखा द्वारा रासायनिक विषाक्तता की भविष्यवाणी के लिए एक उच्च थ्रूपुट पाइप लाइन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3 : ४.६४ मिलीग्राम/एमएल cdcl2 (ऊपरी पैनल) के तहत कीड़े की प्रयोगात्मक छवियों, ०.४६४ मिलीग्राम/एमएल cdcl2 (मध्य पैनल), और कश्मीर मध्यम (नीचे पैनल), अलग समय बिंदुओं पर । छवियों रासायनिक उपचार के तहत कीड़े की स्थिति में परिवर्तन या एक प्रतिनिधि अच्छी तरह से समय भर में ३८४-अच्छी थाली में एक नियंत्रण समूह में दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 4 : सीडीसीएल2के विभिंन सांद्रता के तहत कीड़े की मात्रा निर्धारित विशेषताएं । (क) मात्रा निर्धारित प्रमुख अक्ष लंबाई । (इ) मात्राकृत लघु अक्ष लंबाई । (ग) स्थानांतरित क्षेत्र द्वारा मात्राकृत गतिशीलता । (घ) स्थानांतरित क्षेत्र/वर्म आकार द्वारा मात्राकृत गतिशीलता । बार भूखंडों एकल कीड़े पर प्रत्येक सुविधा के लिए औसत परिमाणन दिखा. त्रुटि पट्टियां ± मानक विचलन (SD) को निरूपित करती हैं । एकाग्रता इकाई = मिलीग्राम/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
तालिका 1:३८४-वेल-प्लेट के लिए 10 रसायनों का एक्सपोजर एकाग्रता C. एलीगेंस एक्यूट विषाक्तता परीक्षण ।
तालिका 2:३८४-well प्लेट लेआउट का एक योजनाबद्ध ।
तालिका 3: कीड़े के परिभाषित phenotypes ।
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Discussion
C. एलिगेंस के फायदे9विष विज्ञान में अपनी बढ़ती उपयोग करने के लिए नेतृत्व किया है, दोनों यंत्रवत अध्ययन और उच्च throughput स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए. विष विज्ञान अनुसंधान में अन्य मॉडल प्रणालियों के पूरक में सी एलिगेंस के लिए एक वृद्धि की भूमिका हाल के वर्षों में उल्लेखनीय है, विशेष रूप से तेजी से विषाक्तता नए रसायनों के आकलन के लिए. यह आलेख उच्च-थ्रूपुट की एक नई परख प्रदान करता है, स्वचालित पहचान और रासायनिक विषाक्तता के आकलन के लिए एक ३८४-वेल प्लेट में कृमि phenotypes की मात्रात्मक स्क्रीनिंग । इस परख के भीतर रसायन के तीव्र विषाक्तता परीक्षण के लिए आदर्श है 24 ज, और यह अर्धजीर्ण विषाक्तता परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से जब डेटा के अधिक समय अंक एकत्र कर रहे है और खाद्य स्रोत (OP50) कीड़े के लिए आपूर्ति की है ।
रसायनों को पतला करने के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम भिन्न हो सकता है; हम sofie एट अल का जिक्र करके परख में कश्मीर मध्यम चुनाहै । 13. कीड़े दोनों नियंत्रण और रासायनिक उपचार समूहों में कश्मीर में सुसंस्कृत थे । एक कृत्रिम मीठे पानी समाधान या कम आयनिक शक्ति के साथ एक मिट्टी समाधान कश्मीर के लिए विकल्प हो सकता है मध्यम ।
विभिन्न toxicities के साथ रसायन विभिन्न पैटर्न में सी एलिगेंस के phenotypes बदल सकते हैं. इस परीक्षण में प्रयुक्त रसायनों को वर्गीकरण और रसायनों के लेबलिंग के वैश्विक रूप से समन्वित प्रणाली के तीसरे से छठी श्रेणियों (GHS) से चुना गया । C. एलिगेंस छह या अधिक खुराक के स्तर पर रसायनों को उजागर किया गया, जो 0%-१००% मृत्यु दर खुराक रेंज कवर. कम पानी घुलनशीलता के साथ उन रसायनों के लिए, dmso पानी में रासायनिक विघटन को बढ़ावा देने के लिए सिफारिश की है । dmso के एक उच्च एकाग्रता के रूप में कृमि विकास को प्रभावित कर सकते है और उंर14, नहीं ०.२% से अधिक dmso जलीय परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
स्वचालित रूप से मात्रा निर्धारित सुविधाओं विभिन्न toxicities, जो यह दर्शाता है कि कीड़े के इन मात्रा निर्धारित phenotypes रसायनों की विषाक्तता की पहचान करने में बहुत उपयोगी होते हैं के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखा. यह संकेत दिया कि लक्षणप्ररूपी रूपरेखा वर्गीकृत करने के लिए कार्यों का पता चला और विभिन्न रसायनों की विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए एक विवो मॉडल जीव में एक के रूप में सूत्रकृमि सी एलिगेंस .
अमेरिका के राष्ट्रीय toxicology कार्यक्रम (ntp) अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (EPA) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (nih) रासायनिक जीनोमिक्स केंद्र के साथ एक समझौता ज्ञापन के माध्यम से Tox21 समुदाय की स्थापना की, अब के लिए राष्ट्रीय केंद्र translational विज्ञान (ncats) को आगे बढ़ाना । Tox21 विट्रो स्क्रीनिंग में और vivo वैकल्पिक पशु मॉडल परीक्षण में उच्च throughput का उपयोग करता है विषाक्तता के तंत्र की पहचान करने के लिए, vivo विषाक्तता परीक्षण में अतिरिक्त के लिए रसायनों को प्राथमिकता, और मानव विषाक्तता प्रतिक्रियाओं के भविष्य कहनेवाला मॉडल विकसित करने के लिए । उस प्रयास के भाग के रूप में, C. एलिगेंस को EPA के toxcast चरण मैं और द्वितीय चरण पुस्तकालयों, जो २९२ और ६७६ रसायनों होते है स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के लिए अग्रणी रसायनों के लिए प्रमुख कम लार्वा विकास और वृद्धि15। copas (जटिल वस्तु पैरामीट्रिक विश्लेषक और सॉर्टर) मंच भी कृमि विषाक्तता स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है2. हालांकि, copas मंच केवल कुछ सुविधाओं, जैसे कृमि चौड़ाई, कृमि लंबाई, और प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में quantifies । यह विधि वर्तमान तरीकों के लिए एक सुधार है कीड़े का उपयोग करने के लिए तेजी से नए रसायनों की विषाक्तता prescreen ।
वहां प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं: एक ३८४ में कीड़ा संस्कृति-अच्छी तरह से थाली, रासायनिक उपचार, प्रयोगात्मक छवि पर कब्जा है, और phenotype प्रमाणन । पारंपरिक विषाक्तता मूल्यांकन विधियों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल कीड़े के कुछ phenotypes कि मैन्युअल रूप से गणना करने के लिए मुश्किल हो सकता है और हर रासायनिक जैसे कृमि गतिशीलता, कृमि चौड़ाई, कृमि आकार, और ग्रे के toxicities को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं तीव्रता. जाहिर है, रासायनिक विषाक्तता की भविष्यवाणी के लिए यह उच्च throughput परख एक मूल्यवान विषाक्तता मॉडल दृष्टिकोण होगा और कृंतक पशु प्रयोगों से पहले रसायनों के prescreening के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
संक्षेप में, इस तकनीक के कई क्षेत्रों में तेजी से विषाक्तता आकलन पर एक रास्ता प्रशस्त । शोधकर्ताओं ने खाद्य पदार्थों में विषाक्तता के आपातकालीन विश्लेषण करने के लिए विधि लागू कर सकता है विषाक्त पदार्थ, दवा यौगिकों की सुरक्षा मूल्यांकन, साथ ही तीव्र विषाक्तता स्क्रीनिंग और नए रसायनों और पर्यावरणीय exogenous यौगिकों का पता लगाने.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक कृपया C. elegans भेजने के लिए cgc धंयवाद । यह काम चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) द्वारा समर्थित था; चीन अनुदान की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (#31401025, #81273108, #81641184), राजधानी स्वास्थ्य अनुसंधान और बीजिंग में विशेष परियोजना के विकास (#2011-1013-03), पर्यावरण विष विज्ञान की बीजिंग कुंजी प्रयोगशाला के उद्घाटन कोष (# 2015hjdl03), और शांदोंग प्रांत, चीन (ZR2017BF041) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
