三维水凝胶中全球细胞基质金属蛋白酶和代谢活性的测定
Summary
本文提出了一种用荧光基质金属蛋白酶 (mmp) 可降解肽对聚 (乙二醇) (peg) 水凝胶进行包封和培养的方案。细胞 mmp 和代谢活性直接从水凝胶培养物测量使用标准的微板读取器。
Abstract
与传统的二维 (2d) 培养系统相比, 三维细胞培养系统通常更紧密地分布在体内细胞的反应和功能。然而, 在3d 培养中测量细胞功能往往更具挑战性。许多生物检测需要检索在3d 培养中可能很困难的细胞材料。应对这一挑战的一个方法是开发新的材料, 以便能够测量材料中的细胞功能。本文提出了一种以96孔形式测定三维水凝胶中细胞基质金属蛋白酶 (mmp) 活性的方法。在该系统中, 聚 (乙二醇) (peg) 水凝胶是由荧光 mmp 可裂解传感器功能化的。细胞 mmp 活性与荧光强度成正比, 可通过标准微板读取器进行测量。与以前的24井版本相比, 该检测的小型化为96孔格式, 使实验设置所需的时间减少了 50%, 试剂的使用减少了80%。此检测方法也与其他细胞功能测量结果兼容。例如, 这里演示了代谢活性检测, 该检测可以与在同一水凝胶中的 mmp 活性测量同时进行。该检测结果通过在一系列细胞播种密度上封装的人类黑色素瘤细胞进行了演示, 以确定该检测的工作范围所需的适当包封密度。24小时后细胞包封后, mmp 和代谢活性读数与细胞播种密度成正比。虽然该检测方法在这里用一种荧光可降解底物进行了演示, 但该检测方法可适用于各种水凝胶系统和其他荧光传感器。这种检测为各种应用提供了一个实用、高效且易于访问的3d 培养平台。
Introduction
与传统的二维 (2d) 培养系统相比, 三维 (3d) 培养系统通常更紧密地分布在体内细胞反应中, 请参阅几篇优秀的出版物1、2、3.然而, 由于细胞检索和进一步的样品处理难度大, 利用三维培养系统测量细胞功能一直具有挑战性。这一困难限制了3d 培养系统中许多细胞功能的测量。为了克服这一困难, 需要采用新技术, 以便在3d 环境中轻松测量细胞功能。解决这一需求的一个方法是开发不仅支持三维细胞培养, 还集成传感器来测量细胞功能的材料。例如, 一些水凝胶系统采用了荧光蛋白酶裂解剂, 以便在3d 环境4、5、6、7中显示蛋白酶活性。虽然这些系统最初用于显微成像, 但这些系统也可用于使用标准板读取器进行全局基质金属蛋白酶 (mmp) 活性分析, 从而能够在3d 中轻松测量细胞功能环境8。
mmp 是锌蛋白酶的超级家族, 在正常的组织稳态和许多疾病中起着至关重要的作用。mmp 降解和重塑细胞外基质 (ecm), 裂解细胞表面受体和细胞因子, 并激活其他 mmp9,10。mmp 在伤口愈合等生理过程中以及在关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏症和癌症等疾病中发挥着至关重要的作用 (见9、10、11中的评论)。在癌症中, 高 mmp 表达水平与肿瘤转移和预后差12密切相关。此外, mmp 通过促进癌细胞的侵袭和迁移, 促进肿瘤的进展, 细胞过程本质上是三维现象13,14。因此, 人们对在许多情况下测量三维文化中 mmp 活动的能力非常感兴趣, 包括基础生物研究和药物筛选检测。
peg 水凝胶由于其含水量高、抗蛋白质吸附性强、可调谐性, 被广泛用于三维细胞培养。peg 水凝胶已与一些分子的功能直接细胞功能, 如 ecm 模拟肽, 如 hydrogels, rld, 和 ikvav, 以促进细胞粘附, 或直接连接生长因子, 如转化生长因子β (tgf-β)15,16。最近, peg 水凝胶已与传感器肽功能化, 能够测量细胞功能以及5,8。具体而言, 使用 peg 水凝胶系统功能与荧光性 mmp 可降解肽功能, 可以测量3d 培养中的细胞 mmp 活性, 无需进一步处理。这些系统也与其他细胞功能测量, 包括代谢活动兼容。本文介绍了一种测量用荧光生成 mp 可降解肽功能化的三维 peg 水凝胶中培养的细胞 mmp 活性的协议, 并给出了证明使用该方法所需的初步优化实验的结果。测定。人类黑色素瘤细胞 (a375) 被封装在荧光水凝体在范围内的播种密度范围内, 以确定在该方法的工作范围内的适当播种密度。在24小时的封装后, 使用标准的微板读取器测量 mmp 和代谢活性。其次, 将 mmp 活性归一化为代谢活性, 以确定测定的线性范围内的播种密度。最后, 计算了三聚体之间的板内变异系数 (% cv), 以反映所获得结果的重现性。这种方法可以实现简单、快速的3d 细胞培养, 并以最少的样品处理轻松测量蛋白酶活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
三维体外细胞培养重述了体内环境的许多重要方面。然而, 3d 培养也使得评估细胞功能和信号具有挑战性, 因为许多生物检测需要细胞检索和大量的细胞。因此, 开发一个简单的3d 培养系统, 无需进一步的样品处理即可测量细胞功能, 这将大大提高3d 培养系统的效用。这里描述的3d 系统可以适应各种不同的应用。荧光传感器的序列可以改变, 以检测其他蛋白酶。例如, 可被 mmp-1、-2、-3、-7、-8 和-9 裂?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢俄亥俄州癌症研究 (ocr), oh, 美国为这项工作提供资金, 以及沙特国王大学 (ksu), 利雅得, ksa 赞助的第一作者。在校园化学仪器中心质谱和蛋白质组学的帮助下, 利用基质辅助、激光去电离、飞行时间 (maldi-tof) 质谱测量荧光肽传感器的分子量俄亥俄州立大学的设施。
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
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