قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D
Summary
ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.
Abstract
ثلاثي الأبعاد (3D) خلية ثقافة النظم غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية ووظائف من النظم التقليدية من ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). بيد أن قياس وظيفة الخلية في الثقافة 3D غالباً أكثر تحديا. تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع المواد الخلوية التي يمكن أن تكون صعبة في الثقافات 3D. طريقة واحدة للتصدي لهذا التحدي هو وضع المواد الجديدة التي تمكن من قياس وظيفة الخلية داخل المواد. هنا، يقدم طريقة لقياس نشاط أية (MMP) مصفوفة الخلوية في 3D الهلاميات المائية في شكل 96-جيدا. في هذا النظام، هو فونكتيوناليزيد المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) مع جهاز استشعار كليافابلي نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك. الخلوية نظام التمثيل التناسبي المختلط نشاط يتناسب مع شدة الأسفار ويمكن أن يقاس مع قارئ ميكروسكوبية قياسية. التصغير من هذا التحليل بشكل جيد 96 تخفيض الوقت اللازم لإعداد تجريبية باستخدام 50% وكاشف بنسبة 80% في حالة مقارنة بالإصدار السابق 24-جيدا للفحص. هذا التحليل أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية. على سبيل المثال، تحليل نشاط أيضي يتجلى هنا، التي يمكن أن تجري في وقت واحد مع نظام التمثيل التناسبي المختلط قياسات النشاط داخل المائية نفس. ويتجلى المقايسة مع الخلايا البشرية سرطان الجلد مغلفة عبر مجموعة من الخلية البذر الكثافة لتحديد كثافة التغليف المناسبة لنطاق العمل التحليل. بعد 24 ساعة تغليف الخلية، MMP وقراءات النشاط الأيضي كانت متناسبة مع الخلية البذر الكثافة. بينما يتجلى المقايسة هنا مع واحد فلوروجينيك الركيزة القابلة للتحلل، يمكن تكييفها وفقا لمجموعة متنوعة من النظم المائية وأجهزة استشعار أخرى الفلورسنت المقايسة والمنهجية. مثل هذا تحليل يوفر منبرا تثقيف 3D العملية وكفاءة والوصول إليها بسهولة لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
Introduction
نظم الثقافة (3D) ثلاثية الأبعاد غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية من نظم الثقافة (2D) ثنائي الأبعاد التقليدية، انظر عدة منشورات ممتازة1،،من23 . بيد استخدام نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد لقياس وظيفة الخلية قد تم تحدي نظراً لصعوبة استرجاع الخلوية وكذلك عينة التجهيز. يحد هذا الصعوبة قياس العديد من الوظائف الخلوية في نظم الاستزراع 3D. للتغلب على هذه الصعوبة، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة تمكن من السهل قياس وظيفة الخلية داخل بيئات 3D. طريقة واحدة لمعالجة هذه الحاجة هو وضع المواد التي لا دعم الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد فحسب بل تشمل أيضا أجهزة استشعار لقياس وظيفة الخلية. على سبيل المثال، أدرجت العديد من النظم المائية فلوروجينيك البروتياز مويتيس كليافابلي لتمكين التصور حوزتي النشاط داخل بيئات 3D4،5،،من67. بينما هذه الأنظمة استخدمت أصلاً للتصوير المجهري، هذه النظم كما يمكن تطويعها للاستخدام في مقايسة نشاط أية (MMP) مصفوفة عالمية استخدام قارئ لوحة قياسية، مما يتيح قياس سهلة لوظيفة الخلية في 3D 8من البيئة.
يتولى، فوق عائلة من الزنك البروتياز، تلعب أدواراً حاسمة في التوازن أنسجة طبيعية وفي العديد من الأمراض. يتولى تتحلل ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وتنشق مستقبلات سطح الخلية والسيتوكينات وتفعيل أخرى يتولى9،10. يتولى دوراً حاسما في العمليات الفسيولوجية مثل التئام الجروح والأمراض مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين، ومرض الزهايمر، والسرطان (انظر ملاحظات في 9،،من1011). بالسرطان، وهي مستويات عالية من التعبير MMP ارتباطاً وثيقا بسرطان خبيث وسوء التشخيص12. وعلاوة على ذلك، يتولى المساهمة في تطور الورم بالتشجيع على غزو خلايا السرطان والهجرة، العمليات الخلوية التي هي ظواهر طبيعتها 3D13،14. ولذلك، هناك الكثير من الاهتمام في القدرة على قياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في الثقافة 3D في سياقات عديدة، بما في ذلك الدراسات البيولوجية الأساسية وفحص فحوصات المخدرات.
الهلاميات المائية شماعة تستخدم على نطاق واسع للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد بسبب مضمونها ارتفاع المياه، ومقاومة للبروتين الامتزاز، والطابع الانضباطي. قد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع عدد من مويتيس لوظيفة الخلية مباشرة، كما هو الحال مع الببتيدات ECM mimetic مثل إدارات RLD وإيكفاف تسهيل التصاق الخلايا، أو توجيه الربط لعوامل النمو مثل تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) 15،16. في الآونة الأخيرة، وقد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع استشعار الببتيدات التي تمكن من قياس وظيفة الخلية ك جيدا5،8. على وجه التحديد، استخدام نظام هيدروجيل شماعة فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP قياس الببتيد تمكين النشاط MMP الخلوية في الثقافات 3D مع قارئ لوحة قياسية ومطلوب لا إجراء مزيد من المعالجة. هذه الأنظمة أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية، بما في ذلك النشاط الأيضي. ويرد هنا، بروتوكول لقياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للخلايا المستزرعة في هيدروجيل شماعة 3D فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك ببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط، والنتائج المعروضة تبين التجارب الأولية التحسين اللازمة لاستخدام هذه المقايسة. تم تغليف الخلايا البشرية سرطان الجلد (A375) في الهلاميات المائية فلوروجينيك عبر طائفة من البذر الكثافة لتحديد كثافة البذر المناسبة التي تقع ضمن نطاق العامل المقايسة. بعد 24 ساعة تغليف، قيست MMP والنشاط الأيضي في استخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية. المقبل، كان تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي لتحديد كثافة البذر داخل نطاق الخطي المقايسة. وأخيراً، حسبت معامل داخل لوحة من اختلاف النسب المئوية (% السيرة الذاتية) بين تريبليكاتيس للتفكير في إمكانية تكرار نتائج النتائج التي تم الحصول عليها. ويتيح هذا الأسلوب الثقافة خلية 3D بسيطة وسريعة وسهلة القياس حوزتي نشاط بعينه الحد الأدنى من المعالجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويجمل العديد من الجوانب الهامة للبيئة الحية في زراعة الخلايا في المختبر 3D. ومع ذلك، ثقافة 3D يجعل أيضا تقييم الدالة cell وإشارات صعبة، تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع الخلوية وإعداد كبيرة من الخلايا. ولذلك، وضع نظام بسيط الثقافة 3D التي تمكن من قياس وظيفة الخلوية دون عينة أخرى ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن ينوه أوهايو السرطان البحث (OCR)، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية لتمويل هذا العمل فضلا عن الملك سعود جامعة (جامعة الملك سعود)، الرياض، المملكة العربية السعودية لمقدمي البلاغ الأول. وتم قياس الوزن الجزيئي لاستشعار الببتيد نيون استخدام مصفوفة المساعدة، الامتزاز الليزر-التأين، وقت الطيران الكتلي (استخدام-TOF) مع مساعدة من الحرم الجامعي الكيميائية صك مركز قياس الطيف الكتلي والبروتينات مرفق في جامعة ولاية أوهايو.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -. M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening – from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
