Summary
Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.
Abstract
Dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme kurz zusammenfassen oft stärker in Vivo zellulären Reaktionen und Funktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur-Systeme. Messung der Zellfunktion in 3D Culture ist jedoch oft schwieriger. Viele biologische Assays erfordern Entnahme von Zellmaterial, die schwer in 3D Kulturen sein können. Ein Weg, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, neue Materialien zu entwickeln, die Messung der Zellfunktion innerhalb des Materials zu ermöglichen. Hier ist eine Methode zur Messung der zellulären Matrix Metalloproteinase (MMP) Tätigkeit in 3D Hydrogele in einem 96-Well-Format präsentiert. In diesem System ist ein Poly(ethylene glycol) (PEG)-Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor funktionalisiert. MMP Zellaktivität ist proportional zur Fluoreszenzintensität und kann mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen werden. Miniaturisierung des Assays in eine 96-Well-Format reduziert den Zeitaufwand für experimentelle Einrichtung von 50 % und Reagenz Verwendung von 80 % pro Zustand im Vergleich zur vorherigen 24-Well-Version des Tests. Dieser Test ist auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion. Beispielsweise wird ein Stoffwechselaktivität Assay hier demonstriert, die gleichzeitig mit MMP Aktivität Messungen innerhalb der gleichen Hydrogel durchgeführt werden können. Der Test zeigt sich mit menschlichen Melanomzellen gekapselt in einem Spektrum von Zelle Aussaat dichten um die entsprechende Kapselung Dichte des Arbeitsbereichs des Assays bestimmt. Nach 24 Stunden der Zelle Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität anzeigen proportional zur Zelle Dichte Aussaat. Während der Test hier mit einem Fluorogenic abbaubarem Substrat nachgewiesen wird, könnte der Assay und Methodik für eine Vielzahl von Hydrogel-Systemen und anderen fluoreszierenden Sensoren angepasst werden. Ein solcher Test bietet eine praktische, effiziente und leicht zugängliche 3D Kultivierung Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen.
Introduction
Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme oft stärker rekapitulieren in Vivo zelluläre Reaktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur Systeme, siehe mehrere ausgezeichnete Veröffentlichungen1,2,3 . Jedoch Verwendung von 3D Culture Systeme zur Messung der Zellfunktion ist aufgrund der Schwierigkeiten der zellulären Abruf herausfordernd gewesen und probieren Sie weitere Verarbeitung. Diese Schwierigkeit schränkt die Messung vieler zellulärer Funktionen in 3D Culture-Systemen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, neue Techniken sind erforderlich, die einfache Messung der Zellfunktion in 3D-Umgebungen zu ermöglichen. Eine Möglichkeit, dieses Bedarfs ist die Entwicklung von Materialien, die nicht nur 3D Zellkultur zu unterstützen sondern auch Sensoren zur Messung der Zellfunktion. Zum Beispiel haben mehrere Hydrogel Systeme Fluorogenic Protease spaltbaren Moieties zur Visualisierung der Protease-Aktivität in 3D-Umgebungen4,5,6,7aktivieren aufgenommen. Während diese Systeme ursprünglich für mikroskopische Bildgebung genutzt wurden, können diese Systeme auch für die Verwendung in einem globalen Matrix-Metalloproteinase (MMP) Aktivität Assay mit einem standard Platte-Reader ermöglicht einfache Messung einer Zelle-Funktion in eine 3D angepasst werden Umwelt-8.
MMPs, eine Superfamilie von Zink Proteasen, spielen wichtige Rollen im Normalgewebe Homöostase und bei vielen Krankheiten. MMPs verschlechtern und umgestalten der extrazellulären Matrix (ECM), cleave Oberfläche Zellrezeptoren und Zytokine und aktivieren andere MMPs9,10. MMPs spielen eine kritische Rolle in physiologische Prozesse wie z. B. die Heilung von Wunden und Krankheiten wie Arthritis, Arteriosklerose, Alzheimer und Krebs (siehe Bewertungen in 9,10,11). Bei Krebs sind hohe MMP Ausdruck stark korreliert mit Krebsmetastasen und schlechte Prognose12. Darüber hinaus tragen MMPs zur Tumorprogression fördert Krebs Zelle Invasion und Migration, zelluläre Prozesse, die von Natur aus 3D Phänomene13,14sind. Daher gibt es viel Interesse in der Fähigkeit, die Aktivität der MMP in 3D Culture in vielen Kontexten, einschließlich grundlegende biologische Untersuchungen und Drogen-screening-Tests messen.
PEG-Hydrogele sind weit verbreitet für 3D Zellkultur aufgrund des hohen Wassergehaltes, Widerstand gegen Protein Adsorption und abstimmbaren Natur. PEG-Hydrogele haben mit einer Reihe von Moieties zur direkten Zellfunktion, wie z. B. funktionalisiert worden mit ECM mimetischen Peptiden wie RGD RLD und IKVAV zu erleichtern Zelladhäsion oder direkte Anbindehaltung von Wachstumsfaktoren wie Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 15,16. Vor kurzem haben PEG Hydrogele mit Sensor Peptide funktionalisiert worden, die Messung der Zellfunktion als gut5,8ermöglichen. Insbesondere die Verwendung von einem PEG Hydrogel System funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid aktiviert Messung der Zellaktivität MMP in 3D Kulturen mit einem standard Platte Leser und benötigt keine weitere Bearbeitung. Diese Systeme sind auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion, einschließlich metabolische Aktivität. Hier wird ein Protokoll für die Messung von MMP-Aktivität von Zellen in einer 3D PEG Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid funktionalisiert und vorgestellten Ergebnisse demonstrieren die anfänglichen Optimierung Experimente benötigt für den Einsatz dieser kultiviert beschrieben. Assay. Menschlichen Melanomzellen (A375) wurden in die Fluorogenic Hydrogele über einen Bereich der Aussaat dichten um die entsprechende seeding dichten bestimmen, die innerhalb des Arbeitsbereiches des Assays sind gekapselt. Nach 24 Stunden der Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität gemessen unter Verwendung eines standard Mikrotestplatte Lesers. Als nächstes war MMP-Aktivität auf metabolische Aktivität zu bestimmen, die Aussaat dichten innerhalb des linearen Bereichs des Assays normalisiert. Schließlich waren Intra-Platte Koeffizient der Variation Prozentsätze (% CV) zwischen Triplicates entsprechend die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse berechnet. Diese Methode ermöglicht einfaches und schnelles 3D Zellkultur und einfache Messung der Protease-Aktivität mit minimalen Probenverarbeitung.
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Protocol
(1) Hydrogel Komponenten Vorbereitung
- Synthetisieren Sie die fluoreszierenden Protease-abbaubar Peptide wie beschrieben an anderer Stelle8, Nutzung von Fluorescein als fluoreszierende Molekül und Dabcyl als die Durstlöscher. Lösen Sie das Peptid in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank in klein (~ 30 µL) Aliquote wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu vermeiden.
Hinweis: Diese Peptide können auch kommerziell erworben werden. Dieses Protokoll erfordert eine C-terminalen Cystein in Peptidsequenz kovalente Einbindung in das Hydrogel-Polymer-Netzwerk zu ermöglichen. - Bereiten Sie 8 Arm 40 kDa Poly (Ethylenglycol) Amin (PEG)-Norbornen (NB) als17beschrieben. Ende Gruppe Funktionalisierung von mehr als 90 % mit 1H NMR zu überprüfen. PEG-NB in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) 25 % w/V und bei-80 ° C Gefrierschrank in Aliquote (~ 300 µL) auflösen.
Hinweis: PEG funktionalisiert mit Norbornen kann auch kommerziell erworben werden. - Die Foto-Initiator Lithium Phenyl 2,4,6 Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) zu synthetisieren, wie an anderer Stelle18beschrieben. Runde in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 68 mM auflösen und in einem-80 ° C Gefrierschrank in Aliquote (~ 300 µL) zu speichern.
Hinweis: als Alternative Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kann als Foto-Initiator verwendet werden. Runde und Irgacure können kommerziell erworben werden. - Auflösen der MMP-abbaubar Peptid-Vernetzer (KCGPQG↓IWGQCK) und die Zelle Adhäsion Peptid (CRGDS) in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 200 mM und 100 mM bzw., und speichern sie in einem-80 ° C Gefrierschrank (~ 300 µL und ~ 30 µL) Aliquote, beziehungsweise.
(2) Assay Medien Vorbereitung
- Bereiten Sie die Hitze-inaktivierten, Holzkohle abgestreift fetalen bovine Serum (FBS) für die MMP-Assay:
Hinweis: Proteasen in FBS können eine hoher Hintergrund-Signal mit dem MMP-Assay produzieren; Daher, es wird empfohlen, Hitze zu inaktivieren und Kohle-Streifen der FBS für den Assay-Medien.- 100 mL des FBS zu inaktivieren, durch Erhitzen für 30 min. bei 55 ° C.
Hinweis: 100 mL FBS war hier für die Aliquotierung und Lagerung bei-20 ° C für eine spätere Verwendung genutzt. Kleinere Mengen können je nach Bedarf verwendet werden. - Eine kleine Menge des FBS (ca. 5 mL) 0,25 % w/V von Aktivkohle und 0,025 % w/V von Dextran hinzu und rühren Sie, bis ein Brei entsteht. Dann fügen Sie ans Ende der FBS zugeben Sie und 30 min. bei 55 ° C.
- Zentrifuge auf 1.962 X g für 20 min bei 4 ° C. Dann ist den Überstand auf ein anderes Schiff zu übertragen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 aber bei 37 ° C, gefolgt von Schritt 2.1.3. Den Überstand mit einem 0,45 µm-Filter und dann einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren.
- 100 mL des FBS zu inaktivieren, durch Erhitzen für 30 min. bei 55 ° C.
- Bereiten Sie Assay Medien mit Media ergänzt mit 1 % Holzkohle FBS, 2 mM L-Glutamin, 10 U/mL Penicillin, 10 µg/mL Streptomycin abgestreift.
Hinweis: Medien ohne Phenol rot wird empfohlen, weil es weniger Fluoreszenz-Störung hat. Weitere Ergänzungen zu den Assay-Medien wie Insulin, Wachstumsfaktoren, etc.. zugesetzt werden, solange die Absorption und Fluoreszenz-Spektrum-Gipfel überschneiden sich nicht mit dem Sensor (494 nm/521 nm). - Verdünnte bakterielle Kollagenase Enzym Typ I bei 10 bis 1.000 µg/mL in den Assay-Medien als Positivkontrolle.
3. Hydrogel Vorbereitung und Zelle Kapselung
- Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläufer-Lösung.
- Fügen Sie die Reagenzien zu einem 1,5 mL-Tube in der folgenden Reihenfolge, aufschütteln nach Zugabe der einzelnen Komponenten: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM Vernetzer MMP abbaubar Peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Runde und 0,25 mM Fluorogenic MMP abbaubar Peptid.
Hinweis: Tabelle 1 zeigt, Hydrogel Vorläufer Lösung Inhalt, Lager Konzentrationen, arbeiten Konzentrationen Volumen Berechnungsformeln und die geforderten Mengen zu 120 µL Hydrogel-Vorläufer-Lösung, die ausreicht, um durchzuführen benötigt eine Experimentieren Sie mit 10 Hydrogele. Um für den Verlust der Hydrogel-Lösung durch Pipettieren zu berücksichtigen, das Gesamtvolumen von 20 %. Die kommerzielle Peptide werden oft in einem sauren Wasserstoff-Chlorid-Lösung geliefert. Daher wird NaOH hinzugefügt, um eine endgültige pH von 7 zu erreichen. pH-Wert der Endlösung sollte vom Benutzer bestätigt werden. - Die Hydrogel-Vorläufer-Lösung in mehreren 1,5 mL Röhrchen unterteilen eine Röhre pro Zustand getestet.
Hinweis: Mehrere Kontrolle Bedingungen in denen Hydrogele, ohne den Zusatz von Zellen bereit sind werden vorgeschlagen. Für eine Negativkontrolle kann um unspezifische Verschlechterung des Sensors Fluorogenic berücksichtigen eine Hydrogel Bedingung inkubiert werden, mit der Fahrzeugsteuerung oder die experimentelle Medien allein gibt es keine Behandlungsbedingungen. Für eine positive Kontrolle und Kalibrierung zwischen Experimente können Hydrogele mit einer Protease, die bekanntermaßen Fluorogenic Sensor cleave inkubiert werden. Zum Beispiel wurden zwei Konzentrationen von bakteriellen Collagenase hier verwendet.
- Fügen Sie die Reagenzien zu einem 1,5 mL-Tube in der folgenden Reihenfolge, aufschütteln nach Zugabe der einzelnen Komponenten: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM Vernetzer MMP abbaubar Peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Runde und 0,25 mM Fluorogenic MMP abbaubar Peptid.
- Zellen in Hydrogele zu Kapseln.
- Bereiten Sie eine einzelne Zelle Federung je nach Zelltyp verwendet wird. Zum Beispiel Waschen Sie einen 10 cm Teller der A375 Melanomzellen mit 10 mL PBS. Trypsinize Zellen unter Verwendung von 0,05 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 3 min. Anzahl Zellen mit einer Hemocytometer Zelle Summe Anzahl bestimmen.
- Zentrifugieren Sie die Zelle-Lösung bei 314 X g für 3 min, aspirieren Sie Nährmedien, dann wieder auszusetzen Sie Zellen mit PBS-Puffer auf ca. drei Mal die höchste erforderliche Aussaatdichte für das Experiment. Beispielsweise war eine Zellsuspension mit einer Dichte von 21 x 106 Zellen hier verwendet, um eine endgültige gekapselte Dichte von 7 x 106 Zellen/mL zu erreichen.
- Zählen Sie die Zellen erneut, um eine genaue Zellkonzentration sicherzustellen.
- Jedes Rohr Hydrogel-Vorläufer-Lösung entsprechend der erforderlichen Aussaatdichte (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 x 106 Zellen/mL in diesem Beispiel) suspendierten Zellen und PBS hinzufügen. Bedingungen mit keine Zellen anstelle von suspendierten Zellen PBS hinzufügen.
Hinweis: Alle Bedingungen sollte das gleiche letzte Hydrogel Vorläufer Lösung Volumen um das Verhältnis zwischen der Hydrogel-Komponenten sicherzustellen und PBS ist konstant. Tun Sie nicht Vortex-Rohre, die Zellen in ihnen, pipette kräftig nach oben und unten ohne Luftblasen zu schaffen, um die Vorläufer-Lösung zu mischen. - 10 µL der Hydrogel-Vorläufer-Lösung in eine sterile schwarze Runde unten 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Spitze in der Mitte jedes gut zentriert ist, unter Verzicht auf zu verzichten.
- Polymerisieren Sie Hydrogel-Vorläufer-Lösung durch die Aufdeckung der Platte, ultra violett (UV) Licht am 4 mW/cm2 für 3 min.
Hinweis: Die UV-Lampe (UVL-56 Handheld-UV-Lampe, UVP, Upland, CA) produziert einer langwelligen UV UV-A Licht (365 nm), das hat keinen Einfluss auf die zelluläre Lebensfähigkeit. - Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Positivkontrolle Bedingungen ohne eingekapselte Zellen 150 µL Assays Medien hinzufügen. Die Positivkontrollen fügen Sie 150 µL Enzymlösung Kollagenase hinzu.
- Die äußere Vertiefungen der Platte zur Verringerung der Verdunstung während der Inkubation fügen Sie 150 µL PBS hinzu.
(4) MMP und Stoffwechselaktivität Messung
- Messung der Fluoreszenz sofort nach Kapselung zu etablieren eine Baseline-Fluoreszenz-Messung und Einheitlichkeit in Hydrogel Polymerisation zu gewährleisten. Lesen Sie die Platte mit einem Fluoreszenz-Mikrotestplatte Scannen Leser unter Verwendung einer undurchsichtigen 96-Well-Platte-Protokoll mit einer Fläche Einstellung bei 494 nm/521 nm (Anregung/Emission). Dies wird die 0 h zu lesen sein.
- Inkubieren Sie Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 18 h.
- Fügen Sie Stoffwechselaktivität Reagenz (Resazurin) am 01:10 (V/V) für jedes gut.
- Inkubieren Sie Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für weitere 6 h.
Hinweis: Diese Inkubationszeit variieren je nach Zelltyp. - Fluoreszenz bei 24 h Post-Kapselung zu messen. Lesen Sie die Platte mit einem Fluoreszenz-Mikrotestplatte Scannen Leser unter Verwendung einer undurchsichtigen 96-Well-Platte-Protokoll mit einer Fläche bei 494 nm/521 nm (Anregung/Emission) für MMP-Aktivität und 560 nm/590 nm (Anregung/Emission) für die Stoffwechselaktivität.
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Representative Results
Der aktuelle Test wurde von einer zuvor entwickelt und zeichnet sich 3D Hydrogel Kultursystem funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor8angepasst. Die hier verwendete Fluorogenic MMP-Sensor besteht aus einer Peptidsequenz, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ zeigt die Spaltstelle), die zuvor auf Spaltung von MMP-14 und MMP-1119optimiert wurde. Das Peptid trägt ein fluoreszierendes Molekül (Fluorescein) und einem Quencher-Molekül (Dabcyl) auf beiden Seiten der Spaltstelle (Abbildung 1). Bei Kontakt des Sensors Fluorogenic mit der entsprechenden Protease die Fluorophor und Quencher getrennt und Fluoreszenz erhöht. Hier war der Test von einer 24-Well-Platte in einer 96-Well-Plattenformat, eliminieren mehrere Schritte bei der Kapselung und reduzieren den Zeitaufwand für ein Experiment durchführen, um 50 % miniaturisiert. Weiter reduziert es das Volumen der Reagenzien von 80 % verbraucht, wie Hydrogel-Volumen von 50 µL auf 10 µL pro Bohrloch reduziert wurden. Darüber hinaus konnten durch die Verwendung einer 96-Well-Platte, 20 Bedingungen in Triplicates anstelle der 12 Bedingungen in Duplikate pro 24-Well-Platte getestet werden. Eine schematische Darstellung des Kapselung Zellprozess ist in Abbildung 2dargestellt. Label 1 und 2 entsprechen den Schritte 3.1 und 3.2 in das Protokoll. Etiketten 3 bis 5 entsprechen Schritte 3.2.5 bis 3.2.7 im Protokoll. Etiketten 6 bis 9 entsprechen Schritte 4.2 bis 4.5 im Protokoll.
Aufbau der Nachweisgrenzen und Reichweite des Assays zu signalisieren, wurden die Hydrogele mit Fluorogenic MMP abbaubar Peptids funktionalisiert inkubiert mit einer Reihe von Konzentrationen (0 bis 2.000 µg/mL) bakterielle Kollagenase Enzym Typ ich. Nach 24 h Inkubation bei 37 ° C wurde ein Platte Leser zur Messung der Fluoreszenz (Abbildung 3). Aus diesen Messungen die Dynamik (niedrigste und höchste erkannt Signale) und Arbeitsbereich (3 Standardabweichungen oberhalb der niedrigsten detektierte Signal) und 3 Standardabweichungen unter das höchste detektierte Signal ermittelt wurden. Nach 24 h Inkubation wurde beobachtet, dass das niedrigste detektierte Signal von Negativkontrollen (Hintergrundgeräusche) bei 0 µg/mL Kollagenase produziert wurde, während die höchste erkannt Signal wurde produziert von 1.000 µg/mL Kollagenase oder höher, wo beginnt das Signal zu Plateau (Abbildung 3). Von den dynamischen Bereich wurde der Arbeitsbereich berechnet zwischen ≈0.16 µg/mL und ≈474 µg/mL von Kollagenase, eine große Reichweite über drei Größenordnungen.
Zelle-Kultur-Assays muss die entsprechende Zelldichte, die Fluoreszenz Messwerte innerhalb des Arbeitsbereiches des Assays führt für jeden Zelltyp ermittelt werden. Hier werden repräsentative Daten für die Melanom-Zellinie A375, gekapselt in einem Bereich der dichten von 0,25 bis 7 x 106 Zellen/mL präsentiert. Fluoreszenzintensität erworben wurde, unter Verwendung eines standard Mikrotestplatte Lesers zu zwei verschiedenen Zeitpunkten: 1) direkt nach Kapselung (0 h) und (2) nach 24 h der Kapselung. Um 0 Uhr waren Fluoreszenz Lesungen über Aussaat dichten (Abb. 4A), niedrig, wie erwartet. Nach 24 Stunden der Kultur (Abbildung 4B) war MMP Aktivität direkt proportional zu der Aussaatdichte, in denen mehr Zellen mehr Spaltung der Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor und höhere Fluoreszenzintensität geführt. Als interne Kontrollen, Hydrogele, enthält keine Zellen mit 0 inkubiert wurden, Typ 10 bis 1.000 µg/mL von Kollagenase-I-Enzym, die niedrige, mittlere und hohe Niveaus des Signals bzw. (wie bestimmt die Kollagenase Signal Bereich Charakterisierung in zeigen Abbildung 3) und durch gestrichelte Linien in Abbildung 4Bdargestellt. Darüber hinaus wurden die Bereichsgrenzen arbeiten berechnet aus den 0 und 1.000 µg/mL-Signalen und vertreten durch gestrichelte Linien in Abbildung 4B. Seeding dichten an oder größer als 1 x 106 Zellen/mL fallen innerhalb der Grenzen des Arbeitsbereiches. Stoffwechselaktivität Messungen der A375 Zelllinie waren auch direkt proportional zu der Zelle Aussaat Dichte (Abb. 4C). Zuvor hat MMP-Aktivität auf metabolische Aktivität als interne Kontrolle, MMP-Aktivität auf einer Basis pro Zelle8ermitteln normalisiert. Normalisierung der MMP-Aktivität zu Stoffwechselaktivität über Aussaat dichten ergab keinen signifikanten Unterschied in MMP-Aktivität bei Aussaat dichten größer als 2 x 106 Zellen/mL (Abbildung 4D). Um Variabilität zwischen Triplicates in jede Platte (Intra-Platte Variabilität) bestimmen, der Koeffizient der Variation Prozentsatz (% CV) wurde für MMP und metabolische Aktivität berechnet und ist in Tabelle 2zusammengefasst. CV % unter 20 % zeigt, dass die Intra-Platte Variabilität innerhalb der Triplicates für das System, konsistente Ergebnisse20,21zu produzieren akzeptabel ist.
Abbildung 1 : Die Fluorogenic MMP abbaubar Peptid Design. Das MMP-abbaubare Fluorogenic Peptid besteht aus einem Rückgrat Peptid GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ zeigt die Spaltstelle) feststellt, dass die Spezifität des Sensors. Das Peptid wird mit einem Quencher (Dabcyl) und einem Fluorophore (Fluorescein), die ungestillten ist beschriftet (fluoresziert) als das Rückgrat Peptid von MMP gespalten ist. Eine Thiol-Gruppe ist an das Rückgrat Peptid kovalente Reaktion mit Norbornen funktionellen Gruppen im Molekül PEG ermöglichen konjugiert Kopplung des Sensors an das Hydrogel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schaltplan assay. Die Hydrogel-Vorläufer-Lösungskomponenten sind gemischt mit Zellen mit PBS-Puffer suspendiert. Die Vorläufer-Lösung ist dann pipettiert in schwarze, runde Unterseite, 96-Well Platten und polymerisiert durch die Einwirkung von UV-Licht für 3 min. Assay Medien hinzugefügt und Platten sind für 18 h (37 ° C, 5 % CO2) inkubiert. Die Stoffwechselaktivität Reagenz Resazurin wird dann hinzugefügt, und Platten sind für eine zusätzliche 6 h. MMP inkubiert und Stoffwechselaktivität sind mit einem fluoreszierenden Mikrotestplatte Leser mit einem gut Scan-Protokoll bei den angegebenen Erregung/Emission Wellenlängen gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Dynamik und Arbeitsbereich des Assays. Hydrogele mit Fluorogenic MMP abbaubar Peptid funktionalisiert wurden mit einer Reihe von Konzentrationen von Kollagenase Enzym Typ inkubiert, die ich für 24 h bei 37 ° C und Fluoreszenz-Intensität gemessen wurde. Gepunktete Linien repräsentieren die dynamische und Arbeitsbedingungen Spektrum. n = 3, ± Standardabweichung (SD) bedeuten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Wirkung der Aussaat Dichte der Melanom-Zelllinie A375 auf die Aktivität der MMP. (A) erste Messung (0 h) von MMP-Aktivität für A375-Zell-Linie über einer Strecke der Aussaat dichten gekapselt. n = 3 Mittelwert ± SD (B) Messung der MMP-Aktivität bei 24 h 0, 10 und 1000 µg/mL der Kollagenbildung werden durch gestrichelte Linien dargestellt. Gepunktete Linien repräsentieren den Arbeitsbereich (WR) vom Kollagenase Kontrollen gerechnet. n = 3, meine ± SD. (C) Measurement der metabolischen Aktivität für A375 Zelllinie für 24 h über einen Bereich von dichten Aussaat gekapselt und inkubiert mit Resazurin für 6 h n = 3, bedeuten ± SD (D) A375 MMP-Aktivität auf metabolische Aktivität normalisiert. n = 3, bedeuten ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Vorbereitung der Hydrogel Vorläufer Lösung.
Tabelle 2: Intra-Platte % CV des Assays mit A375 Zelllinie.
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Discussion
3D in-vitro-Zellkultur rekapituliert viele wichtige Aspekte der in-vivo-Umgebung. Aber 3D Culture macht auch Beurteilung der Zellfunktion und Signaltechnik, Herausforderung, möglichst viele biologische Assays erfordern zellulären abrufen und eine große Anzahl von Zellen. Daher die Entwicklung eines einfachen 3D Culture-System, das ermöglicht die Messung der Zellfunktion ohne weitere Probe Verarbeitung würde stark erhöhen den Nutzen von 3D Culture-Systeme. Die hier beschriebenen 3D-System kann für eine Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen angepasst werden. Die Reihenfolge der Fluorogenic-Sensor kann geändert werden, um andere Proteasen zu erkennen. Zum Beispiel die Fluorogenic spaltbaren Sensor Sequenz (GPQG↓IWGQK) die von MMP-1, gespalten werden kann -2,-3 -7,-8 und-9, wurde früher eingesetzt, um Melanom MMP Aktivität in Reaktion auf Chemotherapeutika22erkennen. Der Einsatz von PEG Hydrogel System ermöglicht auch präzise unabhängige Abstimmung der zellulären Mikroumgebung, einschließlich der mechanischen Eigenschaften, die Abbaubarkeit und die Matrix Haftung Moieties innerhalb der Hydrogel. Adhäsionsmolekül RGD verwendet in diesem Werk ist eine Sequenz Fibronektin abgeleitet und Integrin-vermittelte Adhäsion ermöglicht. Anderen Adhäsionsmoleküle wie (RLD) und (IKVAV), stammen aus Fibrinogen und Laminin bzw. könnte genutzt werden, um andere Arten von Integrin-Rezeptoren aktivieren. Beispielsweise wurde nachgewiesen, dass Veränderung der Adhäsionsmoleküle die Dehnung der Aorta Herzklappenfehler interstitiellen Zellen (VIC), verändert die Aortenklappe Stenose15auswirken können. Die Hydrogel Vernetzer Reihenfolge kann die Abbaubarkeit der Hydrogel und gekapselte zellulären Verhalten innerhalb der Hydrogel steuern. Beispielsweise wurde nachgewiesen, dass Fibroblasten erhöht hatte, Proliferation und Zelle verbreiten wenn kultiviert in schneller unwürdigen Hydrogele, die heilenden Prozess in Vivo23beschleunigen kann. Mechanische Eigenschaften von der Mikroumgebung können auch regulieren Zellfunktionen und Hydrogel Steifigkeit kann durch Veränderung der Anzahl der Armen in der PEG-Macromer, PEG Molekulargewicht und das Verhältnis zwischen PEG und Vernetzer geändert werden.
Da MMP Aktivität variiert nach Zelltyp je, für jeden neuen Zelltyp ist es wichtig eine Kapselung Dichte Optimierung Experiment durchzuführen, wie hier gezeigt. Nach 24 Stunden der Kapselung waren MMP und metabolische Aktivität direkt proportional zur Zell-Aussaatdichte. Allerdings kann bei längeren Zeiten, die das Fluoreszenzsignal plateau kann, das Timing des Assays müssen daher durch den Benutzer8optimiert werden. Die spezifische Protease-Sensor kann auch Auswirkungen auf den Arbeitsbereich und Timing des Assays. Der Arbeitsbereich des Assays kann durch Durchführung eines Signal Bereich Experiments keine Zellen mit einem proteolytischen Enzym über eine große Konzentration bestimmt werden. Aufnahme von mehreren keine Zelle Hydrogel Bedingungen inkubiert mit Enzym Kontrollen ermöglicht Gründung der niedrigen (Hintergrundgeräusche), mittlere und hohe Niveaus des Signals innerhalb jedes Assay (0, 10 und 1.000 µg/mL der Kollagenbildung hier). Dies gibt Aufschluss über die Signale von Zellen produziert wo innerhalb des Arbeitsbereiches des Assays fallen. Dieser Assay ist auch kompatibel mit anderen fluoreszierenden Sensoren, die nicht überlappenden Erregung und Emissionsspektren, wie z. B. die Stoffwechselaktivität Assay verwendet hier als interne Kontrolle, MMP-Aktivität pro Zelle zu berechnen, wie bereits berichtet8 . MMP-Aktivität, die normalisierte, metabolische Aktivität, dass die Gültigkeit dieses Ansatzes nachgewiesen für die Aussaat dichten bei oder über 2 x 106 Zellen/mL, in denen es keine signifikante Veränderung war in dichten Aussaat. Diese Normierung ist entscheidend für die entsprechende seeding dichten zu identifizieren, die innerhalb des Arbeitsbereiches der MMP-Aktivität-Kurve und innerhalb des linearen Teils der Normalisierung Kurve sind.
Während des Tests für verschiedene Zwecke angepasst werden kann, gibt es mehrere Einschränkungen und kritische Aspekte, die der Nutzer, die insbesondere im Hinblick auf Eingriffe in das Fluoreszenzsignal und Vorbereitung der Hydrogele berücksichtigen sollten. Zunächst muss bei der Auswahl der Kultur, Medien und weitere Behandlungen darauf geachtet werden, wie diese können eine überlappende Absorptionsspektrum oder Trübung, die eventuell stören die Detektion der Fluoreszenz, das Signal zu stillen. Es wird empfohlen, Kultur, Medien zu verwenden, die keine Phenol rot enthält. Auch einige medikamentöse Behandlungen sind fluoreszierend (z. B. Doxorubicin) oder Absorptionsspektrum, das überschneidet sich mit der Erregung/Emissionsspektrum der Fluorophor (z. B. Curcuminoide) haben. Ein zweiter Aspekt, der die Leistung des Tests beeinflussen kann ist die Hydrogel-Vorbereitung. Aufgrund der hohen Viskosität der Hydrogel-Vorläufer-Lösung muss sorgfältig darauf zu achten, gründliches Mischen der Hydrogel-Lösung und vorsichtig Pipettieren Praktiken, ungleiche Fluorophor Inhalt oder Hydrogel Lösung Volumen in jede Vertiefung zu verhindern. Vornässen der die Pipettenspitzen und Verwendung Low Retention Spitzen helfen Variabilität zu reduzieren. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Hydrogel-Vorbereitung ist die Hydrogel-Form und Position in Brunnen. Das Hydrogel sollte in den Brunnen und einer einheitlichen Form ermöglichen genaue Fluoreszenz-Messungen mit weniger Variabilität15zentriert werden. Hier hilft der Einsatz von rundem Bodenplatten zentrieren die Pipettenspitze in jede Vertiefung und die Produktion von halbkugelförmige Hydrogele konsequent über alle Brunnen.
Durch die Anpassung der 3D Protease-abbaubar Hydrogel-System, können Echtzeit-Protease und metabolische Aktivität anzeigen in einem 3D Mikroumgebung mit minimalen Probenverarbeitung erkannt werden. Darüber hinaus reduziert die Verwendung von synthetischen PEG Hydrogel die Charge zu Charge Variabilität mit natürlich gewonnenen ECM Hydrogele beobachtet. Darüber hinaus ermöglicht Nutzung PEG Hydrogele Feinabstimmung der chemischen und mechanischen Signale der Hydrogele für eine verbesserte Steuerung der Mikroumgebung. Die PEG-Hydrogel-Polymerisation hier beschriebenen ist übrigens ein Foto initiierte Prozess, so dass es schnell und zugänglicher für Hochdurchsatz-Methoden als klassische natürliche ECM Hydrogele (dh., Kollagen oder Matrigel), die langsamer sind und temperaturempfindlich. Diese schnelle, Benutzer-kontrollierte Polymerisation ermöglicht die Skalierung des Systems weiter automatisiert mit Roboter-liquid Handler, wie von anderen15gezeigt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA für die Finanzierung dieser Arbeit sowie König Saud University (KSU), Riyadh, KSA für das sponsoring des ersten Autors bestätigen. Molekulargewicht von fluoreszierenden Peptid-Sensor wurde gemessen mit Matrix unterstützt, Laser Desorption-Ionisation, Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie mit Hilfe vom Campus chemische Instrument Center Massenspektrometrie und Proteomics Anlage an der Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
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