Summary
ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.
Abstract
ثلاثي الأبعاد (3D) خلية ثقافة النظم غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية ووظائف من النظم التقليدية من ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). بيد أن قياس وظيفة الخلية في الثقافة 3D غالباً أكثر تحديا. تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع المواد الخلوية التي يمكن أن تكون صعبة في الثقافات 3D. طريقة واحدة للتصدي لهذا التحدي هو وضع المواد الجديدة التي تمكن من قياس وظيفة الخلية داخل المواد. هنا، يقدم طريقة لقياس نشاط أية (MMP) مصفوفة الخلوية في 3D الهلاميات المائية في شكل 96-جيدا. في هذا النظام، هو فونكتيوناليزيد المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) مع جهاز استشعار كليافابلي نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك. الخلوية نظام التمثيل التناسبي المختلط نشاط يتناسب مع شدة الأسفار ويمكن أن يقاس مع قارئ ميكروسكوبية قياسية. التصغير من هذا التحليل بشكل جيد 96 تخفيض الوقت اللازم لإعداد تجريبية باستخدام 50% وكاشف بنسبة 80% في حالة مقارنة بالإصدار السابق 24-جيدا للفحص. هذا التحليل أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية. على سبيل المثال، تحليل نشاط أيضي يتجلى هنا، التي يمكن أن تجري في وقت واحد مع نظام التمثيل التناسبي المختلط قياسات النشاط داخل المائية نفس. ويتجلى المقايسة مع الخلايا البشرية سرطان الجلد مغلفة عبر مجموعة من الخلية البذر الكثافة لتحديد كثافة التغليف المناسبة لنطاق العمل التحليل. بعد 24 ساعة تغليف الخلية، MMP وقراءات النشاط الأيضي كانت متناسبة مع الخلية البذر الكثافة. بينما يتجلى المقايسة هنا مع واحد فلوروجينيك الركيزة القابلة للتحلل، يمكن تكييفها وفقا لمجموعة متنوعة من النظم المائية وأجهزة استشعار أخرى الفلورسنت المقايسة والمنهجية. مثل هذا تحليل يوفر منبرا تثقيف 3D العملية وكفاءة والوصول إليها بسهولة لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
Introduction
نظم الثقافة (3D) ثلاثية الأبعاد غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية من نظم الثقافة (2D) ثنائي الأبعاد التقليدية، انظر عدة منشورات ممتازة1،،من23 . بيد استخدام نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد لقياس وظيفة الخلية قد تم تحدي نظراً لصعوبة استرجاع الخلوية وكذلك عينة التجهيز. يحد هذا الصعوبة قياس العديد من الوظائف الخلوية في نظم الاستزراع 3D. للتغلب على هذه الصعوبة، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة تمكن من السهل قياس وظيفة الخلية داخل بيئات 3D. طريقة واحدة لمعالجة هذه الحاجة هو وضع المواد التي لا دعم الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد فحسب بل تشمل أيضا أجهزة استشعار لقياس وظيفة الخلية. على سبيل المثال، أدرجت العديد من النظم المائية فلوروجينيك البروتياز مويتيس كليافابلي لتمكين التصور حوزتي النشاط داخل بيئات 3D4،5،،من67. بينما هذه الأنظمة استخدمت أصلاً للتصوير المجهري، هذه النظم كما يمكن تطويعها للاستخدام في مقايسة نشاط أية (MMP) مصفوفة عالمية استخدام قارئ لوحة قياسية، مما يتيح قياس سهلة لوظيفة الخلية في 3D 8من البيئة.
يتولى، فوق عائلة من الزنك البروتياز، تلعب أدواراً حاسمة في التوازن أنسجة طبيعية وفي العديد من الأمراض. يتولى تتحلل ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وتنشق مستقبلات سطح الخلية والسيتوكينات وتفعيل أخرى يتولى9،10. يتولى دوراً حاسما في العمليات الفسيولوجية مثل التئام الجروح والأمراض مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين، ومرض الزهايمر، والسرطان (انظر ملاحظات في 9،،من1011). بالسرطان، وهي مستويات عالية من التعبير MMP ارتباطاً وثيقا بسرطان خبيث وسوء التشخيص12. وعلاوة على ذلك، يتولى المساهمة في تطور الورم بالتشجيع على غزو خلايا السرطان والهجرة، العمليات الخلوية التي هي ظواهر طبيعتها 3D13،14. ولذلك، هناك الكثير من الاهتمام في القدرة على قياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في الثقافة 3D في سياقات عديدة، بما في ذلك الدراسات البيولوجية الأساسية وفحص فحوصات المخدرات.
الهلاميات المائية شماعة تستخدم على نطاق واسع للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد بسبب مضمونها ارتفاع المياه، ومقاومة للبروتين الامتزاز، والطابع الانضباطي. قد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع عدد من مويتيس لوظيفة الخلية مباشرة، كما هو الحال مع الببتيدات ECM mimetic مثل إدارات RLD وإيكفاف تسهيل التصاق الخلايا، أو توجيه الربط لعوامل النمو مثل تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) 15،16. في الآونة الأخيرة، وقد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع استشعار الببتيدات التي تمكن من قياس وظيفة الخلية ك جيدا5،8. على وجه التحديد، استخدام نظام هيدروجيل شماعة فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP قياس الببتيد تمكين النشاط MMP الخلوية في الثقافات 3D مع قارئ لوحة قياسية ومطلوب لا إجراء مزيد من المعالجة. هذه الأنظمة أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية، بما في ذلك النشاط الأيضي. ويرد هنا، بروتوكول لقياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للخلايا المستزرعة في هيدروجيل شماعة 3D فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك ببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط، والنتائج المعروضة تبين التجارب الأولية التحسين اللازمة لاستخدام هذه المقايسة. تم تغليف الخلايا البشرية سرطان الجلد (A375) في الهلاميات المائية فلوروجينيك عبر طائفة من البذر الكثافة لتحديد كثافة البذر المناسبة التي تقع ضمن نطاق العامل المقايسة. بعد 24 ساعة تغليف، قيست MMP والنشاط الأيضي في استخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية. المقبل، كان تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي لتحديد كثافة البذر داخل نطاق الخطي المقايسة. وأخيراً، حسبت معامل داخل لوحة من اختلاف النسب المئوية (% السيرة الذاتية) بين تريبليكاتيس للتفكير في إمكانية تكرار نتائج النتائج التي تم الحصول عليها. ويتيح هذا الأسلوب الثقافة خلية 3D بسيطة وسريعة وسهلة القياس حوزتي نشاط بعينه الحد الأدنى من المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المكونات المائية
- توليف الفلورسنت الببتيدات حوزتي التحلل كما هو موضح في مكان آخر8، استخدام فلوريسسين كجزيء فلوري ودابسيل كما يحتوي. حل الببتيد في [دمس] لتركيز من 10 ملم ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 30 ميليلتر) صغيرة لتجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
ملاحظة: هذه الببتيدات كما يمكن شراؤها تجارياً. ويتطلب هذا البروتوكول سيستين ج-طرفية في تسلسل الببتيد لتمكين التساهمية إدماج الشبكة البوليمر هيدروجيل. - تعد الذراع 40 8 كاتشين بولي (جليكول) أمين (شماعة)-نوربورنيني (ملحوظة) كوصف17. تحقق من نهاية المجموعة الروغان من أكبر من 90% باستخدام 1"ح الرنين المغناطيسي النووي". حل شماعة ملحوظة في المخزن المؤقت الفوسفات عقيمة المالحة (PBS) في 25% w/v ومخزن في الثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 300 ميليلتر).
ملاحظة: ربط فونكتيوناليزيد مع نوربورنيني كما يمكن شراؤها تجارياً. - توليف تريميثيلبينزويلفوسفيناتي فينيل 2,4,6 الليثيوم صور-البادئ (LAP) كما هو موضح في مكان آخر من18. حل اللفة في الماء المعقم لتركيز 68 ملم وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 300 ميليلتر).
ملاحظة: كبديل لذلك، إيرجاكوري (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) يمكن استخدامها كالصور-البادئ. اللفة وإيرجاكوري ويمكن شراؤها تجارياً. - حل crosslinker الببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط (KCGPQG↓IWGQCK) وخلية التصاق الببتيد (كرجدس) في الماء المعقم لتركيز 200 و 100 ملم على التوالي، وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية (~ 300 ميليلتر و ~ 30 ميليلتر) مختبرين، على التوالي.
2-تحليل إعداد وسائل الإعلام
- إعداد معطل الحرارة، والفحم جردت الجنين المصل البقري (FBS) لتحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط:
ملاحظة: يمكن أن تنتج البروتياز في FBS إشارة خلفية عالية بفحص نظام التمثيل التناسبي المختلط؛ لذلك، من المستحسن إلغاء تنشيط الحرارة والفحم قطاع FBS لوسائل الإعلام المقايسة.- إلغاء تنشيط 100 مل FBS بتدفئة لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم 100 مل FBS هنا اليقوتينج ومخزن في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. ويمكن استخدام أحجام أصغر حسب الحاجة. - إضافة 0.25% w/v من الفحم المنشط و 0.025% w/v من ديكستران إلى كمية صغيرة من FBS (حوالي 5 مل) ويقلب حتى يتم تشكيل الطين. ثم إضافة بقية FBS ويقلب لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 1,962 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. ثم نقل المادة طافية إلى سفينة أخرى.
- كرر الخطوة 2.1.2 ولكن عند 37 درجة مئوية، تليها الخطوة 2.1.3. تعقيم المادة طافية باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر وثم فلتر 0.2 ميكرون.
- إلغاء تنشيط 100 مل FBS بتدفئة لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
- إعداد مقايسة وسائط الإعلام باستخدام وسائط الإعلام وتستكمل مع الفحم 1% جردت FBS، 2 مم ل الجلوتامين، 10 يو/مليلتر البنسلين، 10 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
ملاحظة: ينصح وسائل الإعلام دون الأحمر الفينول لأنها أقل تدخلا الأسفار. إضافات أخرى إلى وسائل الإعلام بالانزيم مثل الأنسولين، عوامل النمو، يمكن إضافة إلخ. طالما امتصاص والأسفار الطيف الذري لا تتداخل مع أجهزة الاستشعار (494 nm nm/521). - إنزيم كولاجيناز البكتيرية تمييع النوع الأول في 10 و 000 1 ميكروغرام/مل في مقايسة وسائط الإعلام كعنصر إيجابي.
3-Hydrogel تغليف إعداد وخلية
- إعداد الحل السلائف المائية.
- إضافة الكواشف إلى أنبوب 1.5 مل بالترتيب التالي، فورتيكسينج بعد إضافة كل مكون من مكونات: تسليح 20 مم 8 40 كاتشين شماعة ملحوظة، مم 12.75 crosslinker MMP التحلل الببتيد، 17.8 مم هيدروكسيد الصوديوم، 1 مم كرجدس مم 2 اللفة، والببتيد فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP 0.25 مم.
ملاحظة: يبين الجدول 1 محتويات الحل السلائف المائية، تركيزات الأسهم، وتركيزات العامل، معادلات حساب الحجم ووحدات التخزين المطلوبة اللازمة لجعل ميليلتر 120 المائية السلائف الحل، وكافية للقيام تجربة مع 10 الهلاميات المائية. لحساب خسارة الحل المائية بسبب بيبيتينج، زيادة الحجم الإجمالي بنسبة 20%. غالباً ما يتم تزويد الببتيدات التجارية في حلاً كلوريد الهيدروجين حمضية؛ لذلك، تتم إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى تحقيق الرقم الهيدروجيني نهائية من 7. ينبغي تأكيد الرقم الهيدروجيني للحل النهائي من قبل المستخدم. - تقسيم الحل السلائف المائية متعددة 1.5 مل أنابيب، أنبوب واحد كل حالة يجري اختبارها.
ملاحظة: يتم اقتراح عدة شروط المراقبة التي تعد الهلاميات المائية دون إضافة الخلايا. عنصر تحكم سلبية، حساب تدهور غير محددة من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك، شرط المائية واحد يمكن أن يكون المحتضنة مع مراقبة المركبات أو الوسائط التجريبية وحدها إذا لم يكن هناك أي شروط المعاملة. لعنصر تحكم إيجابي والمعايرة بين التجارب، يمكن المحتضنة الهلاميات المائية بحوزتي المعروف أن تنشق استشعار فلوروجينيك. على سبيل المثال، استخدمت تركيزات اثنين من كولاجيناز البكتيرية هنا.
- إضافة الكواشف إلى أنبوب 1.5 مل بالترتيب التالي، فورتيكسينج بعد إضافة كل مكون من مكونات: تسليح 20 مم 8 40 كاتشين شماعة ملحوظة، مم 12.75 crosslinker MMP التحلل الببتيد، 17.8 مم هيدروكسيد الصوديوم، 1 مم كرجدس مم 2 اللفة، والببتيد فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP 0.25 مم.
- تغليف الخلايا في الهلاميات المائية.
- إعداد تعليق خلية واحدة فقط كمناسبة لنوع الخلية المستخدمة. على سبيل المثال، غسل طبق 10 سم من خلايا سرطان الجلد A375 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. تريبسينيزي الخلايا باستخدام التربسين 0.05% واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للحد الأدنى 3 حساب الخلايا مع هيموسيتوميتير لتحديد عدد الخلايا الإجمالي.
- الطرد المركزي حل الخلية في 314 x ز لمدة 3 دقائق، ونضح ثقافة وسائل الإعلام، ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في ما يقرب من ثلاثة إضعاف أعلى مطلوب بذر كثافة للتجربة. على سبيل المثال، استخدم تعليق خلية مع كثافة 21 × 106 خلايا هنا لتحقيق كثافة مغلفة نهائي 7 × 106 خلايا/مل.
- عد الخلايا مرة أخرى لضمان تركيز خلية دقيقة.
- إضافة خلايا مع وقف التنفيذ وبرنامج تلفزيوني لكل أنبوبة من حل السلائف المائية وفقا لكثافة البذر المطلوب (0.25، 0.5، 1، 2، 3، 4، 5 و 6، و 7 × 106 خلايا/مل في هذا المثال). إضافة برنامج تلفزيوني للشروط مع أي من الخلايا بدلاً من الخلايا مع وقف التنفيذ.
ملاحظة: جميع الشروط ينبغي أن يكون وحدة التخزين الحل النهائي المائية السلائف نفسها لضمان النسبة بين المكونات المائية، وبرنامج تلفزيوني ثابت. هل أنابيب دوامة لا أن الخلايا فيها، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بقوة دون خلق فقاعات من أجل خلط الحل السلائف. - الاستغناء عن 10 ميليلتر من الحل السلائف المائية إلى أسود عقيمة جولة أسفل لوحة 96، حسنا، ضمان أن التلميح يتركز في وسط البئر كل حين الاستغناء عن.
- بلمرة المائية السلائف الحل بتعريض اللوحة للضوء (الأشعة فوق البنفسجية) البنفسجي الترا في 4 ميغاواط/سم2 لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: مصباح الأشعة فوق البنفسجية (UVL-56 "يده مصباح الأشعة فوق البنفسجية"، أوفب، في المرتفعات، كاليفورنيا) ينتج ضوء الأشعة فوق البنفسجية-أ في طول موجه الأشعة فوق البنفسجية طويلة (365 نانومتر)، التي لا تؤثر على سلامة الخلوية. - إضافة 150 ميليلتر من مقايسة وسائط الإعلام لجميع الآبار باستثناء شروط مراقبة إيجابية دون خلايا مغلفة. إلى عناصر إيجابية، إضافة 150 ميليلتر من حل إنزيم كولاجيناز.
- إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للآبار الخارجي من اللوحة تخفيض التبخر أثناء الحضانة.
4-نظام التمثيل التناسبي المختلط، وقياس النشاط الأيضي
- قياس الأسفار فورا بعد التغليف لإنشاء مقياس fluorescence أساس وضمان التوحيد في البلمرة المائية. قراءة لوحة استخدام ميكروسكوبية fluorescence القارئ استخدام بروتوكولا كامد 96-جيدا لوحة تبلغ مساحتها مسح الإعداد في 494 نانومتر nm/521 (الإثارة/الانبعاثات). وسيكون هذا ح 0 قراءة.
- احتضان لوحة في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 ح 18.
- إضافة كاشف النشاط الأيضي (ريسازورين) في 01:10 (v/v) لكل بئر.
- احتضان لوحة في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 ح 6 إضافية.
ملاحظة: قد تختلف هذه المرة الحضانة تبعاً لنوع الخلية. - قياس fluorescence في تغليف بعد 24 ساعة. قراءة لوحة استخدام ميكروسكوبية fluorescence القارئ استخدام بروتوكولا كامد 96-جيدا لوحة تبلغ مساحتها مسح الإعداد في 494 نانومتر nm/521 (الإثارة/الانبعاثات) للنشاط MMP و 560 نانومتر nm/590 (الإثارة/الانبعاثات) للنشاط الأيضي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان التحليل الحالي مقتبسة من نظام ثقافة المائية 3D المتقدمة سابقا وتتسم فونكتيوناليزيد مع استشعار كليفابل نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك8. جهاز استشعار نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك المستخدمة هنا يتكون من تسلسل الببتيد، جبلاك (بميوبزل) ↓WARKDDK (عدو) ج (↓ يشير إلى موقع الانقسام) الذي كان سابقا الأمثل للانقسام ب نظام التمثيل التناسبي المختلط-14 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-1119. تتم تسمية الببتيد جزيء فلوري (فلوريسسين) ويحتوي جزيء (دابسيل) على جانبي الانقسام والموقع (الشكل 1). عند التعرض للاستشعار فلوروجينيك بحوزتي المناسبة، يتم فصل فلوروفوري وتقضي، ويزيد من الأسفار. هنا، كان المنمنمة المقايسة من صفيحة 24-جيدا على شكل لوحة 96، حسنا، القضاء على العديد من الخطوات في عملية التغليف وتخفيض الوقت اللازم لإجراء تجربة بنسبة 50%. علاوة على ذلك، فإنه خفض حجم الكواشف المستهلكة بنسبة 80 في المائة، كما خفضت الكميات المائية من 50 ميليلتر إلى 10 ميليلتر كل بئر. وعلاوة على ذلك، باستخدام لوحة 96-جيدا، يمكن أن تختبر ظروف 20 في تريبليكاتيس بدلاً من الشروط 12 في تكرارات كل لوح 24-جيدا. ويتضح في الشكل 2تخطيطي لعملية التغليف الخلية. وتناظر التسمية 1 و 2 الخطوات 3.1 و 3.2 في البروتوكول، على التوالي. وتتوافق مع التسميات 3 إلى 5 خطوات 3.2.5 إلى 3.2.7 في البروتوكول. وتتوافق مع تسميات 6 إلى 9 خطوات 4.2 إلى 4.5 في البروتوكول.
لإنشاء حدود الكشف، وإشارة نطاق الفحص الهلاميات المائية فونكتيوناليزيد مع الببتيد القابلة للتحلل MMP فلوروجينيك كانت المحتضنة مع طائفة من تركيزات (0 إلى 2,000 ميكروغرام/ملليلتر) من نوع إنزيم كولاجيناز البكتيرية أنا. بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية، استخدمت قارئ لوحة لقياس الفلورية (الشكل 3). من هذه القياسات الحيوية (أدنى وأعلى الكشف عن الإشارات) وتم تحديد نطاق العمل (3 الانحرافات المعيارية أعلى أدنى إشارة تم الكشف عنها) والانحرافات المعيارية 3 أدناه إشارة الكشف عن أعلى. بعد 24 ساعة حضانة، فقد لوحظ أن أنتجت أدنى إشارة الكشف عن عناصر سلبية (ضجيج الخلفية) في 0 ميكروغرام/مل كولاجيناز، بينما تم الكشف عن أعلى إشارة أنتج 1,000 ميكروغرام/مل كولاجيناز أو أعلاه، حيث يبدأ الإشارة إلى الهضبة (الشكل 3). من النطاق الديناميكي، تم حساب نطاق العمل بين ≈0.16 ميكروغرام/مل وإيتش فور سيفن فور ميكروغرام/مل من كولاجيناز، طائفة واسعة من إشارات عبر ثلاثة أوامر من حجم.
لفحوصات الثقافة الخلية، يجب أن تحدد كثافة الخلية المناسبة التي ينتج عنها قراءات الأسفار داخل نطاق العمل الفحص لكل نوع من الخلايا. هنا، يتم تقديم البيانات الممثلة لخط خلية سرطان الجلد A375، مغلفة في طائفة من الكثافة من 0.25 إلى 7 × 106 خلايا/مل. حصل fluorescence كثافة استخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية في نقاط زمنية مختلفة اثنين: 1) مباشرة بعد التغليف (ح 0) و 2) بعد 24 ساعة من التغليف. في ح 0، قراءات الأسفار كانت منخفضة عبر كثافة البذر (الشكل 4أ)، كما هو متوقع. بعد 24 ساعة ثقافة (الشكل 4ب)، كان النشاط MMP طرديا مع كثافة البذر، الذي أدى المزيد من الخلايا الانقسام أكثر فلوروجينيك MMP استشعار كليافابلي وأعلى كثافة الأسفار. كما كانت الضوابط الداخلية، الهلاميات المائية التي تحتوي على أي من الخلايا المحتضنة مع 0، 10، و 000 1 ميكروغرام/مل من كولاجيناز النوع الأول من إنزيم للإشارة إلى مستويات منخفضة ومتوسطة وعالية للإشارة على التوالي (كما يحدده توصيف نطاق إشارة كولاجيناز في 3 الشكل) وتمثيلها بواسطة خطوط متقطعة في الشكل 4ب. علاوة على ذلك، حدود نطاق العمل محسوبة من الإشارات 0 و 000 1 ميكروغرام/مل وتمثلها الخطوط المنقطة في الشكل 4ب. كثافة البذر في أو أكبر من 1 × 106 خلايا/مل تقع في حدود نطاق العمل. كما كانت قياسات النشاط الأيضي لخط الخلية A375 متناسب مباشرة إلى الخلية البذر الكثافة (الشكل 4ج). سابقا، وقد تم تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي كرقابة داخلية لتحديد نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط على أساس الخلية الواحدة8. تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي عبر كثافة البذر وأسفر لا يوجد فرق كبير في نشاط التمثيل التناسبي المختلط في بذر كثافة أكبر من 2 × 106 خلايا/مل (الشكل 4د). لتحديد التباين بين تريبليكاتيس في كل لوحة (داخل لوحة تقلب)، تم حسابها لكل من نظام التمثيل التناسبي المختلط والنشاط الأيضي معامل تباين النسبة المئوية (% السيرة الذاتية) ويرد في الجدول 2. % السيرة الذاتية أقل من 20 في المائة يشير إلى أن تقلب اللوحة البينية داخل تريبليكاتيس مقبولة لنظام لإنتاج نتائج متسقة20،21.
الشكل 1 : فلوروجينيك تصميم الببتيد القابلة للتحلل MMP. الببتيد فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP يتكون من العمود الفقري الببتيد جبلاك (بميوبزل) ↓WARKDDK (أدوو) ج (↓ يشير إلى موقع الانقسام) الذي يحدد الخصوصية من أجهزة الاستشعار. تتم تسمية الببتيد يحتوي (دابسيل) وفلوروفوري (فلوريسسين)، وملح (فلوريسسيس) عندما يتم الببتيد العمود الفقري المشقوق بنظام التمثيل التناسبي المختلط. هو مترافق مجموعة ثيول إلى الببتيد العمود الفقري لتمكين الرد التساهمية مع المجموعات الوظيفية نوربورنيني في جزيء شماعة، اقتران جهاز استشعار للمائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الاعتداء التخطيطي. مكونات الحل السلائف المائية مختلطة مع خلايا معلقة في برنامج تلفزيوني. الحل السلائف ثم بيبيتيد إلى الأسود، جولة القاع، لوحات 96-جيدا وبلمره بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة للحد الأدنى 3 المقايسة يتم إضافة وسائط الإعلام، وهي المحتضنة لوحات ح 18 (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2). ثم يتم إضافة ريسازورين كاشف النشاط الأيضي، وهي المحتضنة لوحات حاء – 6 إضافية MMP والنشاط الأيضي تقاس باستخدام قارئ ميكروسكوبية فلورسنت مع بروتوكول مسح جيدا عند أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات المشار إليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الحيوي ونطاق العمل المقايسة. كانت المحتضنة الهلاميات المائية فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك الببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط مع طائفة من تركيزات نوع إنزيم كولاجيناز أنا ح 24 بكثافة 37 درجة مئوية والأسفار وتم قياس. وتمثل الخطوط المنقطة النطاق الديناميكي والعمل. n = 3، يعني ± الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تأثير بذر كثافة خط خلية سرطان الجلد A375 على النشاط MMP. (أ) الأولى القياس (ح 0) نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط لخط الخلية A375 تغليف عبر طائفة من كثافة البذر. n = 3 ± يعني قياس "التنمية المستدامة." (ب) نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في h. 24 0 و 10 و 1000 ميكروغرام/مل من كولاجيناز يتم تمثيل بواسطة خطوط متقطعة. تمثل الخطوط المنقطة نطاق العمل (WR) محسوبة من ضوابط كولاجيناز. n = 3، يعني ± التنمية المستدامة. (ج (قياس النشاط الأيضي لخط الخلية A375 مغلفة ح 24 أكثر من مجموعة من البذر الكثافة والمحتضنة مع ريسازورين ن حاء – 6 = 3، يعني ± "التنمية المستدامة." (د) النشاط A375 MMP تطبيع للنشاط الأيضي. n = 3، يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: إعداد الحل السلائف هيدروجيل.
الجدول 2: % داخل لوحة السيرة الذاتية للمقايسة مع خط الخلية A375.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويجمل العديد من الجوانب الهامة للبيئة الحية في زراعة الخلايا في المختبر 3D. ومع ذلك، ثقافة 3D يجعل أيضا تقييم الدالة cell وإشارات صعبة، تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع الخلوية وإعداد كبيرة من الخلايا. ولذلك، وضع نظام بسيط الثقافة 3D التي تمكن من قياس وظيفة الخلوية دون عينة أخرى تجهيز سيزيد إلى حد كبير فائدة نظم الثقافة 3D. نظام 3D الموصوفة هنا يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة. يمكن تغيير تسلسل استشعار فلوروجينيك للكشف عن البروتياز الأخرى. على سبيل المثال، فلوروجينيك استشعار كليفابل التسلسل (GPQG↓IWGQK) التي يمكن أن تكون المشقوق MMP-1،-2،-3،-7،-8 و-9، استخدمت سابقا للكشف عن سرطان الجلد MMP نشاط استجابة لتشريعات22. كما يتيح استخدام المنظومة المائية الوتد دقة ضبط مستقلة المكروية الخلوية، بما في ذلك الخصائص الميكانيكية والتحلل مويتيس التصاق مصفوفة داخل المائية. جزيء الالتصاق إدارات المستخدمة في هذا العمل هو تسلسل المستمدة من فيبرونيكتين وتمكن إنتغرين بوساطة الالتصاق. جزيئات الالتصاق أخرى مثل (RLD) و (إيكفاف) التي هي مستمدة من الفيبرينوجين ولامينين على التوالي يمكن أن تستخدم لتنشيط أنواع أخرى من مستقبلات إنتغرين. على سبيل المثال، وثبت أن تغيير جزيئات الالتصاق تغيرت استطالة الابهري صمامات القلب الخلالي الخلايا (فيكتوريا)، التي قد يكون لها أثر على تضيق الصمام الابهري15. يمكن التحكم التسلسل crosslinker المائية الانحلالية المائية والسلوك الخلوية مغلفة داخل المائية. على سبيل المثال، فإنه اتضح أن الخلايا الليفية قد ازداد انتشار وخلية تنتشر عند مثقف في أسرع اللاإنسانية الهلاميات المائية، التي قد تعجل عملية الشفاء في فيفو23. يمكن أيضا تنظيم الخواص الميكانيكية المكروية وظيفة الخلية، وصلابة المائية يمكن تعديلها بواسطة تغيير عدد الأسلحة في ماكرومير شماعة والوزن الجزيئي شماعة والنسبة بين الوتد وكروسلينكير.
نظراً لأن نظام التمثيل التناسبي المختلط النشاط يختلف حسب نوع الخلية، لكل نوع خلية جديدة من المهم إجراء تجربة الأمثل كثافة تغليف كما هو موضح هنا. بعد 24 ساعة تغليف، كان نظام التمثيل التناسبي المختلط والنشاط الأيضي متناسب مباشرة إلى الخلية كثافة البذر. ومع ذلك، في أوقات أطول يمكن هضبة إشارة الفلورسنت، ولذلك توقيت الفحص قد يكون الأمثل من قبل المستخدم8. أيضا يمكن أن يؤثر على استشعار حوزتي محددة في نطاق العمل وتوقيتها المقايسة. يمكن تحديد نطاق العمل الفحص بإجراء تجربة مجموعة إشارات مع أي من الخلايا وإنزيم proteolytic أكثر تركيزاً على نطاق واسع. إدراج عدة شروط المائية الخلية لا المحتضنة مع إنزيم الضوابط يتيح إنشاء المنخفضة (ضجيج الخلفية)، والمستويات المتوسطة والعالية من إشارة داخل كل مقايسة (0، 10 و 000 1 ميكروغرام/مل من كولاجيناز هنا). وهذا يعطي مؤشرا من حيث الإشارات التي تنتجها الخلايا تقع ضمن نطاق العامل المقايسة. هذا التحليل أيضا متوافقة مع أجهزة استشعار أخرى الفلورسنت التي لا تملك الإثارة وأطياف الانبعاثات، مثل تحليل النشاط الأيضي المستخدمة هنا المتداخلة كرقابة داخلية لحساب نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط على أساس الخلية الواحدة، كما سبق ذكره8 . نشاط طبيعية الأيض أثبتت صحة هذا النهج لبذر الكثافة عند أو فوق 2 × 106 خلايا/مل، الذي يوجد لم تغير كبير عبر البذر كثافة النشاط MMP. هذا التطبيع أمر حاسم لتحديد كثافة البذر المناسبة التي ضمن نطاق عمل منحنى النشاط MMP وداخل جزء خطي المنحنى التطبيع.
في حين الفحص يمكن تكييفها لأغراض عدة، هناك العديد من القيود والجوانب الحرجة المستخدم ينبغي أن ينظر، على وجه التحديد فيما يتعلق بالتدخل مع إشارة الفلورسنت وإعداد الهلاميات المائية. أولاً، يجب الحرص مع اختيار وسائط الثقافة وعلاجات إضافية، وهذه يمكن أن يكون لها تداخل امتصاص طيف أو التكتم التي قد تتداخل مع الكشف عن الأسفار أو إخماد الإشارة. من المستحسن استخدام وسائط الثقافة التي لا تحتوي على الفينول الحمراء. أيضا، بعض العلاجات المخدرات الفلورية (على سبيل المثال، ميتوتريكسات)، أو يكون طيف امتصاص يتداخل مع طيف الإثارة/الانبعاثات fluorophore (مثلاً، كوركومينويدس). وجانب ثاني الذي يمكن أن يؤثر على أداء المقايسة هو إعداد المائية. بسبب لزوجة عالية للحل السلائف المائية، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها لضمان خلط دقيق حل المائية والممارسات بيبيتينج الحذر لمنع تخزين حل المحتوى أو المائية fluorophore غير متكافئة في كل بئر. التبول قبل النصائح ماصة واستخدام منخفضة-الاحتفاظ بنصائح يمكن أن تساعد على الحد من تقلب. جانب مهم آخر لإعداد المائية هو الشكل المائية والموقع في الآبار. ينبغي أن تركز المائية داخل البئر وشكل موحد لتمكين قياسات دقيقة الأسفار مع أقل تقلب15. هنا، الإيدز استخدام ألواح قاع الجولة في توسيط طرف الماصة في كل بئر وإنتاج الهلاميات المائية شبه كروية دائماً عبر جميع الآبار.
بتكييف نظام 3D المائية القابلة للتحلل حوزتي، يمكن اكتشاف حوزتي في الوقت الحقيقي والنشاط الأيضي قراءات في المكروية 3D بعينه الحد الأدنى من المعالجة. وباﻹضافة إلى ذلك، يقلل استخدام المائية شماعة الاصطناعية تقلب دفعة لدفعة لاحظ مع الهلاميات المائية إدارة المحتوى في المؤسسة بطبيعة الحال المشتقة. وعلاوة على ذلك، استخدام شماعة الهلاميات المائية يمكن صقل من الإشارات الكيميائية والميكانيكية من الهلاميات المائية لعنصر تحكم محسنة المكروية. وعلاوة على ذلك، البلمرة المائية شماعة الموصوفة هنا عملية بدأت الصورة، يجعلها سريعة وأكثر قابلية لمنهجيات إنتاجية عالية من الكلاسيكية الهلاميات المائية ECM الطبيعية (أي.، الكولاجين أو ماتريجيل)، التي هي أبطأ و درجة الحرارة الحساسة. هذه البلمرة سريعة، وتسيطر عليها المستخدم يسمح رفع مستوى النظام الآلي بمواصلة استخدام معالجات سائلة الروبوتية، كما يتبين من الآخرين15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن ينوه أوهايو السرطان البحث (OCR)، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية لتمويل هذا العمل فضلا عن الملك سعود جامعة (جامعة الملك سعود)، الرياض، المملكة العربية السعودية لمقدمي البلاغ الأول. وتم قياس الوزن الجزيئي لاستشعار الببتيد نيون استخدام مصفوفة المساعدة، الامتزاز الليزر-التأين، وقت الطيران الكتلي (استخدام-TOF) مع مساعدة من الحرم الجامعي الكيميائية صك مركز قياس الطيف الكتلي والبروتينات مرفق في جامعة ولاية أوهايو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M.
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
