Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019 doi: 10.3791/59082
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,4, 1,4, 1,4, 5, 5, 1, 3, 3, 1,4
1Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Center for Disease Prevention and Control/Beijing Center of Preventive Medicine Research, China, 2College of Computer Science and Technology, Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences), China, 3Key Laboratory of Computational Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Collaborative Innovation Center for Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences-Max Planck Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, China, 4Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology, School of Public Health, Capital Medical University, China, 5School of Life Sciences, La Trobe University, Australia
* These authors contributed equally

Summary

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

Abstract

החלת בדיקות רעילות של כימיקלים עילאיים הסדר, כגון עכברים או חולדות, היא גוזלת זמן יקר, בשל תוחלת החיים הארוכה שלהם בעיות תחזוקה. להיפך, תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) יש יתרונות כדי שזה הבחירה האידיאלית לבדיקת רעילות: אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור אוטומטית פנוטיפי בניית פרופיל של C. elegans בצלחת 384-. טוב. תולעים נמטודות בתרבית בצלחת 384-טוב עם טיפול כימי ובינוניות נוזלי, קטעי וידאו נלקחים כל הבאר כדי לכמת את ההשפעה הכימית על תכונות תולעת 33. תוצאות ניסויית מדגימים כי התכונות פנוטיפ כימות ניתן לסווג לחזות רעילות חריפה על תרכובות כימיות שונות, ליצור רשימה עדיפות לבדיקות רעילות כימית מסורתי הערכת במודל של מכרסמים.

Introduction

עם התפתחות מהירה של תרכובות כימיות שהוחלה על הייצור התעשייתי ועל חיי היומיום של אנשים, חשוב ללמוד רעילות בדיקת מודלים כימיקלים. במקרים רבים, המודל החייתי מכרסמים הוא מועסק כדי להעריך את פוטנציאל רעילות של כימיקלים שונים על הבריאות. באופן כללי, הקביעה של ריכוזים קטלני (קרי, assayed 50% מנה קטלנית [LD50] של כימיקלים שונים) משמש כפרמטר מסורתי במודל מכרסם (עכברוש/עכבר) אין ויוו, וזה זמן רב ויקר מאוד. בנוסף, בשל הקטן, לחדד, או להחליף את העיקרון (3R) היא מרכזית בעלי חיים רווחה, אתיקה מקצועית, שיטות חדשות המאפשרות עבור ההחלפה של בעלי חיים גבוהים יותר הם בעלי ערך מחקר מדעי-1,-2,-3 . C. elegans הוא תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי אשר היה מבודד מן הקרקע. זה כבר בשימוש נרחב כאורגניזם מחקר במעבדה בשל מאפייניו מועילים, כגון אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. בנוסף, הרבה מסלולים ביולוגיים בסיסיים, כולל תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים ותגובות הלחץ ב- C. elegans, נשמרים ב-6,5,4,יונקים גבוהה יותר7 , 8. כמה השוואות אנחנו ואחרים עשו, יש הקונקורדנציה טוב בין C. elegans רעילות רעילות שנצפתה מכרסמים9. כל זה הופך את C. elegans מודל טוב כדי לבדוק את השפעות רעילות כימית ויוו.

לאחרונה, מחקרים לכמת את התכונות פנוטיפי של C. elegans. התכונות ניתן לנתח את רעילות של כימיקלים2,3,10 , הזדקנות תולעים11. גם פיתחנו שיטה המשלבת תולעת נוזלי culturing מערכת, מערכת ניתוח התמונה, שבה התולעים הם בתרבית בצלחת 384-ובכן תחת טיפולים כימיים שונים12. טכניקה זו כמותיים פותחה לנתח באופן אוטומטי את הפרמטרים 33 של C. elegans לאחר 12-24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384-ובכן עם המדיום הנוזלי. שלב במיקרוסקופ אוטומטי משמש עבור רכישת וידאו ניסיוני. קטעי וידאו מעובדות על-ידי תוכנית אישית מעוצבת, 33 תכונות הקשורות להתנהגות נע של התולעים הם לכמת. השיטה משמשת כדי לכמת את התולעת פנוטיפים תחת הטיפול של תרכובות 10. התוצאות מציגות כי רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans. אלה פנוטיפים כימות יכול לשמש כדי לזהות ולחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל על תצפיות ועל כימות פנוטיפי של ניסויים עם C. elegans בתרבות נוזלי. שיטה זו שימושית עבור היישום של C. elegans הערכות רעילות כימית, פנוטיפ quantifications, אשר מסייעים לחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות וליצור רשימת סדר העדיפויות עבור עוד יותר מסורתי בדיקות הערכת כמות רעילה במודל של מכרסמים. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם רעילות הקרנת ובדיקות של כימיקלים חדשים או המתחם ' זיהום הסוכן כתוסף מזון, תרכובות pharmacautical, סביבה אקסוגניים המתחם, וכן הלאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה חיה במרכז בייג'ינג למניעת מחלות ובקרה בסין.

1. הכנה כימי

  1. להשיג כימיקלים (טבלה 1 ו לטבלה של חומרים).
  2. לקבוע את המינון הגבוהים והנמוכים ביותר של כימיקלים בודדים ריכוז מינימלי של 100% הקטלניות (LC100, 24 שעות ביממה) ריכוז מרבי של 100% nonlethality (LC0, 24 שעות ביממה) כדי תולעים. השתמש דילולים לפחות שישה של הריכוז הגבוה ביותר (טבלה 1).
    הערה: לנהל את התולעת ראשוני lethality מבחן9 לחקור את LC100 ואת LC0 עבור כימי חדש, כדי לקבוע את המינון.
  3. לדלל כל כימית עם K-בינוני (טבלה של חומרים) 2 x הריכוז הדרוש. להשתמש K-בינוני כפקד כדי להשוות את השינוי פנוטיפ הנגרמת על ידי הכימיקלים.
    1. לדוגמה, להכין 7 הדרגתיות ריכוזי כלוריד קדמיום (CdCl2) (טבלה 1). להכין 2 x הפתרון מימית מרוכז הגבוהה (4.64 mg/mL), לפזר 92.8 מ ג של אבקת מוצק2 CdCl ב 8 מ ל K-בינוני ומלא עד 10 מ"ל לאחר האבקה פיזר באופן מלא. הכן את רמות ריכוז אחרים על ידי דילול עם K-בינוני.
  4. היכונו שמונה בארות מקבילים בכל ריכוז במעבר הצבע הכימי. כל טוב מכיל 50 µL של 2 x פתרון כימי. להכין לפחות שלוש קבוצות של שמונה בארות מקבילים של K-בינוני כפקדי (טבלה 2).
    הערה: בקצרה, נפח של 500 µL של 2 x הפתרון עובד הוא הכרחי עבור מנה אחת של כל חומר כימי.

2. תולעת הכנה

  1. להשיג פראי-סוג N2 תולעים וללחצים OP50 Escherichia coli מן מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC).
  2. להשיג תולעים L4 מסונכרן.
    1. לבחור מושבה בודדת של e. coli OP50 מהצלחת פס. גילוח ורחיצה כירורגית לחסן את המושבה ב- 100 מ ל מרק ליברות, לגדל את זה בן לילה ב 37 º C.
      הערה: הפתרון OP50 e. coli והיא עכשיו מוכנה זריעה ללוחות נמטודות צמיחה בינוני (NGM, טבלה של חומרים).
    2. שופכים NGM לתוך פלסטיק 90 מ מ צלחת פטרי. זרע בכל צלחת עם 300 µL של e. coli OP50 פתרון היום לאחר שמזג. דגירה N2 תולעים על לוחות NGM עם OP50 ב 20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים עד רוב התולעים הגיעו לשלב למבוגרים.
    3. קציר תולעים gravid לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל עם סטרילי H2O. תעזוב את התולעים להשתקע למשך לפחות 2 דקות, וארוקן את H2O ולהוסיף 5 מ של מאגר אקונומיקה (טבלה של חומרים).
    4. מערבולת הצינור במשך 5 דקות, לסובב את הצינור ב-30 s (ב x 1300 גרם) כדי הצניפה הביצים, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    5. לרחוץ הביצים עם 5 מיליליטר סטרילי H2O ו מערבולת הצינור עבור צנטריפוגה ס' 5 הצינור 30 s (ב x 1300 גרם), הסר תגובת שיקוע של לשטוף שוב.
    6. פיפטה הביצים אל NGM חדש צלחת עם OP50. דגירה אותם ב- 20 ° C. לנטר את התולעים L1 המקווקו בבוקר שלמחרת; התולעים יגיע השלב L4 כ 40 h.
  3. לשטוף את התולעים L4 את צלחות פטרי 90 מ מ עם K-בינוני לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ. התאם את הריכוז של תולעים חיות ~ 40 לכל 100 µL של K-בינוני תחת stereomicroscope. להוסיף 50 µL (~ 20 תולעים) לבאר כל צלחת 384-. טוב. תולעים אלה מסונכרן (שלב L4) מוכנים לטיפול הבא על ידי כימיקלים.

3. טיפול כימי ואת לכידת וידאו

הערה: בצלחת 384-ובכן, תולעים (50 µL היטב כל) מטופלים עד שישה עד שבעה במינונים של חומר כימי בודדים (טבלה 1). להכין שמונה וולס מקבילים, שכל אחד מהם מכיל 50 µL של 2 x כימי פתרון עבור מדי מינון (בארות שמונה מלאים עם זהה כימית, ריכוז זהה, בטבלה 2). כל קטעי הווידאו נאספים באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברים במיקרוסקופ הפוכה (טבלה של חומרים). הניסוי טיפול כימי נמשך 24 שעות ביממה. אל תוסיף חיידקי מזון מכל קידוח במהלך הניסוי טיפול כימי 24 שעות ביממה.

  1. לפני הוספת הכימיקלים, הגדר את הצלחת 384-ובכן עם התולעים מסונכרן על הבמה אוטומטי ולקחת קטעי וידאו של כל טוב עם ההליך רכישה מתוכנת (7 מסגרות לשנייה עבור 2 s; שנדרש ~ 25 דקות לסרוק כל צלחת).
  2. להוסיף 50 µL של 2 x מניות כימי שהוכנו לפי סעיף 1 עבור כל טוב (טבלה 2). לקבוע את הזמן כנקודת 0 h.
  3. דגירה לצלחת 384-ובכן-20 ° C, נוצצים סל ד 80 ב שייקר אינקובטור.
  4. הסר את הלוחית של החממה, להעביר אותו שלב אוטומטי. קח קטעי וידאו של כל טוב של צלחת מלאה, ב- 12 h וב -24 שעות ביממה, כדי לבדוק על הפנוטיפים של התולעים עבור כל טיפול כימי מסוים ב- K-בינוני. כ 25 דקות נדרשות עבור מסך לוח אחד.

4. ניסוי עיבוד וידאו

הערה: תוכנית ניסויית וידאו ותמונות לעיבוד היה נכתב, ארוז. ניתן באופן חופשי להוריד (ראה טבלה של חומרים). וידאו ניסיוני מאוחסן בצורה של רצף מסגרות תמונות, רצף מסגרות וידאו מאוחסן בספריה מסוימת. התוכנית ניתן לזהות תולעים, לכמת פנוטיפים באופן אוטומטי.

  1. ממשק משתמש גרפי (GUI, איור 1), הוסף את הפרמטרים, כגון ספריית רצף מסגרות, את ספריית הפלט, הפרמטר גודל התולעת הפרמטר סף תנועה. לחץ על כפתור ניתוח תהליך תמונות ניסיוני.
    1. לחץ על הלחצן ' בחר ' כדי לבחור ספריית תמונות.
    2. הוסף את הספריה תוצאה האמצעי בממשק.
      הערה: תוצאות הביניים לכלול תמונות מקוטע. תוצאות הביניים אלה שימושיים. התצפית הויזואלית של תמונות מעובד.
    3. להוסיף את ספריית התוצאה הסופית בממשק.
    4. להוסיף את הפרמטר הגודל הממוצע תולעת בתיבת הטקסט של תולעת בגודל בממשק.
      הערה: הפרמטר הגודל המשמשים את הניסויים הוא 2,000.
    5. הוסף את הסף של יחס שהועברו בממשק.
      הערה: היחס שימוש בניסויים הוא 0.93.
    6. לחץ על כפתור ניתוח כדי להפעיל את העיבוד תמונה. לחץ על לחצן ' איפוס ' כדי לנקות את הפרמטרים הוסיף.
      הערה: קיימות תכונות 33 מוגדרת והיא לכמת לתולעים. כל הפנוטיפים מוגדר ממוינים לפי קטגוריות (המופיעה בטבלה 3). ניתן לכמת תכונות אלה מתמונות ניסיוני. השוואה כמותית בין כימיקלים שונים, אשר יש רעילות שונות, יכול להיעשות על-ידי השוואת תכונות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדקנו על הפנוטיפים של תולעים נחשפים ריכוזים שונים של כימיקלים יותר מ- 1012. במבחן, 33 תכונות שונות היו לכמת עבור כל תרכובת שלוש נקודות זמן (או 12 שעות, 24 שעות ביממה). בעבר, נעשתה השוואה בין מדריך ניתוח אוטומטי של assay תוחלת החיים11,12. זה assay, מצאנו כי כימיקלים וריכוזי יכול להשפיע על הפנוטיפים תולעת. סקירה כללית של שיטה זו מוצגת באיור2.

התוצאות (איור 3 ו- 4 איורc, d) הראו כי התולעים מתו כמה ריכוז כימי גדל מהר. בריכוזים גבוהים, התולעים הפך ישר וחלק פחות מעוגלים יותר בריכוזים נמוכים או בקבוצות הבקרה (איור 3 ו- 4 באיורb). בהתחלה (-0 h), היה הבדל משמעותי בין טיפולים כימיים עבור פנוטיפים כל שליטה (K-בינוני). לאחר 12 שעות של טיפול עם מינון כימיקלים נתון, הפנוטיפים של תולעים הראה דרגות שונות של הבדלים בין שליטה וקבוצות ריכוז שונים. לדוגמה, אורך ציר מרכזי גדל ככל שהזמן גדל. יש גם מגמה של מעבר צבע מ נמוך ריכוזי כימית גבוהה יותר. המגמה הדרגתי של ריכוזים כימי שונים היה גם משמעותית אורך ציר מינור (איור 4א, ב).

ב הזה assay, תנועתיות של התולעת מחושב בשתי דרכים, בהתבסס על האזור התולעת עבר ועל היחס תנועתיות (איור 4c, d). תוצאות תנועתיות בשתי הדרכים הראה דפוסים דומים. היו אין הבדלים משמעותיים של תנועתיות תולעת בין ריכוזים שונים וקבוצות שליטה בהתחלה (בנקודת הזמן 0 h). ככל שחלף הזמן, התולעים קבוצות שליטה הראה אורווה ירידה תנועתיות. ב. ה' 12, התולעים שעברו טיפולים כימיים בריכוזים שונים הראו הבדלים משמעותיים תנועתיות לעומת קבוצות שליטה. בנוסף, התולעים תחת טיפולי ריכוז גבוה יותר הראה תנועתיות חלשה לעומת התולעים תחת טיפולי ריכוז נמוך יותר. אפשרות זו מציינת כי תולעים תחת טיפולי ריכוז גבוה יותר הפך פחות תאי ומת מהר יותר (איור 4c, d). תוצאות אלו מראים כי השיטה מעוצב הוא שימושי עבור הערכות רעילות כימית, הפנוטיפים כימות של C. elegans הם סימנים שימושי לזיהוי רעילה.

Figure 1
איור 1 : הממשק של התוכנה- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הצינור של וזמינותו תפוקה גבוהה לחיזוי רעילות כימית על-ידי פרופיל פנוטיפי אוטומטיות של Caenorhabditis elegans. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תמונות ניסיוני של תולעים מתחת 4.64 מ"ג/מ"ל CdCl2 (החלונית העליונה), 0.464 מ"ג/מ"ל CdCl2 (לוח באמצע) ו- K-בינוני (פאנל התחתונה), בנקודות זמן שונות. הדימויים מציגים את שינויי מצב של תולעים תחת טיפול כימי או קבוצת ביקורת טוב נציג אחד של הלוח 384-טוב לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : התכונות כימות של תולעים מתחת ריכוזים שונים של CdCl2- () אורך ציר מרכזי כימות. (b) אורך ציר קטין כימות. (ג) תנועתיות כימות מאת עבר האזור. (ד) תנועתיות כימות מאת ועבר גודל אזור/תולעת. הבר חלקות להציג כימות הממוצע עבור כל תכונה על תולעים יחיד. קווי השגיאה מציינות ± סטיית התקן (SD). יחידת ריכוז = mg/mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: חשיפה ריכוז של כימיקלים 10 384-ובכן-הצלחת C. elegans רעילות חריפה קוסמטי

Table 2
טבלה 2: סכימטי של הפריסה צלחת 384-. טוב.

Table 3
טבלה 3: מוגדר פנוטיפים של תולעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרונות של C. elegans הובילו השימוש הגובר הרעלים9, הן עבור מחקרים מכניסטית וגישות ההקרנה תפוקה גבוהה. תפקיד מוגבר עבור C. elegans משלימים למערכות אחרות דגם במחקר רעילות הינו יוצא דופן בשנים האחרונות, במיוחד להערכה מהירה רעילות של כימיקלים חדשים. מאמר זה מספק וזמינותו החדש של תפוקה גבוהה, כמותיים הקרנת תולעת פנוטיפים בצלחת 384-טוב על זיהוי אוטומטי ועל הערכה של כמות רעילה. זה וזמינותו האידיאלי לבדיקת רעילות חריפה של כימיקלים בתוך 24 שעות, זה יכול להיות מיושם על רעילות subacute בדיקות גם כאשר יותר נקודות זמן של נתונים שנאספו ואת מקור המזון (OP50) מסופק לתולעים.

אופן השימוש של דילול הכימיקלים יכול להשתנות; בחרנו K-בינוני ב וזמינותו על ידי פנייה סופי.et al. 13. התולעים היו בתרבית ב- K-בינוני בקבוצות טיפול בקרה והן כימית. פתרון מים מתוקים מלאכותיים או פתרון אדמה בעלי עוצמת יוניים נמוכה יכול להיות חלופות K-בינוני.

כימיקלים עם רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans בתבניות שונות. כימיקלים המשמשים מבחן זה נבחרו מתוך הקטגוריות השלישי עד השישי של גלובלי ההרמונית מערכת של סיווג, תיוג של כימיקלים (GHS). C. elegans נחשפו לחומרים כימיים ברמות שישה או יותר המינון, שכיסתה את טווח המינון התמותה 100% - 0%. דימתיל סולפוקסיד הכימיקלים האלה עם מסיסות נמוכה במים, מומלץ לקדם פירוק כימי במים. כמו ריכוז גבוה של דימתיל סולפוקסיד עשוי להשפיע על תוחלת החיים14ופיתוח תולעת, לא יותר מ- 0.2% דימתיל סולפוקסיד אמור לשמש לבדיקות הימית.

התכונות כימות באופן אוטומטי להראות הבדל משמעותי בין רעילות שונים, אשר מדגים כי אלה פנוטיפים כימות של תולעים הן מאוד שימושי לזיהוי הרעילות של כימיקלים. הוא ציין כי פרופיל פנוטיפי חשף שנשמרת פונקציות כדי לסווג ולחזות את הרעילות של כימיקלים שונים באמצעות נמטודות C. elegans כמו אורגניזם מודל ויוו.

ארצות הברית הלאומית הרעלים התוכנית (NTP) נוסדה הקהילה Tox21 באמצעות מזכר הבנה עם ארה ב סביבתי הגנת סוכנות (EPA) ואל מרכז גנומיקה כימית הלאומית המכונים לבריאות (NIH), עכשיו המרכז הלאומי לחקלאות קידום Translational מדעי (NCATS). Tox21 משתמש בתפוקה גבוהה ההקרנה במבחנה ויוו במודל חיה חלופי בדיקות לזיהוי מנגנוני רעילות, כדי לקבוע עדיפויות של כימיקלים לבדיקת רעילות ויוו נוספים, וכן לפתח מודלים תגובות רעילות בני האדם. כחלק מן המאמץ, C. elegans שימש למסך ToxCast שלב של ה-EPA אני וספריות שלב II, אשר מכילים כימיקלים 292, 676, בהתאמה, כימיקלים המוביל ירד התפתחות וצמיחה זחל15. פלטפורמת COPAS (מתחם אובייקט Analyzer פרמטרית, סדרן) שימש גם עבור ההקרנה רעילות תולעת מחקרים2. עם זאת, פלטפורמת COPAS מכמתת רק כמה תכונות, כגון תולעת רוחב, אורך תולעת עוצמת קרינה פלואורסצנטית. שיטה זו היא שיפור שיטות הנוכחי באמצעות תולעים במהירות prescreen הרעילות של כימיקלים חדשים.

קיימים מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול: התרבות תולעת צלחת 384-ובכן, טיפול כימי, לכידת התמונה ניסיוני, כימות פנוטיפ. בהשוואה לשיטות הערכה מסורתית רעילות, פרוטוקול זה יכולים לכמת כמה פנוטיפים של תולעים הנמצאים קשה לחשב באופן ידני ושימושי לשקף את רעילות של כל חומר כימי, כגון תולעת תנועתיות, תולעת רוחב, גודל התולעת וכן אפור העוצמה. ברור, זה וזמינותו תפוקה גבוהה לחיזוי רעילות כימית יהיה בגישה דגם רעילות יקר, יכול לשמש את prescreening של כימיקלים לפני ניסויים בבעלי חיים מכרסם.

לסיכום, טכניקה זו סוללת דרך מהירה רעילות הערכה בתחומים רבים. חוקרים יכולים להחיל את שיטת ניתוח חירום של רעילות toxicosis והקאה, הערכת בטיחות תרכובות פרמצבטיות, כמו גם רעילות חריפה ההקרנה וזיהוי של כימיקלים חדשים ותרכובות סביבתיים אקסוגני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים CGC על מתבקשים לשלוח את C. elegans. עבודה זו נתמכה על ידי מפתח הלאומית למחקר פיתוח תוכנית של סין (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); קרן מדעי הטבע הלאומית של סין גרנט (#31401025, #81273108 #81641184), בריאות ההון מחקר ופיתוח של פרויקט מיוחד בבייג'ינג (#2011-1013-03), הקרן הפתיחה של בייג'ינג המעבדה מפתח של טוקסיקולוגיה סביבתית (# 2015HJDL03), בסיס מדעי הטבע מחוז שאנדונג, סין (ZR2017BF041).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 145 כימיקלים רעילות Caenorhabditis elegans ניתוח תמונות פנוטיפ כמת
וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu,… More

Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter