Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele
Summary
Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.
Abstract
Dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme kurz zusammenfassen oft stärker in Vivo zellulären Reaktionen und Funktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur-Systeme. Messung der Zellfunktion in 3D Culture ist jedoch oft schwieriger. Viele biologische Assays erfordern Entnahme von Zellmaterial, die schwer in 3D Kulturen sein können. Ein Weg, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, neue Materialien zu entwickeln, die Messung der Zellfunktion innerhalb des Materials zu ermöglichen. Hier ist eine Methode zur Messung der zellulären Matrix Metalloproteinase (MMP) Tätigkeit in 3D Hydrogele in einem 96-Well-Format präsentiert. In diesem System ist ein Poly(ethylene glycol) (PEG)-Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor funktionalisiert. MMP Zellaktivität ist proportional zur Fluoreszenzintensität und kann mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen werden. Miniaturisierung des Assays in eine 96-Well-Format reduziert den Zeitaufwand für experimentelle Einrichtung von 50 % und Reagenz Verwendung von 80 % pro Zustand im Vergleich zur vorherigen 24-Well-Version des Tests. Dieser Test ist auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion. Beispielsweise wird ein Stoffwechselaktivität Assay hier demonstriert, die gleichzeitig mit MMP Aktivität Messungen innerhalb der gleichen Hydrogel durchgeführt werden können. Der Test zeigt sich mit menschlichen Melanomzellen gekapselt in einem Spektrum von Zelle Aussaat dichten um die entsprechende Kapselung Dichte des Arbeitsbereichs des Assays bestimmt. Nach 24 Stunden der Zelle Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität anzeigen proportional zur Zelle Dichte Aussaat. Während der Test hier mit einem Fluorogenic abbaubarem Substrat nachgewiesen wird, könnte der Assay und Methodik für eine Vielzahl von Hydrogel-Systemen und anderen fluoreszierenden Sensoren angepasst werden. Ein solcher Test bietet eine praktische, effiziente und leicht zugängliche 3D Kultivierung Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen.
Introduction
Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme oft stärker rekapitulieren in Vivo zelluläre Reaktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur Systeme, siehe mehrere ausgezeichnete Veröffentlichungen1,2,3 . Jedoch Verwendung von 3D Culture Systeme zur Messung der Zellfunktion ist aufgrund der Schwierigkeiten der zellulären Abruf herausfordernd gewesen und probieren Sie weitere Verarbeitung. Diese Schwierigkeit schränkt die Messung vieler zellulärer Funktionen in 3D Culture-Systemen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, neue Techniken sind erforderlich, die einfache Messung der Zellfunktion in 3D-Umgebungen zu ermöglichen. Eine Möglichkeit, dieses Bedarfs ist die Entwicklung von Materialien, die nicht nur 3D Zellkultur zu unterstützen sondern auch Sensoren zur Messung der Zellfunktion. Zum Beispiel haben mehrere Hydrogel Systeme Fluorogenic Protease spaltbaren Moieties zur Visualisierung der Protease-Aktivität in 3D-Umgebungen4,5,6,7aktivieren aufgenommen. Während diese Systeme ursprünglich für mikroskopische Bildgebung genutzt wurden, können diese Systeme auch für die Verwendung in einem globalen Matrix-Metalloproteinase (MMP) Aktivität Assay mit einem standard Platte-Reader ermöglicht einfache Messung einer Zelle-Funktion in eine 3D angepasst werden Umwelt-8.
MMPs, eine Superfamilie von Zink Proteasen, spielen wichtige Rollen im Normalgewebe Homöostase und bei vielen Krankheiten. MMPs verschlechtern und umgestalten der extrazellulären Matrix (ECM), cleave Oberfläche Zellrezeptoren und Zytokine und aktivieren andere MMPs9,10. MMPs spielen eine kritische Rolle in physiologische Prozesse wie z. B. die Heilung von Wunden und Krankheiten wie Arthritis, Arteriosklerose, Alzheimer und Krebs (siehe Bewertungen in 9,10,11). Bei Krebs sind hohe MMP Ausdruck stark korreliert mit Krebsmetastasen und schlechte Prognose12. Darüber hinaus tragen MMPs zur Tumorprogression fördert Krebs Zelle Invasion und Migration, zelluläre Prozesse, die von Natur aus 3D Phänomene13,14sind. Daher gibt es viel Interesse in der Fähigkeit, die Aktivität der MMP in 3D Culture in vielen Kontexten, einschließlich grundlegende biologische Untersuchungen und Drogen-screening-Tests messen.
PEG-Hydrogele sind weit verbreitet für 3D Zellkultur aufgrund des hohen Wassergehaltes, Widerstand gegen Protein Adsorption und abstimmbaren Natur. PEG-Hydrogele haben mit einer Reihe von Moieties zur direkten Zellfunktion, wie z. B. funktionalisiert worden mit ECM mimetischen Peptiden wie RGD RLD und IKVAV zu erleichtern Zelladhäsion oder direkte Anbindehaltung von Wachstumsfaktoren wie Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 15,16. Vor kurzem haben PEG Hydrogele mit Sensor Peptide funktionalisiert worden, die Messung der Zellfunktion als gut5,8ermöglichen. Insbesondere die Verwendung von einem PEG Hydrogel System funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid aktiviert Messung der Zellaktivität MMP in 3D Kulturen mit einem standard Platte Leser und benötigt keine weitere Bearbeitung. Diese Systeme sind auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion, einschließlich metabolische Aktivität. Hier wird ein Protokoll für die Messung von MMP-Aktivität von Zellen in einer 3D PEG Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid funktionalisiert und vorgestellten Ergebnisse demonstrieren die anfänglichen Optimierung Experimente benötigt für den Einsatz dieser kultiviert beschrieben. Assay. Menschlichen Melanomzellen (A375) wurden in die Fluorogenic Hydrogele über einen Bereich der Aussaat dichten um die entsprechende seeding dichten bestimmen, die innerhalb des Arbeitsbereiches des Assays sind gekapselt. Nach 24 Stunden der Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität gemessen unter Verwendung eines standard Mikrotestplatte Lesers. Als nächstes war MMP-Aktivität auf metabolische Aktivität zu bestimmen, die Aussaat dichten innerhalb des linearen Bereichs des Assays normalisiert. Schließlich waren Intra-Platte Koeffizient der Variation Prozentsätze (% CV) zwischen Triplicates entsprechend die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse berechnet. Diese Methode ermöglicht einfaches und schnelles 3D Zellkultur und einfache Messung der Protease-Aktivität mit minimalen Probenverarbeitung.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D in-vitro-Zellkultur rekapituliert viele wichtige Aspekte der in-vivo-Umgebung. Aber 3D Culture macht auch Beurteilung der Zellfunktion und Signaltechnik, Herausforderung, möglichst viele biologische Assays erfordern zellulären abrufen und eine große Anzahl von Zellen. Daher die Entwicklung eines einfachen 3D Culture-System, das ermöglicht die Messung der Zellfunktion ohne weitere Probe Verarbeitung würde stark erhöhen den Nutzen von 3D Culture-Systeme. Die hier beschriebenen 3D-System kann für eine Vielzahl von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA für die Finanzierung dieser Arbeit sowie König Saud University (KSU), Riyadh, KSA für das sponsoring des ersten Autors bestätigen. Molekulargewicht von fluoreszierenden Peptid-Sensor wurde gemessen mit Matrix unterstützt, Laser Desorption-Ionisation, Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie mit Hilfe vom Campus chemische Instrument Center Massenspektrometrie und Proteomics Anlage an der Ohio State University.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
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