Summary
本文提出了一种用荧光基质金属蛋白酶 (mmp) 可降解肽对聚 (乙二醇) (peg) 水凝胶进行包封和培养的方案。细胞 mmp 和代谢活性直接从水凝胶培养物测量使用标准的微板读取器。
Abstract
与传统的二维 (2d) 培养系统相比, 三维细胞培养系统通常更紧密地分布在体内细胞的反应和功能。然而, 在3d 培养中测量细胞功能往往更具挑战性。许多生物检测需要检索在3d 培养中可能很困难的细胞材料。应对这一挑战的一个方法是开发新的材料, 以便能够测量材料中的细胞功能。本文提出了一种以96孔形式测定三维水凝胶中细胞基质金属蛋白酶 (mmp) 活性的方法。在该系统中, 聚 (乙二醇) (peg) 水凝胶是由荧光 mmp 可裂解传感器功能化的。细胞 mmp 活性与荧光强度成正比, 可通过标准微板读取器进行测量。与以前的24井版本相比, 该检测的小型化为96孔格式, 使实验设置所需的时间减少了 50%, 试剂的使用减少了80%。此检测方法也与其他细胞功能测量结果兼容。例如, 这里演示了代谢活性检测, 该检测可以与在同一水凝胶中的 mmp 活性测量同时进行。该检测结果通过在一系列细胞播种密度上封装的人类黑色素瘤细胞进行了演示, 以确定该检测的工作范围所需的适当包封密度。24小时后细胞包封后, mmp 和代谢活性读数与细胞播种密度成正比。虽然该检测方法在这里用一种荧光可降解底物进行了演示, 但该检测方法可适用于各种水凝胶系统和其他荧光传感器。这种检测为各种应用提供了一个实用、高效且易于访问的3d 培养平台。
Introduction
与传统的二维 (2d) 培养系统相比, 三维 (3d) 培养系统通常更紧密地分布在体内细胞反应中, 请参阅几篇优秀的出版物1、2、3.然而, 由于细胞检索和进一步的样品处理难度大, 利用三维培养系统测量细胞功能一直具有挑战性。这一困难限制了3d 培养系统中许多细胞功能的测量。为了克服这一困难, 需要采用新技术, 以便在3d 环境中轻松测量细胞功能。解决这一需求的一个方法是开发不仅支持三维细胞培养, 还集成传感器来测量细胞功能的材料。例如, 一些水凝胶系统采用了荧光蛋白酶裂解剂, 以便在3d 环境4、5、6、7中显示蛋白酶活性。虽然这些系统最初用于显微成像, 但这些系统也可用于使用标准板读取器进行全局基质金属蛋白酶 (mmp) 活性分析, 从而能够在3d 中轻松测量细胞功能环境8。
mmp 是锌蛋白酶的超级家族, 在正常的组织稳态和许多疾病中起着至关重要的作用。mmp 降解和重塑细胞外基质 (ecm), 裂解细胞表面受体和细胞因子, 并激活其他 mmp9,10。mmp 在伤口愈合等生理过程中以及在关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏症和癌症等疾病中发挥着至关重要的作用 (见9、10、11中的评论)。在癌症中, 高 mmp 表达水平与肿瘤转移和预后差12密切相关。此外, mmp 通过促进癌细胞的侵袭和迁移, 促进肿瘤的进展, 细胞过程本质上是三维现象13,14。因此, 人们对在许多情况下测量三维文化中 mmp 活动的能力非常感兴趣, 包括基础生物研究和药物筛选检测。
peg 水凝胶由于其含水量高、抗蛋白质吸附性强、可调谐性, 被广泛用于三维细胞培养。peg 水凝胶已与一些分子的功能直接细胞功能, 如 ecm 模拟肽, 如 hydrogels, rld, 和 ikvav, 以促进细胞粘附, 或直接连接生长因子, 如转化生长因子β (tgf-β)15,16。最近, peg 水凝胶已与传感器肽功能化, 能够测量细胞功能以及5,8。具体而言, 使用 peg 水凝胶系统功能与荧光性 mmp 可降解肽功能, 可以测量3d 培养中的细胞 mmp 活性, 无需进一步处理。这些系统也与其他细胞功能测量, 包括代谢活动兼容。本文介绍了一种测量用荧光生成 mp 可降解肽功能化的三维 peg 水凝胶中培养的细胞 mmp 活性的协议, 并给出了证明使用该方法所需的初步优化实验的结果。测定。人类黑色素瘤细胞 (a375) 被封装在荧光水凝体在范围内的播种密度范围内, 以确定在该方法的工作范围内的适当播种密度。在24小时的封装后, 使用标准的微板读取器测量 mmp 和代谢活性。其次, 将 mmp 活性归一化为代谢活性, 以确定测定的线性范围内的播种密度。最后, 计算了三聚体之间的板内变异系数 (% cv), 以反映所获得结果的重现性。这种方法可以实现简单、快速的3d 细胞培养, 并以最少的样品处理轻松测量蛋白酶活性。
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Protocol
1. 水凝胶成分的制备
- 合成荧光蛋白酶可降解肽, 如其他地方所述, 利用荧光素作为荧光分子, 用 dabcyl 作为检测器。将 dmso 中的肽溶解到浓度为 10 mm 的浓度, 并储存在-80°c 的冰柜中, 放入小 (~ 30μl) 的小等价物中, 以避免重复的冻融循环。
注: 这些肽也可以商业购买。该协议要求在肽序列中使用 c 端半胱氨酸, 以便将共价纳入水凝胶聚合物网络。 - 准备8臂 40 kda 聚 (乙二醇) 胺 (peg)-诺波恩内 (nb) 如所述17。使用1h 核磁共振验证端点功能化大于90%。将 peg-nb 在 25% wv 的无菌磷酸盐缓冲盐 (pbs) 中溶解, 并在-80°c 的冷冻机中 (~ 300μl) 盐度中存储。
注: 与诺博内功能化的 peg 也可以商业购买。 - 合成光引发剂苯基2、4、6三甲基苯甲酰磷酸盐 (lap), 如其他地方所述 18。将 lap 溶解在无菌水中, 浓度为 68 mm, 并储存在-80°c 的冰柜中 (~ 300μl) 等价物中。
注: 作为替代方法, irgacure (2-羟基-4 '-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酮) 可用作光引发剂。lap 和 irgacure 可以通过商业方式购买。 - 将 mmp 可降解肽交联剂 (kcgpqg iwqck) 和无菌水中的细胞粘附肽 (crgds) 溶解, 浓度分别为 200 mm 和 100 mm, 并分别将其储存在-80°c 的冷冻库中 (~ 300μl 和 ~ μl) aliquots。
2. 检测介质的准备工作
- 准备热灭活、炭化的胎儿牛血清 (fbs) 进行 mmp 检测:
注: fbs 中的蛋白酶可以通过 mmp 检测产生高背景信号;因此, 建议在检测介质中采用热失活和木炭条 fbs。- 在55°c 下加热 30分钟, 以关闭100毫升的 fbs。
注: 这里使用100毫升的 fbs 进行报价和在-20°c 下储存, 供将来使用。可以根据需要使用较小的卷。 - 将0.25% 的活性炭和0.025 的糊精加入少量的 fbs (约5毫升), 搅拌至浆料形成。然后, 加入其余的 fbs, 在55°c 下搅拌30分钟。
- 在4°c 下, 以 1, 962 x g离心20分钟。然后将上清液转移到另一艘船上。
- 重复步骤2.1.2 但在37°c 下, 然后是步骤2.1.3。使用0.45μm 过滤器, 然后使用0.2μm 过滤器对上清液进行灭菌。
- 在55°c 下加热 30分钟, 以关闭100毫升的 fbs。
- 使用1% 的木炭剥离 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、10 u/ml 青霉素、10μgml 链霉素补充培养基制备检测介质。
注: 建议使用不含苯酚红的介质, 因为它具有较少的荧光干扰。只要吸收率和荧光光谱峰不与传感器重叠 (494 nm\ 521 nm), 就可以添加对检测介质的其他添加, 如胰岛素、生长因子等。 - 在检测介质中稀释细菌胶原酶 i 型10和1000μgml 作为阳性对照。
3. 水凝胶制备和细胞封装
- 准备水凝胶前体溶液。
- 按以下顺序将试剂添加到 1.5 ml 管中, 加入后的涡旋:20 mm 8 臂 40 kda peg-nb, 12.75 mm 交联剂 mmp 可降解肽, 17.8 mm naoh, 1 mm crgds, 2 mm lap, 和 0.25 mm 氟生成 mL 可降解肽。
注:表 1显示了水凝胶前体溶液的含量、库存浓度、工作浓度、体积计算公式以及制造120μl 水凝胶前体溶液所需的体积, 这足以用10块水凝胶进行试验。要考虑到移液引起的水凝胶溶液损失, 将总体积增加 2 0%。商业肽通常以酸性氯化氢溶液供应;因此, 加入 naoh 以达到7的最终 ph 值。最终溶液的 ph 值应由用户确认。 - 将水凝胶前体溶液分成多个 1.5 ml 管, 每个条件下进行一个管测试。
注: 建议在不添加细胞的情况下制备水凝胶的几种控制条件。对于负控制, 为了考虑荧光传感器的非特异性降解, 如果没有处理条件, 可以单独用车辆控制或实验介质孵化一种水凝胶条件。为了进行积极的控制和在实验之间进行校准, 水凝胶可以用已知的分离荧光传感器的蛋白酶进行培养。例如, 这里使用了两种浓度的细菌胶原酶。
- 按以下顺序将试剂添加到 1.5 ml 管中, 加入后的涡旋:20 mm 8 臂 40 kda peg-nb, 12.75 mm 交联剂 mmp 可降解肽, 17.8 mm naoh, 1 mm crgds, 2 mm lap, 和 0.25 mm 氟生成 mL 可降解肽。
- 将细胞封装在水凝胶中。
- 根据所使用的细胞类型准备单个细胞悬浮液。例如, 用10毫升的 pbs 清洗10厘米的 a375 黑色素瘤细胞。胰蛋白酶细胞使用0.05% 胰蛋白酶, 在37°c 孵育, 5% co 2 孵育 3分钟,用血细胞计计数细胞, 以确定总细胞数量。
- 以 314 x g的速度离心细胞溶液 3分钟, 吸入培养基, 然后以实验所需的最高播种密度约为3倍的速度在 pbs 中重新悬浮细胞。例如, 这里使用了密度为 21 x10 6 的细胞悬浮液, 以实现 7 x10 6 cellsll 的最终封装密度。
- 再次计数细胞, 以确保准确的细胞浓度。
- 根据所需的播种密度 (本例中的0.25、0.5、1、2、3、4、5、6和 7 x10 6 cellsl), 将悬浮细胞和 pbs 添加到每个管中。将 pbs 添加到没有细胞代替悬浮细胞的条件中。
注: 所有条件都应具有相同的最终水凝胶前体溶液体积, 以确保水凝胶成分与 pbs 之间的比率是恒定的。不要涡流管, 其中有细胞, 移液器大力向上和向下, 而不产生气泡, 以混合前体溶液。 - 将水凝胶前体溶液10μl 分配到无菌的黑色圆形底部96孔板中, 确保在分配时将尖端居中在每口井的中间。
- 将水凝胶前体溶液聚合在 4mwcm 2 处的紫外线下, 将其暴露在紫外线下3分钟。
注: uv-56 手持紫外线灯, uvp, ufp, upland, ca) 产生 uv-a 光, 具有长的紫外线波长 (365 纳米), 这不会影响细胞的生存能力。 - 在所有井中添加150μl 的检测介质, 但没有包封细胞的阳性控制条件除外。在阳性对照中, 加入150μl 的胶原酶溶液。
- 在板的外井中加入150μl 的 pbs, 以减少孵育过程中的蒸发。
4. mmp 和代谢活性测量
- 立即在封装后测量荧光, 以建立基线荧光测量, 并确保水凝胶聚合中的均匀性。使用荧光微板读取器读取板, 使用不透明的96孔板协议, 区域扫描设置为 494 nm\ 521 nm (excitation/emission)。这将是0h 读取。
- 在37°c 的加湿孵化器中孵育板, 在18小时内将 5% co 2 孵育。
- 在每口井 1:10 (v2) 处添加代谢活性试剂 (resazurin)。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器中孵育板, 再孵育 6小时.
注: 此孵化时间可能因细胞类型而异。 - 在24小时后封装时测量荧光。使用荧光微板读取器阅读板, 使用不透明的96孔板协议, 其区域扫描设置为 494 nm\ 521 nm (excitation/emission), 用于 mmp 活性和 560 nm\ 590 nm (兴奋/发射), 用于代谢活动。
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Representative Results
目前的检测方法是根据以前开发的三维水凝胶培养系统的功能与荧光 mmp 可裂解传感器8进行了调整。这里使用的荧光性 mmp 传感器由一个肽序列, gplac (pmeobzl) warkdk (adoo) c (表示裂解部位), 以前由 mmp-14 和 mmp-1119 优化为裂解。该肽在裂解部位两侧用荧光分子 (荧光素) 和淬火分子 (dabcyl) 标记 (图 1)。当荧光传感器暴露在适当的蛋白酶上时, 荧光和淬火体被分离, 荧光增加。在这里, 该检测从24孔板小型化到96孔板格式, 消除了封装过程中的几个步骤, 并将进行实验所需的时间缩短了50%。此外, 它还减少了80% 的试剂消费量, 因为水凝胶体积从50μl 减少到每口10μl。此外, 通过使用96孔板, 可以测试20个条件的三元, 而不是12个条件的副本在每个24孔板。图 2显示了单元封装过程的示意图。标签1和2分别对应于协议中的步骤3.1 和3.2。标签3到5对应于协议中 3.2.7 3.2.5 的步骤。标签6至9对应于协议中的步骤4.2 到4.5。
为确定检测的检测极限和信号范围, 采用荧光生成 mp 可降解肽对水凝胶功能进行了一系列浓度 (0 ~ 2, 000μg/ml) 的细菌胶原酶 i。在37°c 孵育24小时后, 使用板式读取器测量荧光 (图 3)。通过这些测量, 确定了动态 (检测到的最低和最高信号) 和工作范围 (高于最低检测信号的3个标准差和低于最高检测信号的3个标准差)。在24小时孵育后, 观察到检测到的最低信号是由0μgml 胶原酶的负控制 (背景噪声) 产生的, 而检测到的最高信号是由 1, 000μgml 胶原酶或以上产生的, 信号开始(图 3)。从动态范围上计算出, 胶原酶的工作范围在0.16μgml 和474μg/ml 之间, 信号范围宽, 跨越三个数量级。
对于细胞培养检测, 必须为每种细胞类型确定在检测工作范围内产生荧光读数的适当细胞密度。这里提供了黑色素瘤细胞系 a375 的代表性数据, 该细胞被封装在0.25 至 7 x10 6 细胞的密度范围内。利用标准微板读取器在两个不同的时间点获得荧光强度: 1) 在封装后 (0 h) 和 2) 在24小时封装后直接。在0小时时, 荧光读数在播种密度方面较低 (如预期的图 4a)。培养24小时后 (图 4b), mmp 活性与播种密度成正比, 其中更多的细胞导致荧光性 mmp 可裂解传感器的更多裂解和更高的荧光强度。作为内部控制, 不含细胞的水凝胶分别用胶原酶 i 型酶的0、10和1000μg/ml 孵育, 以表明信号的低、中和高水平 (由胶原酶信号范围的表征确定)。图 3), 并由图 4b 中的虚线表示。此外, 还从0和 1, 000μgml 信号计算工作范围限值, 并以图 4b中的虚线表示。种子密度在 1 x 10 6 细胞中或大于 1x 10 6 细胞的范围内。a375 细胞系的代谢活性测量也与细胞播种密度成正比 (图 4c)。以前, mmp 活性已被归化为代谢活动, 作为一种内部控制, 以确定每个细胞的 mmp 活性 8.将 mmp 活性归一化到不同播种密度的代谢活性, 使播种密度大于 2 x10 6 细胞的 mmp 活性没有显著差异 (图 4d)。为了确定每个板块中的三聚体之间的变异性 (板内变异性), 计算了 mmp 和代谢活性的变异系数 (% cv), 并在表2中进行了总结。低于20% 的 cv% 表示可接受三聚体内的板内可变性, 从而使系统产生一致的结果20、21.
图 1: 氟生成 mmp 可降解肽的设计.氟生成 mp 可降解肽由主干肽 gplac (pmeobzl) warkddk (adoo) c (表示裂解部位) 组成, 用于确定传感器的特异性。该肽标记为 quencher (dabcyl) 和荧光 (荧光素), 当主干肽被 mmp 切割时, 荧光素是不淬火的 (荧光素)。硫醇基团与主干肽结合, 使 peg 分子中的诺博内官能团发生共价反应, 将传感器与水凝胶耦合。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 检测原理图.水凝胶前体溶液组分与悬浮在 pbs 中的细胞混合。然后将前驱溶液移入黑色、圆形底部、96孔板, 并通过暴露在紫外线下聚合 3分钟, 添加检测介质, 并将板孵育 18小时 (37°c, 5% co 2).然后添加代谢活性试剂 resazurin, 并对板材进行额外的孵育 6小时. mmp 和代谢活性是使用荧光微板读取器测量的, 并在指示的兴奋发射波长上进行良好的扫描协议。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 分析的动态和工作范围.用荧光生成性 mmp 可降解肽功能化的水凝胶, 在37°c 条件下, 用一系列胶原酶 i 型浓度孵育 24小时, 测定荧光强度。虚线表示动态和工作范围。n = 3, 平均±标准偏差 (sd)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 黑色素瘤细胞系 a375 种子密度对 mmp 活性的影响.(a) 初始测量 (0小时) 在播种密度范围内封装的 a375 细胞系的 mmp 活性。n = 3平均值±sd. (b) 胶原酶在24h、0、10和 1000μg/ml 处的 mmp 活性测量用虚线表示。虚线表示从胶原酶控件计算的工作范围 (wr)。n = 3, 平均±sd. (c) 测量 a375 细胞系的代谢活性, 该细胞系在一定的播种密度范围内封装 24小时, 并与雷沙祖林孵育 6 h. n = 3, 平均±sd. (d) a375 mmp 活性归一化为代谢活动。n = 3, 均值±sdd. 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1:水凝胶前体溶液制备.
表 2:板内% cv 的检测与 a375 细胞系.
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Discussion
三维体外细胞培养重述了体内环境的许多重要方面。然而, 3d 培养也使得评估细胞功能和信号具有挑战性, 因为许多生物检测需要细胞检索和大量的细胞。因此, 开发一个简单的3d 培养系统, 无需进一步的样品处理即可测量细胞功能, 这将大大提高3d 培养系统的效用。这里描述的3d 系统可以适应各种不同的应用。荧光传感器的序列可以改变, 以检测其他蛋白酶。例如, 可被 mmp-1、-2、-3、-7、-8 和-9 裂解的氟生成裂解传感器序列 (gpqg iwqk) 以前被用来检测黑色素瘤 mmp 活性, 以应对化疗 22.peg 水凝胶系统的使用还可以精确地独立调整细胞微环境, 包括机械性能、降解性和水凝胶内的基质粘附分子。本文中使用的粘附分子 rgd 是纤维素衍生序列, 可实现整合素介导的粘附。其他分别来源于纤维蛋白原和层压蛋白的粘附分子, 如 (rld) 和 (ikvav), 可用于激活其他类型的整合素受体。例如, 它被证明改变粘附分子改变主动脉间质细胞 (vic) 的伸长率, 这可能对主动脉瓣狭窄15有影响。水凝胶交联剂序列可以控制水凝胶的降解性和包封的细胞行为。例如, 研究表明, 在更快降解的水凝胶中培养时, 成纤维细胞增加了增殖和细胞扩散, 这可能会加快体内23的愈合过程。微环境的力学性能也可以调节细胞功能, 通过改变 peg 大分子中的臂数、peg 分子量以及 peg 与交联剂的比例, 可以改变水凝胶的刚度。
由于 mmp 活动因细胞类型而异, 因此对于每个新的细胞类型, 进行封装密度优化实验非常重要, 如下所示。24小时包封后, mmp 和代谢活性与细胞播种密度成正比。然而, 在更长的时间荧光信号可以高原, 因此, 检测的时间可能必须由用户优化8。特定的蛋白酶传感器也会影响检测的工作范围和时间。该检测的工作范围可以通过在广泛浓度范围内进行没有细胞和蛋白溶解酶的信号范围实验来确定。加入几个没有细胞水凝胶条件, 用酶控制培养, 可以建立低 (背景噪音), 中等和高水平的信号, 在每个检测 (0, 10 和 1, 000μg/ml 的胶原酶在这里)。这就说明了细胞产生的信号在检测工作范围内的位置。该分析还与其他没有重叠激发和发射光谱的荧光传感器兼容, 如先前报告的那样, 这里用作内部控制的代谢活性分析, 用于计算每个细胞的 mmp 活性, 如先前报告的那样8.mmp 活性归一化为代谢活性表明了这种方法对 2 x 10 6 细胞或以上的播种密度的有效性, 在这种情况下, 在播种密度之间没有明显的变化。这种归一化对于确定 mmp 活动曲线工作范围内和归一化曲线的线性部分内的适当播种密度至关重要。
虽然该检测可适用于多种用途, 但用户应考虑几个限制和关键方面, 特别是在干扰荧光信号和水凝胶制备方面。首先, 必须注意选择培养基和额外的处理方法, 因为这些介质可能有重叠的吸收谱或不透明, 可能会干扰荧光或淬火信号的检测。建议使用不含苯酚红色的培养基。此外, 一些药物治疗方法是荧光 (如多索比星), 或具有与荧光体的兴奋/发射光谱重叠的吸收谱 (如凝发光体)。影响检测性能的第二个方面是水凝胶制剂。由于水凝胶前体溶液的高粘度, 需要注意确保水凝胶溶液的彻底混合和谨慎的移液实践, 以防止每口井中荧光含量不均或水凝胶溶液体积不相等。移液器吸头的预润湿和使用低保留时间来帮助减少可变性。水凝胶制备的另一个重要方面是水凝胶的形状和在井中的位置。水凝胶应以井内为中心, 形状均匀, 以便能够以较小的可变性进行精确的荧光测量15。在这里, 使用圆底板有助于在每口井中对移液器尖端进行中心处理, 并在所有油井中持续生产半球形水凝胶。
通过采用3d 蛋白酶降解的水凝胶系统, 可以在3d 微环境中检测到实时蛋白酶和代谢活性读数, 只需进行最少的样品处理。此外, 合成 peg 水凝胶的使用减少了自然衍生 ecm 水凝胶观察到的批次间变异性。此外, 利用 peg 水凝胶可以对水凝胶的化学和机械线索进行微调, 从而改善对微环境的控制。此外, 这里描述的 peg 水凝胶聚合是一个光启动的过程, 使它比经典的天然 ecm 水凝胶 (即胶原蛋白或 matrigel) 更快 、更适合高吞吐量的方法, 而这些水凝胶的速度较慢,温度敏感。这种用户控制的快速聚合使系统的扩展能够使用机器人液体处理程序进一步自动化, 其他15就证明了这一点。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢俄亥俄州癌症研究 (ocr), oh, 美国为这项工作提供资金, 以及沙特国王大学 (ksu), 利雅得, ksa 赞助的第一作者。在校园化学仪器中心质谱和蛋白质组学的帮助下, 利用基质辅助、激光去电离、飞行时间 (maldi-tof) 质谱测量荧光肽传感器的分子量俄亥俄州立大学的设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
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