Summary
Succesen med en tidsopløst seriel femtosekund krystallografi eksperiment er afhængig af effektiv prøven levering. Her beskriver vi protokoller for at optimere ekstrudering af bakterierhodopsin microcrystals fra en høj viskositet mikro-ekstrudering injektor. Metoden bygger på prøve homogenisering med en ny tre-vejs kobling og visualisering med en høj hastighed kamera.
Abstract
Høj viskositet mikro-ekstrudering injektorer har dramatisk reduceret prøve forbrug i serie femtosekund krystallografiske eksperimenter (SFX) på X-ray fri-elektron lasere (XFELs). En serie af eksperimenter ved hjælp af lys-drevet proton pumpe bakterierhodopsin har yderligere etableret disse injektorer som en foretrukne indstilling til at levere krystaller til tidsopløst seriel femtosekund krystallografi (TR-SFX) til at løse strukturelle ændringer af proteiner efter photoactivation. For at få flere strukturelle snapshots af høj kvalitet, er det vigtigt at indsamle store mængder data og sikre clearance af krystaller mellem hver pumpe laser puls. Her, beskriver vi i detaljer hvordan vi optimeret ekstrudering af bakterierhodopsin microcrystals for vores seneste TR-SFX eksperimenter på Linac sammenhængende lys kilde (LCLS). Formålet med metoden er at optimere ekstrudering for en stabil og kontinuerlig flow samtidig opretholde en høj tæthed af krystaller til at øge hastigheden på hvilke data kan indsamles på en TR-SFX eksperimentere. Vi opnår dette mål ved at forberede lipidic cubic fase med en homogen fordeling af krystaller ved hjælp af en roman tre-vejs sprøjte tilkoblingsanordning fulgt ved at justere sample sammensætning baseret på målinger af ekstrudering stabilitet taget med en højhastigheds kamera setup. Metoden, der kan tilpasses til at optimere strømmen af andre microcrystals. Setup vil være tilgængelige for brugere af den nye schweiziske fri elektron Laser facilitet.
Introduction
Seriel femtosekund krystallografi (SFX) er en strukturel biologi teknik, der udnytter de unikke egenskaber af X-ray fri-elektron lasere (XFEL) til at bestemme stuetemperatur strukturer fra tusindvis af mikrometer mellemstore krystaller mens outrunning de fleste af strålingsskader ved "diffraktion før destruktion" princippet1,2,3.
I en tid-løst udvidelse af SFX (TR-SFX) bruges femtosekund impulser fra XFEL til at undersøge strukturelle ændringer i proteiner4,5. Protein af interesse er aktiveret med en optisk laser (eller en anden aktivitet udløser) lige før bliver skudt ved XFEL i en pumpe-sonde setup. Ved præcist at kontrollere forsinkelse mellem pumpen og sonde pulser, kan target proteinet blive fanget i forskellige stater. Molekylær film af strukturelle ændringer over elleve størrelsesordener i tid demonstrere magt af de nye XFEL kilder at studere dynamikken i flere protein mål6,7,8,9, 10,11,12,13. Hovedsagelig, sammenkæder metoden de dynamiske spektroskopiske og statisk strukturfondene teknikker til en, giver et indblik i protein dynamikker på nær atomic opløsning.
Simple systemer for TR-SFX kan indeholde en endogen udløser aktivering med et lysfølsomt element som retinal i bakterierhodopsin (bR)9,10, lysopfangende i photosystem II12,13, photoactive gule protein (PYP)6,7 reversibelt photoswitchable fluorescerende protein11, eller en photolyzable af kulilte i myoglobin8. Spændende varianter af teknik stadig i udvikling afhængige mix og injicere ordninger14,15 for at studere enzymatiske reaktioner eller et elektrisk felt anvendes til at fremkalde strukturændringer16. At XFEL kilder har kun været tilgængelig for et par år og ekstrapolering af tidligere succeser i fremtiden, metoden viser potentiale som en rigtig spil-changer for vores forståelse af, hvordan proteiner funktion.
Fordi biologiske prøver er ødelagt af en enkelt eksponering for en høj effekt XFEL puls, var nye tilgange til Proteinkrystallografi nødvendige. Blandt disse procedurer, evnen til at vokse store mængder af ensartede microcrystals skulle være udviklede17,18,19. For at aktivere indsamling af data på en XFEL, skal disse krystaller afgives, kasseret, og derefter fornyes for hver XFEL puls. I betragtning af at XFELs brand brugbar pulser på 10-120 Hz, skal prøven levering hurtig, stabil og pålidelig, samtidig også holde krystaller intakt og begrænse forbruget. Blandt de mest vellykkede løsninger er en høj viskositet mikro-ekstrudering injektor, som leverer en kontinuerlig streaming kolonne i stuetemperatur krystal-laden lipidic cubic fase (LCP) på tværs af den pulserende X-ray stråle20. Tilfældigt orienterede krystaller, integreret i LCP-stream, der er opfanget af XFEL pulser scatter røntgenbilleder på en detektor, hvor et diffraktionsmønster registreres. LCP var et naturligt valg for en prøve levering medium som det ofte bruges som en vækstmedium for membran protein krystaller17,21,22,23, endnu andre høj viskositet databaerere 24,25,26,27,28,29,30 og opløselige proteiner31 har også været brugt i injektoren. SFX med høj viskositet Injektoren har været vellykket under struktur bestemmelsen af membran proteiner13,32 herunder G protein koblede receptorer (GPCRs)33,34, 35,36,37, med datakvaliteten tilstrækkeligt for indfødte phasing38,39 samtidig være både tid og prøve effektiv. I øjeblikket, disse injektorer bliver brugt mere rutinemæssigt til stuetemperatur målinger på synkrotron kilder28,30,40,41 og under mere teknisk krævende TR-SFX eksperimenter på XFELs9,10,13,42.
Sammenlignelige TR-SFX eksperimenter er foretaget ved hjælp af andre injektor typer som flydende fase levering i et flow fokuseret dyse6,7,12, men denne metode kræver protein beløb ikke er tilgængelige for mange biologisk interessant mål. Til bestemmelse af statiske strukturer ved hjælp af tyktflydende ekstrudering et gennemsnitligt forbrug af 0.072 mg protein pr. 10.000 indekserede diffraktion mønstre i forhold til 9,35 mg til de flydende jet er dyser blevet rapporteret (dvs. ca. 130 gange mere prøve effektiv)20. Høj viskositet Injektoren har vist sig at være en levedygtig prøven levering enhed for TR-SFX mens kun ofrer nogle af denne prøve effektivitet43. I Nogly et al. (2018)10, for eksempel prøve forbrug var ca. 1,5 mg pr. 10.000 indekserede mønstre, som sammenligner positivt til lignende TR-SFX eksperimenter ved hjælp af PYP hvor gennemsnitlige prøve forbrug var meget højere med 74 mg protein pr. 10.000 indekserede mønstre6. Høj viskositet injektorer således klare fordele når mængden af protein tilgængelige begrænser eller når krystaller dyrkes direkte i LCP.
For TR-SFX ved hjælp af høj viskositet injektorer til at give de mest pålidelige data flere tekniske spørgsmål skal løses: flow hastighed skal forblive over en mindste kritiske værdi; hit-rate bør holdes på et niveau, der ikke gør dataindsamling langsom (fx mere end 5%); og prøven skal leveres uden overdreven forstyrrelser. Ideelt, disse betingelser opfyldes allerede længe før en planlagt TR-SFX eksperiment at bruge tilgængelige XFEL tid så effektivt som muligt. Pricipally, en opbremsning i LCP stream kan tillade sondering krystaller, der blev aktiveret med mere end én optisk laser puls og resultatet i blandet aktive stater, eller sondering pumpede materiale, når umpumped materiale forventes i bjælken. En yderligere fordel ved injektion pre-prøvning er at nedetid under dataindsamling på en XFEL er minimeret som tid forvist til udskiftning tilstoppede dyser, skiftende ud ikke-ekstrudering prøver, og andre opgaver til vedligeholdelse er reduceret.
Vi præsenterer her, en metode til at optimere prøven levering for TR-SFX indsamling med en høj viskositet mikro-ekstrudering injektor. For enkelhed stole de beskrevne metoder ikke på adgang til en X-ray kilde, selv om arbejdet på en synkrotron beamline29 ville give yderligere oplysninger om forventede hit satser og crystal diffraktion. Vores protokoller blev udviklet til at optimere eksperimenter for at optage retinal isomerisation i proton-pumpe bakterierhodopsin10 og er gennemført i to faser, begyndende med krystal prøver at forberede ekstrudering efterfulgt af overvågning ekstrudering Brug af et high-speed kamera setup. I fase et, er krystal-laden LCP blandet med yderligere LCP, lav overgangen temperatur lipider eller andre tilsætningsstoffer sikre den endelige blanding er velegnet til levering i prøve miljøet uden tilstopning eller aftagende. En ny tre-vejs sprøjte kobling blev udviklet for at forbedre blanding ydeevne og prøve homogenitet. Den anden fase består af en ekstrudering test registreres af en high-speed kamera direkte måle ekstrudering hastighed stabilitet. Efter analyse af den video data, kan justeringer foretages stikprøve forberedelse protokollen forbedre eksperimentelle resultater. Disse procedurer kan tilpasses for at forberede andre proteiner til TR-SFX indsamling, med minimale ændringer, og vil bidrage til en effektiv udnyttelse af begrænset XFEL beamtime. Med ny XFEL faciliteter lige begyndt deres operation44,45 og overførsel af injektor-baseret serie dataindsamlingsmetoder til synchrotrons28,30,40,41 , de næste par år vil sikkert fortsætte med at give spændende ny indsigt i den strukturelle dynamik i en stadig bredere vifte af protein mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein Crystal prøveforberedelse
- Ca 30 min før prøven er sprøjtes, baseret belastning 50 µL af krystal-laden monoolein LCP i en 100 µL sprøjte.
- Til injektion ved atmosfærisk tryk: belastning 10 µL af flydende paraffin ind i bagsiden af en anden sprøjte. Hold sprøjten lodret, udvise luftbobler fra sprøjten.
- Til indsprøjtning i vakuum miljø: belastning 5 µL af MAG 7,9 og 5 µL af flydende paraffin ind i bagsiden af en anden sprøjte. Hold sprøjten lodret, udvise luftbobler fra sprøjten.
- Tilslutte sprøjten med paraffin/MAG 7,9 til en standard sprøjte kobling, rense luften fra koblingen ved forsigtigt at trykke stemplet indtil en lille mængde (< 1 µL) af paraffin/lipid er synlige på spidsen af kobling nålen.
- Tilslut prøve sprøjten til sprøjte kobling, idet man ikke indføre luft ind i prøven. Bland i lipid/paraffin af forbi prøvemateriale gennem koblingen flere gange.
- Indlæse 20 µL af forblandet LCP (27% PIND, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO) i en anden 100 µL sprøjte. Fjerne luftbobler som nødvendigt.
- Fjern den tomme sprøjte fra koblingen og tillægger krystal indeholdende sprøjte ved hjælp af en standard sprøjte kobling forblandet LCP. Bestå prøven gennem koblingen 100 gange.
Bemærk: Prøve blanding kan opvarmes prøven lidt46. Blanding bør ske i et langsomt tempo hvor temperaturen i prøven kan holdes nogenlunde konstant. - Inspicere prøve for gennemsigtighed mod lyskilde. Hvis en klar homogene LCP har dannet, gå til trin 1.9.
- For at bringe prøven i den kubiske fase, tilsæt 3 µL af monoolein og Bland 50 gange (som beskrevet ovenfor). Gentag denne procedure, lige indtil en gennemsigtig fase har dannet for at undgå en overskridelse af monoolein.
Bemærk: Dannelsen af LCP er temperatur afhængige47 og bedste resultater er opnået lidt over 20 ° C. Mængden af ekstra monoolein behov vil afhænge af mængden af resterende fældningsmiddel løsning fremført fra krystallisering. - Som en foreløbig test for prøven stivhed (som forventet fra LCP fase) og presse-evne, frigøre den tomme sprøjte fra sprøjten kobling og, hold sprøjten lodret, Klem en lille mængde af prøven (< 2 µL) gennem koblingen. Hvis den ekstruderede prøve danner en opretstående cylinder, så er prøven klar til ekstrusion test.
- Justere det samlede volumen af prøven til 100 µL ved at tilføje mere forblandet LCP (som i trin 1,5).
- Vedhæfte prøve sprøjten og to tomme sprøjter til de tre-vejs sprøjte kobling (udrensning luften fra kobling som før). Bland mindst 50 gange (eller indtil homogen) ved passerer halvdelen af prøven i den anden sprøjte og derefter trykke på begge halvdele af prøven ind i tredje sprøjten samtidigt.
- Placer sprøjte indeholdende blandet prøven under et stereo mikroskop for at kontrollere en homogen fordeling af krystaller.
2. test stikprøven ekstrudering ved hjælp af en High-Speed kamera Setup
- Bestemmelse af eksperimentelle parametre.
- Vælg den dyse størrelse for testen.
Bemærk: Dyse størrelser er typisk 50 eller 75 µm indre diameter (ID), men enhver størrelse fra omkring 30-100 µm kan betragtes som ID. Udvælgelsen er baseret på en balance mellem gennemsnitlig tilstopning tid, baggrund spredning, prøve forbrug og hit-rate. - Beregne optimale flow hastighed baseret på eksperimentel laser spot størrelse (1/e2 diameter), og data indsamling ordningen (fx interleaved lys og mørk), der skal bruges på XFEL.
- Beregn den ønskede strømningshastighed (
) i eksemplet fra den optimale flow hastighed (
) og den valgte dyse diameter (
):
Bestemme strømningshastigheden (
) der skal indtastes ved HPLC pumpen baseret på forstærkning faktor (
) af injektoren.
Beregne det maksimale tryk (
) fra den nominelle tryk dyse fittings (
) og forstærkning faktor i injektoren (
):
- Vælg den dyse størrelse for testen.
- Opsætning af høj viskositet ekstrudering injektor til offlinebrug som vist i figur 1.
Bemærk: Injektor funktioner ved hjælp af hydrauliske ekstrudering drevet af en HPLC pumpe, og bruger en co flydende helium gas kappe kontrolleres af en gas regulator. Opsætningen af pumpe og regulator er ikke drøftet i denne protokol. Se kapitel fire i James (2015)48 for en detaljeret manual.- Rense pumpen og alle vand linjer til at sikre flowhastighed er korrekte. Rense den hydrauliske fase af injektoren.
- Montere injektoren (eller kameraet) på en tre-akse fase at lette udformningen og fokus for højhastighedstog videoer. Forlade rummet omkring punktet, injektion for mål linse, belysning, reflekterende skærm og et lille bæger at fange den brugte prøve.
- Konstruere en "dummy dyse" (en tom reservoir med en dyse knyttet) og installere det på injektor til at lette positionering, fokus og belysning.
- Montere højhastighedskamera med dyse spidsen nær omdrejningspunktet for målet.
- Placer den reflekterende skærm bag injektoren og justere belysning for at front-lys dysen.
- Tænde og forbinde til kameraet med den medfølgende software. Med en live video kører for visuel feedback, placere den dyse spids i midten af rammen, og bringe den i fokus med den tre-akse fase.
- Justere belysning, indtil dysen er klart synlig og baggrunden er jævnt belyst.
- Konfigurere kameraet til at optage højhastigheds time-lapse video.
- Indstil framerate til 1000 fps. Indstil opløsning til 512 x 512 pixel.
- Med eksponeringstiden nu sat af framerate, justere belysning niveau indtil dysen er synlige (dvs. ikke under- eller overeksponeret). Flytte dyse tip, således at det er centreret til venstre mod højre og er placeret i den øverste tredjedel af rammen.
- Køre enhver baggrundskorrektion eller hvidbalance operationer.
- Konfigurere kameraet i time-lapse tilstand. Angiv interval til 30 s og gentager til 40 gange, sæt udløse mode til tilfældige (eller tilfældige reset), og indtast antallet af billeder til at registrere til 1000.
- Indlæse reservoir med 20 µL af prøven, og vedhæfte den kapillære dyse.
- Tillægge injektoren fyldt beholderen. Vedhæfte gas linjen til porten på dysen og starte gasstrømmen.
- Manuelt rykke stemplet ved åbning i-line ventil og trykke på sprøjten. Lukke ventilen, når stemplet gør solid kontakt med prøven i reservoiret.
- Programmere pumpe med den beregnede strømningshastighed og angive den maksimale tryk til den beregnede værdi (Se trin 2.1.3).
- Samtidig start pumpen og kamera optagelse.
- Som ekstruderingsprocessen begynder, justere gas pres for at øge stabiliteten. Øge gastryk, hvis væsken danner en dråbe på spidsen af dysen i stedet for en kolonne. Fald pres hvis ekstrudering er brudt på grund af overdreven shear fra gasstrømmen, eller er oscillerende hurtigt piske ().
- Overvåge ekstrudering (10 min er normalt nok til at genkende en homogen flow tilstand), og når pumpetryk skarpt ramper op i nærheden af det forventede sluttidspunkt, stoppe optagelsen, slukke pumpen, og udlufte systemet pres ved at åbne sikkerhedsventil.
- Analyse af video filer
Bemærk: Prøve ekstrudering, der er klart utilstrækkelig ikke kræver en detaljeret analyse. Men det er stadig nyttigt at identificere svigt, således at prøven kan optimeres.- Åbne videofilen med analyse software (fx, Fiji49) og kalibrere måleværktøjerne.
- Kalibrere målingerne ved at markere en linje af kendt længde i billedet med værktøjet streg udvælgelse. Åbn vinduet Sat skala via analyser | Angive skala og Indtast den kendte afstand og måleenheder.
Bemærk: Den kendte diameter af dysen giver en passende kalibrering længde for disse målinger. - Find en ramme i videoen hvor der er en sporbar funktion synlige (f.eks. en krystal) i ekstrudering. Optage stelnummeret.
- Forhånd videoen til en ramme, hvor den samme funktion er synlig men er flyttet fra sin stilling i det forrige trin. Optage stelnummeret.
- Ved hjælp af den lige linje måling værktøj, måle afstanden fra funktionen start og slutpunkt via analyser | Foranstaltning.
Bemærk: Jo længere sporbar afstanden, færre fejl i målingen vil påvirke beregninger - Beregn jet hastigheden fra den målte afstand og den forløbne tid (antallet forbrugt rammer divideret med frameraten.)
- Gentag trin 2.11.3-2.11.6 et par gange for hvert segment af videoen.
- Afbilde dataserier i figur 2.
) i eksemplet fra den optimale flow hastighed (
) og den valgte dyse diameter (
):
) der skal indtastes ved HPLC pumpen baseret på forstærkning faktor (
) af injektoren.
) fra den nominelle tryk dyse fittings (
) og forstærkning faktor i injektoren (
):
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ideelle råvare til de procedurer, der er beskrevet her (figur 3) er høje tætheder af microcrystals indarbejdet i tyktflydende databaerere til injektoren. Proceduren kræver omkring 50 µL af krystal belæsset transportør for hvert præparat. Disse kan være dyrket direkte i LCP som med bR9,10 anvendes her som eksempel (figur 4), eller tilberedt med krystaller vokset i konventionelle vapor diffusion opsætninger. En fremragende video guide til at krystallisering direkte i er gastætte sprøjter kan findes i Ishchenko et al. (2016)37. Med bR er krystallinsk pladerne ideelle diameter omkring 20 μm som et godt kompromis mellem diffraktion magt og homogen aktivering af pumpe laser. Protein krystaller, udarbejdet ved hjælp af protokollerne, som forklaret ovenfor, blev brugt til at indsamle TR-SFX data på proton pumpe bR, som afslørede de ultrahurtig forandringer, der sker efter photon absorption (figur 5).
Efter prøveforberedelse ved hjælp af tre-vejs kobling (fig. 6AB), besigtigelse af prøvemateriale i sprøjten viser billedeksempler homogenitet (figur 6 cD), og mikroskop af blandet prøven, både i den sprøjten og på et dias, kan bekræfte tætheden af krystaller og giver mulighed for målinger af krystal størrelser, crystal størrelse distribution og crystal tæthed. Prøven er i fasen cubic når levering medium er klart (figur 7) og tyktflydende. Grumset blandinger er en indikation af, at prøven er i en svamp fase eller gråt fase, men er ikke afgørende, da høj krystal tæthed kan tilsløre LCPs klarhed. En kort lavtryks test til at identificere den flydende svamp fase kan udføres ved at trække sprøjten stemplet fra prøven i sprøjten. Gråt fase kan let identificeres gennem sin dobbeltbrydning med polariserede lysmikroskopi. Disse tests, kombineret med en pre ekstrudering test er normalt tilstrækkelig til at begrunde en test i injektoren.
Den høje gentagelseshyppighed af XFELs kræver en flow-hastighed, der ikke kan iagttages tilstrækkeligt med lav frame rate kameraer. Derfor, ekstrudering karakterisering er gjort ved hjælp af et højhastighedskamera (koblet til en høj forstørrelse lens), som kan optage time-lapse video. Video data er high-speed, rammer registreres på 1000 fps, og også time-lapse i denne video er optaget for 1 s hver 30 s. Denne data indsamlingsordning vil give mulighed for indsamling af data under hele prøven test (ca 10 min) uden at skabe uhåndterlige video filer. Selv med denne reducerede datasæt kan størrelse, video filer stadig være mere end 50 GB. Skal sørges for passende opbevaring findes hen til gemme video data før testen begynder.
Under jet test (figur 1), bør prøven presse en lang (mere end 200 µm) kontinuerlig kolonne af LCP, der bevæger sig på en næsten konstant hastighed (figur 2). Prøver, der kører i en tilstand med dryppende indikere at prøve viskositet er for lav (figur 2). Prøver kan ofte genvundet og blandet med mere monoolein eller paraffin at tilpasse viskositet. Prøver, der danner en kolonne bør testes med høj hastighed kameraet. Data fra optagelsen skal vise, at ekstrudering forbliver over en mindstehastighed dikteret af dine eksperimentelle parametre. Ekstrudering hastighed bestemmes ved at måle lineær afstand en funktion i LCP stream rejser over et antal billeder. Ekstrudering langsom-nedskrivninger, der kan tilskrives anomale træsko garanterer efterprøvning. Hvis de fortsætter bør jetting forbedres af tilsætningsstoffer som paraffin, ved at nedsætte tætheden af krystaller eller ved at vælge en større diameter dyse. Krystaller, der normalt ikke dyrkes i en tyktflydende medium (f.eks. dampe diffusion) kan være peletted ved centrifugering og indarbejdet i LCP eller andre tyktflydende luftfartsselskaber. Du kan se eksempler på tidligere publikationer24,25,26,27,29,30.
Figur 1: højhastighedskamera bænk setup. Et fotografi af en typisk benchtop setup med de væsentlige dele mærket. Tre-akse scenen giver fleksibilitet i udformningen og fokusere billedet. Injektoren (vist med dyse og reservoir knyttet) monteres lodret, og direkte foran linsen, mål. Belysning i dette eksempel er fastsat af en enkelt fiber lys lysende eksempel off akse og giver et lyst felt på skærmen. En prøve monteret og belyst på denne måde giver et billede som den i inset B. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: højhastighedskamera og data analyse. Billedet ovenfor er to LCP ekstrudering tests. Test A viser bR krystaller i LCP ekstrudering i en dryppende tilstand angiver at prøven ikke er optimeret. Test B viser LCP ekstrudering danner en kontinuerlig kolonne af LCP hvor krystaller kan spores, og ekstrudering hastighed kan beregnes. I dette eksempel flytter en krystal indlejret i kolonnen LCP (50 µm diameter) 301 µm i 8 ms (37,6 mm/s). To datasæt fra forskellige præparater af bakterierhodopsin krystaller i LCP er vist. Fire (eller flere) datapunkter fra hvert sekund af time-lapse high-speed kamera video (1 s af optagelse hvert 30 s) blev afbildet. En stor spredning mellem datapunkter taget fra en enkelt anden data indsamling periode angive kortsigtede hastighed variation. Mens et bevægeligt gennemsnit over hele dataserien viser de længere udsving i strømmen. Top serien er fra et dårligt extruding prøve (høj chance for lys forurening med to på hinanden følgende pumpe laserpulser), og den nederste række er fra en stikprøve, der udføres optimalt. Den vandrette stiplede linje angiver målet ekstrudering hastighed sæt via HPLC pumpe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempel forberedelse rutediagram. Prøveforberedelse starter med en høj tæthed af protein krystaller indlejret i LCP. Prøven er derefter blandet med lav overgangen temperatur lipid, paraffin, og forberedt LCP, indtil prøven kommer ind i cubic fase, og passerer en række små tests til at angive, at prøven vil presse i injektoren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: bakterierhodopsin krystaller som udgangspunkt materiale. Krystaller er vokset i gastætte sprøjter (A) med LCP nedsænket i fældningsmiddel løsning. Krystallisering er optimeret til en høj tæthed af krystaller med en eventuelt smalle størrelse distribution (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: strukturelle ændringer i bakterierhodopsin. TR-SFX afslører ultra-hurtige ændringer i strukturen af proton pumpe bakterierhodopsin. Her er afbilledet en model af bR stammer fra TR-SFX data indhentet fra krystaller udarbejdet ved hjælp af de protokoller, der er skitseret i dette arbejde. Venstre panel viser modellen med funktioner i retinal bindende lomme. Højre panel viser ændringerne i retinal fra femtoseconds til millisekunder. Dette tal blev gengivet fra Nogly et al. (2018)10 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: tre-vejs kobling. Tre-vejs kobling er en reduceret døde-Y lydstyrke designet for kompatibilitet med er gastætte sprøjter. 3D-gengivelser af kobling, vise en sprængskitse af assembly (A), og en gennemsigtig visning viser blanding kanal (B). Figuren viser en inhomogene krystal fordeling efter blanding med den standard kobling (C), og den deraf følgende suspension efter blanding i tre-vejs kobling (D). Blanding opnås ved at skubbe omtrent halvdelen af prøven i en anden sprøjte (E), og derefter skubbe begge halvdele til den resterende sprøjte sammen som illustreret ved de blå pile (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: før injektion test indikatorer. Under forberedelsen er flere små test bruges til at angive, at prøven er i fase og tilstrækkelig tyktflydende. Optisk klarhed er en indikator for, at prøven er sandsynligvis i den kubiske fase. (A) en grumset prøve er vist i sprøjten. (B) et klart eksempel er vist, Bemærk graduering linjer synlige gennem prøven på trods af den høje koncentration af mikro-krystaller. Når lipid matrix er i den kubiske fase, er det stadig solid-lignende når under ingen stress. En lavtryks prøven udføres ved at trække sprøjten fra bagsiden af prøven. Når prøven er for væske-lignende (vejledende svamp fase) stikprøven udvider for at udfylde volumen (C). I et positivt resultat af den samme test (D) er prøven statisk trods den tilbagetrukne stemplet. Endelig udføres en makro-skala ekstrudering prøven ved at trykke på en lille mængde af prøven gennem sprøjte kobling. Et slipværktøj danner på dysen tip (E) eller en hurtigt bøjning cylinder af LCP angiver en stikprøve, der ikke er tyktflydende nok. Hvis prøven Ekstruderer, danner en cylinder, der forbliver lodret over tid (F), så prøven kan gå videre til high-speed kamera test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TR-SFX metode med tyktflydende ekstrudering Injektoren har vist sig for at være en levedygtig teknik for strukturdynamik undersøgelser af bakterierhodopsin9,10 og photosystem II13 og nu tilsyneladende parat til at studere proteiner køre andre Foto biologiske processer såsom lys-drevet ion transport eller sansning5,50. Protokollerne beskrevet ovenfor blev designet til at maksimere TR-SFX indsamling af data om bakterierhodopsin succes, men vi mener, kan fungere som en skabelon for at optimere dataindsamling på andre prøver. På denne måde, meget af den dyrebare beamtime i øjeblikket tabt på grund af tilstopning eller dårlig prøve ekstrudering kunne i stedet bruges til at indsamle bedre data på flere forsinkelser.
Den mest vanskelige og kritiske trin i protokollen er tilsætning af små mængder af monoolein, som bringer lipid matrix i den kubiske fase (trin 1,8). Vanskeligheden ligger i underfundighed af fase overgangen og den negative virkning på prøve, når monoolein er tilføjet i overskud.
Ændringer til metoden, der skal gennemføres for at imødekomme forskellige protein krystaller. Disse kan ikke være forenelige med de samme tilsætningsstoffer eller beløb eller kræves blanding. På den anden side bryde krystaller i mindre stykker under miksningen kan ikke kompromittere diffraktion kvalitet og kan endda forbedre jetting for eksempel når lange nåle bryde ind i kortere fragmenter. Forskellige tilsætningsstoffer kunne erstattes i stedet for paraffin, der er tilføjet for at forbedre flow hastighed stabilitet9. MAG 7,9/9,7 er tilføjet for at forhindre trasnistion til gråt fase, der måtte opstå ved indsprøjtning i vakuum miljøer20 (ligesom CXI endstation på LCLS), men kan udelades hvis forsøget sker ved atmosfærisk tryk. Vores erfaring, kan mange krystaller fra opløselige proteiner stabilt indarbejdet i LCP, men ironisk nok membran protein krystaller ikke direkte vokset i lipidic mesophases ofte opløse formentlig fordi vaskemidler er udvundet fra krystal omkring dem i lipid-lignende miljø. I sådanne tilfælde bør det være forsøgt at helt erstatte LCP med en alternativ tyktflydende carrier24,25,26,27,29,30.
Ændringer til high-speed kamera test kan rumme prøver hvor krystallerne ikke er synlige inden for Flyselskabet. F.eks kan belysning konfigureres til at optage video ved hjælp af polariseret lys mikroskopi. Dette vil forårsage birefringent krystaller at dukke op (som en glød), og afslører også dele af lipid matrix, der er i den birefringent gråt fase.
Ændringer til side, er det afgørende, at protein krystal forberedelse så vidt muligt opfylder følgende kriterier. Krystallerne bør optimalt dimensioneret til at maksimere diffraktion samtidig minimere injektor tilstopning. Krystal tæthed bør være stor nok til at give en hit-rate tilstrækkeligt til at indsamle komplette data sæt, men ikke så tætte at kompromittere jet stabilitet (en tæthed, der er for høj kan normalt fortyndes; for bR, tilpasning til et hit-rate på 10-30% normalt arbejdede d godt). Matrixen lipid bør tilpasses den kubiske fase, og krystal suspensionen bør være ensartet.
TR-SFX rummer store fordele i forhold til andre tidsopløst krystallografi teknikker som Laue diffraktion fordi: strålingsskader er begrænset på grund af "diffraktion før destruktion" metoden, TR-SFX har en bred tidsopløsning over mange ordrer af størrelsesorden og ned til rækken femtosekund de små krystaller mulighed for bedre photoactivation, og photocycles af interesser behøver ikke at være reversible.
TR-SFX på en XFEL ved hjælp af høj viskositet Injektoren har betydelige fordele i forhold til en flydende jet injektor med hensyn til prøven besparelser. Direkte sammenligne PYP6 og bR10, for eksempel, tyder på en reduktion af faktor 50 for den samme mængde af indsamlede diffraktion billeder. Flydende jetfly har på den anden side en fordel i, at strømmen er hurtig og dataindsamling kører med fuld hastighed (vekslende mørke og lys rammer), uden hensyn til injektor stream hastighed stabilitet (eller lys forurening i mørke rammer). Mens den tyktflydende jet Tilføjer nye udfordringer, er det værd at overveje at flydende jet TR-SFX bruger mængder af protein, der kan være helt urimeligt at producere for mange biologisk relevante systemer.
I øjeblikket, er tyktflydende prøveforberedelse til TR-SFX begrænset af krystal kompatibilitet med levering-medium. Selv om der har været flere alternative tyktflydende luftfartsselskaber gennemført, har ingen fundet for at arbejde for alle tilfælde. Derudover vil prøven levering med en høj viskositet injektor altid være underlagt tilstopning eller bremse selv med optomozation ved hjælp af denne protokol. En anden begrænsning af teknik er den iboende reduktion i hit-rate, når fortynding af prøven for at bringe det til optomised presbarhed.
I fremtiden, kan TR-SFX metoder udvides fra protein mål med naturlige lysopfangende til dem med syntetisk photoswitches. Tidsopløst målinger på reaktioner, der ikke kan photoactivated skal stole på blanding, temperatur-hoppe, elektriske felter eller andre aktivisering teknologier, der skal tilpasses til seriel krystallografi. En kombination af disse udløser teknologier sammen med øget tilgængelighed af XFEL beamtime vil, over tid, lægge fundamentet for at forstå den strukturelle dynamik af protein funktion på en atomare niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen modstridende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender Gebhard Schertler, Rafael Abela og Chris Milne for at støtte brugen af høj viskositet injektorer på PSI. Richard Neutze og hans team er anerkendt for drøftelser om tidsopløst krystallografi og prøve levering med høj viskositet injektorer. For finansiel støtte, vi anerkender den schweiziske National Science Foundation for tilskud 31003A_141235, 31003A_159558 (til J.S.) og PZ00P3_174169 (til PN). Dette projekt har modtaget støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under Marie-Sklodowska-Curie tilskud aftale nej 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
- Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
- Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
- Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
- Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
- Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
- Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
- Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
- Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
- Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
- Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
- Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
- Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
- Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
- Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).
