Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D
Summary
Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.
Abstract
Sistemas de cultura tridimensional (3D) célula frequentemente mais estreitamente recapitular respostas celulares na vivo e funções que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura. No entanto, medição da função de células em cultura 3D é muitas vezes mais desafiador. Muitos ensaios biológicos requerem recuperação de material celular que pode ser difícil em culturas 3D. Uma maneira de responder a este desafio é desenvolver novos materiais que permitem a medição da função da célula dentro do material. Aqui, um método é apresentado para avaliação da actividade de metaloproteinase (MMP) matriz celular em hidrogel 3D em um formato de 96 poços. Neste sistema, um hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) é acrescido com um sensor de cleavable fluorogenic MMP. Atividade celular MMP é proporcional à intensidade da fluorescência e pode ser medida com um leitor de microplacas padrão. Miniaturização deste ensaio para um formato de 96 poços reduziu o tempo necessário para experimental, instituído pelo uso de 50% e do reagente em 80% por condição em comparação com a versão anterior de 24-poço do ensaio. Este ensaio também é compatível com outras medições da função celular. Por exemplo, um ensaio de atividade metabólica é demonstrado aqui, que pode ser realizada simultaneamente com medições de atividade MMP dentro a mesma hidrogel. O ensaio é demonstrado com células de melanoma humano encapsuladas em toda uma gama de célula semeadura densidades para determinar a densidade de encapsulamento apropriado para a escala de trabalho do ensaio. Após 24h de encapsulamento de célula, MMP e atividade metabólica leituras foram proporcionais à densidade de semeadura de célula. Enquanto o ensaio é demonstrado aqui com uma carcaça de fluorogenic degradável, o ensaio e a metodologia podem ser adaptadas para uma grande variedade de sistemas de hidrogel e outros sensores fluorescentes. Tais fornece uma plataforma cultivo 3D prática, eficiente e facilmente acessível para uma grande variedade de aplicações.
Introduction
Tridimensional (3D) cultura sistemas frequentemente mais estreitamente recapitular na vivo respostas celulares do que os sistemas tradicionais bidimensional (2D) cultura, consulte vários excelentes publicações1,2,3 . No entanto, utilizando sistemas de cultura 3D para medir a função celular tem sido um desafio devido à dificuldade de recuperação celular e processamento da amostra ainda mais. Essa dificuldade limita a medição de muitas funções celulares nos sistemas de cultura 3D. Para superar esta dificuldade, novas técnicas são necessárias que permitem fácil medição da função da célula dentro de ambientes 3D. Uma maneira de atender a essa necessidade é o desenvolvimento de materiais que não só apoiar a cultura de células 3D, mas também incorporam sensores para medir a função celular. Por exemplo, vários sistemas de hidrogel incorporaram partes cleavable de fluorogenic protease para habilitar a visualização de atividade de protease em ambientes 3D4,5,6,7. Enquanto estes sistemas foram originalmente utilizados para a geração de imagens microscópica, estes sistemas podem também ser adaptados para uso em um ensaio da atividade global matriz metaloproteinase (MMP) usando um leitor de placa padrão, permitindo fácil medição de uma função de célula em um 3D ambiente8.
MMPs, uma superfamília de proteases de zinco, desempenham um papel fundamental na homeostase do tecido normal e em muitas doenças. MMPs degradam e remodelam a matriz extracelular (ECM), cleave citocinas e receptores de superfície celular e ativar outros MMPs9,10. MMPs desempenham um papel crítico em processos fisiológicos como a cicatrização de feridas e em doenças como artrite, arteriosclerose, Alzheimer e câncer (veja comentários em 9,10,11). Em câncer, altos níveis de expressão de MMP estão fortemente correlacionados com metástase do cancro e de mau prognóstico12. Além disso, MMPs contribuam para progressão do tumor, promovendo a invasão de células de câncer e migração, processos celulares que são fenômenos inerentemente 3D13,14. Portanto, há muito interesse na capacidade de medir a atividade da MMP na cultura 3D em muitos contextos, incluindo estudos biológicos fundamentais e ensaios de despistagem de drogas.
Hidrogel PEG é amplamente utilizados para cultura de células 3D devido ao seu alto teor de água, resistência à adsorção de proteínas e a natureza ajustável. Hidrogel PEG ter sido acrescida com um número de partes para função direta da célula, tais como com peptídeos miméticas de ECM como RGD, RLD e IKVAV para facilitar a aderência de célula, ou direcionar o tethering de fatores de crescimento tais como transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) 15,16. Mais recentemente, PEG hidrogel tem sido acrescida com peptídeos de sensor que permitem a mensuração da função celular, bem5,8. Especificamente, o uso de um sistema de hidrogel PEG acrescida com um fluorogenic medição de peptídeo habilitado MMP-degradáveis da atividade celular de MMP em culturas 3D com um leitor de placa padrão e não exigido nenhum processamento adicional. Estes sistemas também são compatíveis com outras medições da função celular, incluindo a atividade metabólica. Aqui, um protocolo é descrito para a medição da atividade da MMP de células cultivadas em um hidrogel de PEG 3D acrescida com um peptídeo de MMP-degradáveis fluorogenic e resultados apresentados demonstrando as experiências de otimização inicial necessárias para o uso do presente do ensaio. Células de melanoma humano (A375) foram encapsuladas no hidrogel fluorogenic sobre uma escala de densidades para determinar as densidades de semeadura adequadas que estão dentro da faixa de trabalho do ensaio de semeadura. Após 24h de encapsulamento, MMP e atividade metabólica foram medidos utilizando um leitor de microplacas padrão. Em seguida, MMP atividade foi normalizada a atividade metabólica para determinar as densidades de semeadura dentro da escala linear do ensaio. Finalmente, o coeficiente intraplaca das percentagens de variação (% CV) foram calculados entre triplica para refletir a reprodutibilidade dos resultados obtidos. Esse método permite que a cultura de células 3D simples e rápido e fácil medição de atividade de protease com processamento de amostra mínima.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cultura de células in vitro 3D recapitula a muitos aspectos importantes do ambiente em que vivo. No entanto, cultura 3D também faz avaliação função celular e sinalização desafiador, como muitos ensaios biológicos requerem recuperação celular e um grande número de células. Portanto, o desenvolvimento de um sistema de cultura 3D simples que permite uma medição da função celular sem amostra adicional processamento aumentaria grandemente a utilidade dos sistemas de cultura 3D. O sistema 3D descrito aqui pode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer Ohio Cancer Research (OCR), OH, EUA para financiamento deste trabalho, bem como rei Saud University (KSU), Riade, KSA para patrocinar o primeiro autor. Peso molecular do sensor fluorescente peptídeo foi medido usando matriz assistida, dessorção do laser-ionização, espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF) com assistência do Campus química instrumento centro de espectrometria de massas e proteômica Instalação da Ohio State University.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -. M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening – from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
