Summary
このプロトコルの使用を記述する単一のチェーンの MHC のクラス I 人間 cd8 陽性 T 細胞活性化の分子間相互作用を調査する錯体: 世代人工抗原提示単一のチェーンを表現する細胞の構築では、人間 cd8 陽性 T 細胞クローンの文化そして T 細胞活性化実験。
Abstract
非刺激自己ペプチッド MHC (pMHC) の複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが、co されると呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。このプロトコルを記述する実験的人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子として前もって決定されたペプチドを提示単一のポリペプチド (単一のチェーン MHC) 異種細胞。アゴニスト単一のチェーン p MHC 複合体の低レベルと非刺激の単一チェーン p MHC 複合体の高レベルが表現された条件の下で単一のチェーン非自己を表現しました。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。プロトコルはセル行トランスフェクションを記述単一チェーン MHC 構造、安定したセルの世代ライン、B 型肝炎ウイルスに固有人間 cd8 陽性 T 細胞の培養 T 細胞活性化実験同時に定量化のサイトカイン産生とし脱顆粒。提示方法は知られているペプチッド MHC の特異性と人間の T 細胞における cd 8 + T 細胞活性化のさまざまな側面の研究のため使用できます。
Introduction
MHC のクラス I (MHC-私) 分子は各細胞で合成されるたんぱく質から派生した短い (8-10 アミノ酸) ペプチドを提示します。MHC-私の健康な細胞の分子存在自己ペプチドに由来する内因性のタンパク質です。ウイルス感染は、MHC に非自己ウイルス由来ペプチドのプレゼンテーションにつながる- けど、大量自己ペプチド-MHC (pMHC) の存在下でも感染細胞存在の非自己ペプチド。MHC-私が T 細胞受容体 (TCR) と T 細胞 CD8 共受容体で認識されます。TCR 親和性ペプチド pMHC には、CD8 バインディングはペプチドに依存しないに対し提示されたペプチドのシーケンスに大きく依存です。複雑な非自己アゴニスト pMHC に TCR バインディングは、T 細胞の活性化とエフェクターの機能に します。非刺激の自己 pMHC 複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが co される1,2,3と呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。マウス cd4 陽性 T 細胞4,5,6同様にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞7,8,9,10, Co されるが観察されています。11,12,13生理条件下で T 細胞が抗原提示細胞 (APCs) 共同提示最適な T に貢献するその co される示唆している非刺激 pMHC 錯体の高レベルの限られた数 pMHC アゴニストを認識する必要が。生体内で細胞の応答。総細胞表面の MHC クラス レベル ウイルス感染症14中と腫瘍15ダウンレギュ レートが多い。この免疫回避戦略アゴニスト pMHC プレゼンテーションを減少、また共同作動薬 pMHC の量を減らす私は T 細胞活性化強化のために利用できます。また、高い細胞表面 MHC の発現分子の HLA C が T 細胞の活性化で式に改良された HIV 制御16、総 MHC のクラスの重要な役割を示唆して関連付けるため示されている種します。Co される生理学的意義、にもかかわらずその分子機構はまだ不完全に理解されます。これは主に実験的アゴニスト pMHC を変えずに提示された共同作動薬 pMHC の量を制御する技術的な課題のためです。
実験を行った人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子の単一のポリペプチドとして前もって決定されたペプチドを提示 (単一のチェーン MHC-私は、図 1 a) 異種細胞で9,10 を行します。テトラサイクリン リプレッサー; を表現するハムスター由来の T-レックス町細胞株におけるテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御の下で表現された単一のチェーン (sc) アゴニスト pMHCこれはテトラサイクリンとテトラサイクリン (図 1 b、C) の付加の後の高い sc アゴニスト pMHC 式の不在で sc 作動薬 pMHC の非常に低い「漏れやすい」表現ことができます。当時の sc アゴニスト pMHC 表現する T-レックス CHO 細胞非促進共同アゴニスト sc pMHC と supertransfected-(図 1 b、C) 恒常活性プロモーターの制御下で私。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の高レベルの存在の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。批判的に、以来、ペプチドと MHC-私重鎖は、scMHC にリンクされて共有-私はフォーマット、これにより、事前に決定されたペプチドを提示 MHC 分子に変異の紹介。ScMHC の使用-私技術はこうして特にアゴニストまたは共同作動薬 pMHC の TCR や CD8 バインディングのプロパティを調整することができました。
Cd 8 + T 細胞の活性化で Co されるは、精製された MHC を使用して観察されている-私提示アゴニストと共同アゴニスト ヘテロ11,の形でペプチド複合体17またはに提示量子ドット12,13。APC のアゴニスト pMHC 認識のコンテキストで cd 8 + T 細胞の活性化で共同作動の初期の作品は、Apc として TAP2 欠損細胞株を使用しました。タップは小胞体の細胞質からペプチド輸送に必要なタップ欠乏著しく低下利用可能な MHC クラス - 結合ペプチドのプール。ペプチドのない場合は、MHC の初期の複合体クラス I の重鎖と、β2- ミクログロブリンは安定して、非常に低い MHC の結果-携帯表面表現ですね。当初は、タップ十分・ RMA ヘテロ欠損マウスおよび RMA S セルラインに読み込まれる抗原で刺激された T 細胞の比較それぞれ、Apc は、明らかにしなかった co されるの任意の証拠マウス T 細胞活性化18中。しかし、この実験システムの使用は非刺激の自己 pMHC とは独立して表示作動薬 pMHC の量を正確に制御をできませんでした。さらに、これらの 2 つの細胞株は、T 細胞共刺激または抑制性の受容体にリガンドなどの T 細胞の活性化を調節する他の分子や接着分子の発現にも異なる場合があります。
その後、我々 は非刺激 pMHC の有無で定額作動薬 pMHC のプレゼンテーションを許可する外因性ペプチド TAP2 欠損 RMA S セルの読み込みのためのプロトコルを開発しました。これは次によって達成された: TAP2 欠損 RMA-S の潜伏は空の MHC を安定させるために (28 ° C、代わりに通常の 37 ° C) 低い温度で細胞クラス I 重いチェーン/β2ミクログロブリン錯体19;外因性アゴニスト ペプチドの 28 ° C の孵化外因性非促進ペプチドの存在の有無で 28 ° c の孵化空の MHC の細胞表面発現を減らすために 37 ° C で培養種複合体8,9。この実験のセットアップの使用では、非刺激 pMHC のプレゼンス強化マウス胸腺細胞、素朴な末梢血 cd8 陽性 T 細胞および Ctl8の活性化であることを明らかにしました。機械論的に、非刺激 pMHC の存在は、アゴニスト pMHC の不在でも T 細胞: APC 免疫シナプスに CD8 募集を引き起こすことができるし、非刺激 pMHC CD8 コレセプター7,8と TCR 相互作用を高めることができます。しかし、この実験システムはできませんと思います MHC クラスへ TCR や CD8 のバインドを変更する変更として活性化促進を媒介にアゴニストと共同アゴニスト pMHC する TCR および CD8 のコレセプター バインディングの相対的な貢献をテスト提示されたペプチドに関係なく、すべての MHC の分子に影響を与えます。したがって、この問題を克服するためにチェーンの技術を 1 つ MHC クラスを使用しました。
私は形式の単一のチェーン (sc) MHC クラス治療戦略のための抗原 pMHC プレゼンテーションを改善するために、TCR と NK 細胞受容体の活性化機構に関する基本的な質問に答えるし、20,21 の機能に使用されています。.scMHC-構成ペプチド、β2- ミクログロブリンと MHC-私重鎖は 2 つの柔軟なセリン/グリシンに富んだのリンカー (図 1 a) で参加している、いくつかの異なるリンカー配列されている開発および22のテストします。scMHC-私は複雑なタップとは関係なく折るし、従来の pMHC の複雑なアセンブリの20に必要なタンパク質のシャペロンします。scMHC-私が正しく、22を汚すコンホメーション特異抗体を用いて、x 線結晶構造解析23sc 構造を解くことによって折る示されています。基本的な scMHC-私低親和性ペプチド24,25の結合を改善するために設計が変更されています。
このプロトコルは、人間の scMHC の使用を説明します-ヒト CTL 中 co 作動を調査するクローンのアクティブ化。ヒト CTL クローン B 型肝炎ウイルス (HBV) の抗原のために特定のプロトコルを最適化されています。HBV は、世界中の厳しい医療負担 3 億 5000 万人が b 型肝炎と慢性 b 型肝炎感染に感染肝細胞癌 (HCC) の開発につながることができますがあります。HBV 感染から生じる肝細胞癌細胞 b 型肝炎ウイルス由来の抗原を提示することができます通常、特定の T 細胞によって認識することができます。B 型肝炎と肝クリアランスが人間の T 細胞の応答26に依存していますが、肝細胞癌患者は多くの場合 T 細胞の枯渇および減らされた T 細胞応答27苦しみます。慢性 HBV 感染症28を除去するために潜在的な免疫療法戦略として b 型肝炎ウイルス特定の TCR の HBV の T 細胞への導入を試みた。ただし、それは知られている場合このメソッドは表面の MHC の低レベルのため、臨床の現場で有効になります-ひと肝細胞29で。したがって、coagonism のメカニズムを理解することがあります別の視点 b 型肝炎での免疫療法のおそらく co 作動による T 細胞反応を誘導する内因性の pMHC のプレゼンテーションを強化しています。人間共同作動の研究のためのすべての必要な手順をカバーするプロトコル: アゴニストと共同アゴニストの sc pMHC、安定した T-rex 町細胞ラインの生成、HBV 固有ヒト CTL cd8 陽性 T 細胞株と CTL 活性化の文化と T レックス CHO 細胞のトランスフェクションサイトカイン産生と T レックス CHO 細胞への応答における脱顆粒の定量化実験。Sc MHC の使い方に焦点をクラス I の HBV の T 細胞の活性化中に co 作動を調査する技術、その提示方法簡単に適応できます T 細胞活性化の他の側面の研究のため知られている pMHC ヒト T 細胞系における留意しなければならない-私特異性。
このプロトコルを使用して、人間 cd8 CTL ライン特定 b 型肝炎ウイルス由来ペプチド E183 91 (FLLTRILTI:「E183」)30 HLA A2 に表示されます。sc HLA 分子が人間の β 2-ミクログロブリンから信号系列から成る、関心、グリシン/セリン リンカー、人間の β 2-ミクログロブリン、グリシン/セリン リンカーと重鎖は商業的にすることができます A2 の HLA A2 結合ペプチド合成 (図 1 a).リクエストに応じて著者からプラスミド アゴニスト E183 ペプチッド、または coagonist HIV ギャグ (SLYNTVATL)31ペプチド scA2 コンストラクトがあります。ペプチッド シーケンスは、サイト監督変異を使用して変更できます。テトラサイクリン誘導ベクトルに/pcDNA5 アゴニスト単一の鎖 HLA A2 E183 ペプチド (sc E183 HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン リプレッサー、pcDNA5 の存在下で/プラスミドにより興味の蛋白質の非常に低い、「漏れやすい」表現テトラサイクリン (図 1 b、C) の添加により、高発現を誘起することができます。テトラサイクリン誘導発現システムは、細胞表面のアゴニスト pMHC 発現量を制御できます。発現プラスミド pcDNA3.1 coagonist scA2 ギャグ ペプチド (sc ギャグ HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン調節式 (T-レックス) 町セルライン (ハムスター細胞株、ない内生人間 MHC) は、アゴニストおよび共同アゴニストの sc HLA A2 構造を表現する使用されました。実験的なシステムにより、pMHC のプレゼンテーション (図 1) を正確に制御: pMHC プレゼンテーション (融合 T-レックス)、共同アゴニスト pMHC プレゼンテーション (構成 sc ギャグ HLA A2 式) の高額、低量アゴニスト pMHCプレゼンテーション (不在で sc E183 HLA A2 テトラサイクリン)、アゴニスト pMHC プレゼンテーション (テトラサイクリン存在下で sc E183 HLA A2) の高額、低量アゴニスト pMHC プレゼンテーションと共同作動薬 pMHC の高発現 (sc E183 HLA A2、テトラサイクリン、および構成 sc ギャグ HLA A2 式の不在)。実験的なシステム アゴニストと coagonist pMHC の細胞表面の量の正確なコントロールを使用します。
Protocol
注:すべての手順を含むバイオ セーフティ フード、ライブ、非固定セルの使用を実行して、バイオハザード廃棄物は、地域の保健及び安全性の規則に従って破棄しなければなりません。
1. 町細胞トランスフェクションと安定した町のセルラインの世代
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町細胞トランスフェクション
注:町細胞トランスフェクション ポリエチレンイミン (PEI) の使用について説明します。ただし、代替の方法使用できます、CHO 細胞、市販脂質トランスフェクション試薬を使ってを使って比較的簡単。- 文化町完成 f12 キーでセル (cF12、テトラサイクリン リプレッサーの表現を維持するために 5 %fbs、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、ブラストサイジン 10 μ G/ml を添加した F12)。通路のセルすべての 3-4 日、1:10 の比率。
- トランスフェクション、前日町の細胞懸濁液を準備します。PBS (PBS の T75 フラスコ、T25 フラスコを 5 mL の PBS の 10 mL) を使用してフラスコ内を洗う CHO 細胞。0.05% を追加、フラスコに PBS (T75 フラスコ、T25 フラスコ 1 mL の 2 mL) Trypsin/0.02% EDTA 室温 (RT) で 5-10 分の間孵化させなさいと。光学顕微鏡を使用して、セルをデタッチ、および cF12 をフラスコ (T75 フラスコ、T25 フラスコ 4 mL の 8 mL) に追加することによって trypsinization を停止するを確認します。
- 15 mL チューブ 300-400 x gで 4 ° C または削除した上清で 5 分間遠心し町の細胞懸濁液を転送、再 cF12 (T75 フラスコ、T25 フラスコを 5 mL の 10 mL) で中断し、診断を数えます。
- 60,000-100,000 町細胞/ml の細胞濃度を調整します。6 ウェル プレートのウェルあたり 5 mL の町細胞懸濁液 (300,000-500,000 CHO 細胞) を追加します。37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
- 遺伝子導入の日に 1.5 mL チューブに無血清 F12 のメディアまたはメディアが低い血清の 400 μ L を追加します。メディアの 400 μ L に 3 μ g のプラスミドを追加します。ピペッティングで混ぜます。プリンスエド ワード島の 6 μ g を追加 (1 Mg/ml のプリンスエド ワード島解決の 6 μ L) メディア/DNA ミックス、および 10 のすぐに渦に s。
- 10-15 分間常温メディア/DNA/PEI ミックスを孵化させなさい。この潜伏中、6 ウェル プレートで町携帯メディアを新鮮な cF12 メディアの 5 mL に置き換えます。
- メディア/DNA/PEI ソリューションを CHO のセルに追加します。井戸に滴下し、均等にソリューションを追加します。37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
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安定した町の細胞ラインの生成
- トランスフェクション後、1 日は井戸からメディアを取り外して cF12 各ウェルに適切な選択の抗生物質を含む 5 mL を加えます。PcDNA5TO ベースのプラスミドと pcDNA3 ベースのプラスミッドのため 1 mg/mL ジェネティシン 0.3 mg/mL hygromycin を使用します。
- セル範囲よりも 24 h で 90% の confluency ポスト トランスフェクションは場合、は、セルを trypsinize します。
- ウェルあたり 1 mL の PBS で洗浄、PBS で 0.05% trypsin/0.02% EDTA の 1 mL を追加し光学顕微鏡 RT。 使用で 5-10 分の間孵化させなさい、セル、デタッチ cF12 ウェルあたりの 3-4 mL の追加によって trypsinization を停止ことを確認します。
- 15 mL チューブ 300-400 x gで 4 ° C または削除した上清で 5 分間遠心し町細胞懸濁液を転送し、再 cF12 の 10 mL で中断します。6 ウェル プレートのウェルあたり細胞懸濁液 5 mL を追加します。Transfected セルの収量を最大化するために 2 つの井戸を使用します。
- 37 ° c、5% CO26 ウェル プレートを孵化させなさい。細胞死と光顕微鏡を用いた抵抗性コロニーの成長を監視します。メディアを削除し、4-5 日後または重要な細胞死が観察されるとき適切な抗生物質を含む新鮮なメディアで置き換えます。
- 耐性細胞に達するよりも 70% 合流 trypsinize セルのようにステップ 1.2.2 と拡張用 T25 フラスコに転送。抗生物質の選択は、1-2 週間かかります。
- T25 フラスコにおける抗生物質耐性の CHO 細胞が 70-80% の合流点に達すれば、関心の構造の細胞表面発現を確認する抗体の汚損を実行します。1.2.2 の手順で説明するよう、抗体の汚損、前日 trypsinize のセルと 200,000 セル/ml、細胞濃度を調整 12 ウェル プレートに細胞懸濁液の 1 mL を追加します。テトラサイクリン誘導構造のテスト、テトラサイクリンの 50-60 の ng/mL を追加します。37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
- 井戸の底から CHO 細胞をデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。このメソッドは、蛋白質分解開裂によるエピトープの損傷のリスクを低下させるので、trypsinization をフリーズすることが望ましいです。
- FACS チューブに CHO 細胞を含むメディアの 1 mL に転送します。300-400 × gFWB で希釈した抗 HLA 抗体の 100 μ L で 5 分再中断のための 4 ° C でスピンダウンします。氷の上の 4 ° C で 30 分間インキュベートします。この合計の A2 細胞表面発現レベルを検出するアンチ A2 抗体と TCR のような抗体特定のために汚れる A2 アゴニスト pMHC を検出する E183 ペプチドとの複合体を実行-携帯表面表現のレベルですね。
- 後陽性細胞 MHC 表現、FACS 並べ替えを確認して、遺伝子の損失を減らすために抗生物質でメディアの並べ替えセルを維持します。アゴニスト pMHC を発現する細胞で町、単一細胞選別お勧め pMHC 式共同アゴニスト pMHC と supertransfection と匹敵するアゴニストを確実にします。2-3 週間は町細胞単一セルの並べ替えを次の必要があります。
2. b 型肝炎固有の CTL 文化
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HBV 固有ヒト CTL 再刺激のための送り装置として PBMCs の準備
注: A2-E183 固有の CTL クローンの解凍 PBMCs よりもむしろ新鮮単離 PBMCs 再刺激を与える最良の結果。
注意:血寄付のためのボランティアを募集する前にすべての必要な倫理的な承認を取得します。この作業の目的のため PBMC は NUS の IRB で承認された議定書の下で健康なボランティアから採取した.インフォームド コンセントは、すべてのドナーから得られました。血液疾患の感染のリスクを減らすために人間の血を使用するときは、すべての必要な予防措置を従ってください。- 始める前に、19-20 ° C で遠心温度を設定し、事前ルートに密度勾配 (例えば、Ficoll) を温める
- 部屋の温度密度勾配の 15 mL を 50 mL チューブに追加します。400 x gで 19-20 ° C で 5 分間遠心これは、チューブ側に密度勾配がないことを確認することです。
- 静脈穿刺を健康なボランティア ドナーから血液の 20 mL を収集します。50 mL のチューブで血 20 mL を 15 mL の PBS を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。
- ゆっくりと、2.1.2 のステップからの密度勾配の 15 mL の上に PBS で希釈した血液の 35 mL を追加します。血と密度勾配が混合しないことを確認します。オフ 19 ° c、1,200 × g 20 分ブレーキのチューブを遠心します。
- プラズマ層の約 70% を削除します。PBMC (明確な密度勾配層の上に曇りの層) を含むレイヤーを慎重に吸引ピペット、パスツールを使用して、新しい 50 mL のチューブに配置。
- PBS を PBMCs 50 mL の総数を取得するに追加します。10 分は慎重に真空吸引装置と滅菌ガラス パスツール ピペットを使用して上清を除去またはデカントで 4 ° c、300-400 x gチューブを遠心します。
- 50 mL の PBS のセルを再停止します。10 分は慎重に真空吸引装置と滅菌ガラス パスツール ピペットを使用して上清を除去またはデカントで 4 ° c、300 x gチューブを遠心します。
- 完全な人間の T 細胞のメディア (血清無料メディア 2% 血清を添加した) 2 ml を再中断します。検定を使用してセルをカウントします。このプロトコルは 1-2 x 使用血液 1 mL あたり 10 の6 PBMCs を与える平均。
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CTL 再刺激 PBMCs をフィーダー細胞として使用して
- PBMCs 後続刺激への応答での増殖を阻害する 30 Gy で照射します。
注意: 要件を満たす十分な訓練と研究室とコンプライアンス安全性、照射器を使用する場合。 - 再 2 × 106セル/mL に完全な人間の T 細胞のメディアで照射の PBMCs は中止します。インゲンマメ(PHA) から PBMC サスペンションに 2 倍の濃度で CTL 再刺激サイトカインとレクチンを追加します。最終的なサイトカインと PHA 濃度: 20 U/mL 組換えヒト IL-2, 10 ng/mL 組換え IL-7、10 ng/mL 組換えヒトの il-15 および 1.5 mg/mL PHA。
- 37 ° C の水浴中冷凍 CTL バイアルを解凍します。完全な人間の T 細胞のメディアの 10 mL と 15 mL チューブに解凍のセルを転送します。4 ° C で 300-400 x gで 5 分が真空吸引装置と滅菌ガラス パスツール ピペットを使用して上清を慎重に削除またはデカント スピンダウンします。
- 完全な人間の T 細胞のメディアの 2 mL で Ctl は再中止します。検定を使用してセルをカウントします。106セル/mL の濃度を取得する完全な人間の T 細胞のメディアを追加します。
- 24 well プレートに追加照射 PBMCs の 0.5 mL (106セル) 2 x cytokines と PHA (2.2.2 ステップ)、Ctl (細胞 106 x 0.5) ウェルあたり 0.5 mL とします。使われていた井戸の数は、Ctl の PBMCs の利用可能な合計数に依存します。37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
- CTL の爆発が表示され、メディアが黄色になる、4-5 日後 6 ウェル プレートに文化を転送し、20 U/mL IL-2, 10 ng/mL IL-7 10 ng/mL IL 15 (ない PHA) と完全なヒト T 細胞メディア 4 mL を 1 mL の初期ボリュームを補います。
- 2 〜 3 日後 T75 フラスコに文化を転送、サイトカイン (ステップ 2.2.2, ない PHA) と完全な人間の T 細胞のメディアの 40 mL を加えて、直立位置で文化します。
- 維持 Ctl 1-2x 106セル/mL の濃度でサイトカイン (ステップ 2.2.2, ない PHA) を添加した新鮮なメディアを追加することによってボリュームで既存の文化のボリュームに等しい一日おきで。Ctl は、再刺激後 7-14 日間の実験に使用できます。
- PBMCs 後続刺激への応答での増殖を阻害する 30 Gy で照射します。
3. T 細胞活性化実験
注:典型的な実験が必要ですいくつかの異なる T RExCHO ライン: 融合の T-レックス町細胞 (マイナス コントロール)、T レックス町細胞表現する非刺激 pMHC のみ (scA2 ギャグ; ネガティブ コントロール)、T レックス町細胞作動薬 pMHC の発現の低量-私 (scA2-ENV テトラサイクリン、実験試料なし)、T レックスの町は、アゴニスト pMHC の少量と非促進共同作動薬 pMHC (scA2 ENV と scA2 ギャグ、テトラサイクリン、実験試料なし) の多量を表現する細胞し、細胞の T-レックスの町作動薬 pMHC の多量を表現する-私テトラサイクリン、肯定的な制御と scA2 ENV)図 1、Dに示すように。
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CHO 細胞を抗原提示細胞としてめっき
- T75 フラスコ、1.1.1 の手順で説明されているように培養 CHO 細胞。70-90% の合流点で最良の結果のセルを使用します。T 細胞の活性化の前に 1 日の実験は、1.1.2 のセクションで説明したように、セルを trypsinize します。新鮮後、400 x gで 4 ° C または RT で 5 分間遠心 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送、ピペッティングやデカントで上清を除去します。
- 再 cF12 の 5 mL の細胞ペレットを中断します。CHO 細胞診断をカウントします。
- 2 x 105/mL cF12 を使用するセルの濃度を調整します。アゴニストにテトラサイクリンの 50-60 ng/mL のみ作動薬 pMHC の多量を誘導するためにサンプルを追加-私肯定的な制御 (図 1) として表現します。CHO 細胞は 15 mL チューブに落ち着くのでピペッティングやメッキ前に、のボルテックスでそれらをミックスしておきます。
- T 細胞活性化の試金のため U 下 96 well プレートにウェルあたり町細胞懸濁液 100 μ L を追加し、町セルラインあたりトリプリケートを使用します。町細胞反 MHC 染色、12 ウェル プレートに細胞懸濁液の 1 mL を追加し、細胞あたりトリプリケートを使用します。37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
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T 細胞の活性化試験
注:この T 細胞の活性化試験により、T 細胞の脱顆粒 (CD107a 染色、T 細胞細胞毒性の測定) およびサイトカイン産生の同時定量。- 実験前日 400 x gで 5 分 4 ° C で Ctl 細胞を遠心分離機、検定を使用してカウント、完全な人間の T 細胞のサイトカインや PHA なしメディアで 10 の6セル/mL で細胞を再停止します。37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。この残りの手順の目的は、我々 は最大活性化しないと抗原の少量を観察している CTL の感度を低減します。
- 4 ° C、5 分で 400 × gで遠心分離機 T 細胞、実験の日にデカントやピペットで上澄みを除去し、再 2 mL 完全無血清メディア (サイトカインや PHA) なしで細胞を中断します。診断、ライブ T セルをカウントし、106ライブ細胞/ml (サイトカインや PHA) なしの完全な人間の T 細胞のメディアを使用して T 細胞濃度を調整します。
- 1: 1000 希釈 (1 μ g/mL の最終的な集中) でブレフェルジン A を追加、1: 100 希釈 (2.5 μ g/mL の最終的な集中) で抗 CD107a 抗体を追加します。
- ガラス パスツール ピペットで吸引、プレートをフリックで、96 well プレートの CHO 細胞からメディアを削除します。好評につき、T 細胞懸濁液 (0.2 x 10 の6セル) 含む反 CD107a とブレフェルジン a. 共培養 T 細胞の 3 4 h の CHO 細胞を 200 μ L を追加します。
- 共培養の最後には、T 細胞表面抗原の染色を実行します。スピン ・ 96 ウェル プレート 300-400 x gで、4 ° C で 5 分間ダウンと吸引またはフリックして、上清を除去します。PBS (流洗浄バッファー、FWB) で 0.5 %bsa 細胞表面抗原の染色のウェルあたり 50 μ l 中、CD3 の 2.5 μ L と CD8 抗体の 2.5 μ L を追加します。暗闇の中で 30 分間氷の上のサンプルをインキュベートします。
- ウェルあたり FWB の 150 μ L の追加によってサンプルを洗います。スピン ・ 96 ウェル プレート 300-400 x gで、4 ° C で 5 分間ダウンと吸引またはフリックして、上清を除去します。
- 固定/透過キットを使用して固定/透過の手順に従います。100 μ L/ウェル (固定/透過キット) から固定/透過ソリューションの追加、ピペッティングで混ぜます。20 分間氷の上を孵化させなさい。
- 300-400 × gで 5 分、4 ° C を遠心し、吸引やフリックで上澄みを除去します。パーマ/洗浄バッファー x 1 の 200 μ L を追加 (希釈使用する前に、キットからパーマ/ウォッシュ在庫バッファー x 10) ウェルあたり。この手順を繰り返します。
- 再で 0.3 μ g/mL 抗 IFN-γ 抗体を含む 1 x パーマ/洗浄バッファーの 50 μ L で細胞ペレットを中断します。氷上で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
- 1 x パーマ/洗浄バッファーの 150 μ L を追加します。5 min のための 4 ° C での 300-400 × gで遠心分離し、吸引またはフリックして上清を削除します。パーマ/洗浄バッファー x 1 の 200 μ L 300-400 x、5 分の 4 ° C でgの遠心力し、吸引またはフリックして上清を削除追加します。
- 再 FWB の 200 μ L で各サンプルを中断します。フローサイトメトリーによる解析を続行します。
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町の細胞の MHC のクラス I 染色
注: scMHC を確認することが重要-セルの各実験に使用するセルの表面のレベルは細胞が遺伝子発現を失う可能性があります私。T 細胞の刺激のための 96 ウェル プレートを準備するときは、セクション 3.1.4 に示すよう町細胞染色、12 ウェル プレートを設定します。- 井戸の底から CHO 細胞をデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。このメソッドは、蛋白質分解開裂によるエピトープの損傷のリスクを低下させるので、trypsinization をフリーズすることが望ましいです。
- FACS チューブに CHO 細胞を含むメディアの 1 mL に転送します。FWB で希釈した抗 HLA 抗体の 100 μ L で 5 分再中断のための 4 ° C で 300-400 x gでスピンダウンします。氷の上の 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
- この合計の A2 細胞表面発現レベルを検出するアンチ A2 抗体と TCR のような抗体特定のために汚れる A2 E183 ペプチド32アゴニスト pMHC を検出すると実行-携帯表面表現のレベルですね。
- 各町のサンプルに FWB の 1 mL を追加、300-400 × g、4 ° C、5 分でスピン ・ ダウンと FWB の 0.3 mL のサンプルを再度中断します。フローサイトメトリー解析を続行します。
Representative Results
Sc の MHC のクラス I ここで使用される技術により、MHC クラスの細胞表面発現の精密制御 T 細胞の活性化を誘導するために知られている、共有リンクのペプチドと私。(図 1、E) 共同作動薬 pMHC の有無で作動薬 pMHC の低レベルのプレゼンテーションを可能にする設計された異種 APC システム (図 1 a B、C) を生成します。批判的に、共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 (図 1E) の共発現による E183 HLA A2 は変わらないアゴニスト sc のプレゼンテーションを表示する HLA A2 提示 E183 ペプチドの特定の TCR のような抗体を使いました。しかし、E183 HLA A2 TCR のような抗体が HLA A2 提示ギャグ ペプチド (図 1E) いくつかのバインディングを示していますそれに注意する必要があります。異なるペプチッドまたは MHC の分子を使用して異なる特異性と人間の T 細胞の TCR やコレセプターの相互作用に必要な分子を調査する、同様に設計された抗原細胞システムを提示を構築できます。
我々 は、E183 HLA A2 特異的 cd 8 + T 細胞クローン人間を刺激するためにこれらの設計された Apc を使用しました。3 つの否定的なコントロールが使用された: T 細胞のみ、融合の T-レックス CHO 細胞と T レックス CHO 細胞 (融合の T-レックスの町で表現される任意の分子によって共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 潜在的な T をテストするための高い金額を表現する T-レックス CHO 細胞の細胞の活性化細胞 T 細胞のみと比較して)、sc ギャグ-HLA A2 (T レックス CHO 細胞融合の T-レックス CHO 細胞と比較して sc-ギャグ HLA-A2 の高レベルを表現) で T 細胞の活性化。融合の T-レックス CHO 細胞または sc ギャグ-HLA A2 を表現する T-レックス CHO 細胞を誘発しなかった E183 HLA A2 特異的 cd 8 + CTL クローンのアクティブ化 IFN-γ 産生と T 細胞の指標として脱顆粒マーカー CD107a の発現を定量化することで決定されます。細胞毒性 (図 2 a、B)。アゴニスト sc E183-HLA-A2、肯定的な制御、誘導非常に効率的な IFN-γ 産生および脱顆粒 (図 2 a, B)、として使用される特定の TCR がアクティブに sc HLA A2 構築を認識できることを示す高レベルの式T 細胞のエフェクター機能。Sc E183 HLA A2 の低レベルの発現誘導の IFN-γ 産生と脱顆粒, より低いレベル、これは共同アゴニスト sc ギャグ HLA A2 (図 2 a、B) の存在によって増強されました。CD107a + T 細胞の割合が非常に高いが抗原 pMHC (図 2 b)、アゴニスト pMHC T 細胞の誘導のための量のための比較的低い要件の以前の報告と矛盾の低レベルへの応答でも観察されたことが注意されなければなりません。細胞毒性33。単一のセル単位で顆粒の量を示す CD107a MFI は、優れたダイナミック レンジ (図 2 b) を提供します。T 細胞活性化の試金が使用できる 2 つの主要なエフェクターの機能の同時定量: サイトカイン生産と細胞毒性、良好なダイナミック レンジを非常に敏感な読み出しを提供します。
共同作動薬 pMHC に TCR バインディングが共同アゴニスト pMHC 依存性活性化強化のため必要かどうかをテストする単一のチェーン技術を使いました。我々 は突然変異 HLA A2 ペプチド結合溝 (図 3 b) の端に位置 152 でバリンを HLA A234TCR バインディングを廃止するこの突然変異が報告されているとグルタミン酸 V152E 変異体を作成します。V152E 突然変異はアゴニスト sc E183 HLA A2 にこの突然変異を導入し、T レックス CHO 細胞で突然変異体アゴニスト sc 構造を表現することによって、使用 E183 HLA A2 CTL クローンの TCR バインディングを廃止することができる場合、テストしました。野生のタイプ、しかしない V152E sc E183 HLA A2 には、E183 HLA A2 特定 CTL クローンを使用 (図 3 a) の活性化が誘導されます。MHC クラスのいずれかに TCR 結合変異として突然変異の効果の TCR と pMHC の複雑な正確な分子間相互作用に依存し、これらによって異なりますが、使用する個々 の TCR/T 細胞クローンの各を個別にテストする必要がある必要があります。異なる Tcr。たとえば、我々 は 8 つの変異をテスト、どちらかは以前 TCR 結合変異や HLA A2 にペプチド結合廃止せず TCR バインディングを混乱させることを予測した突然変異を報告しました。これらは、V152E だった E183 特定の T 細胞クローンのアクティブ化を廃止しただけの突然変異は10を使用します。共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 に V152E 突然変異を導入し、共同 WT または V152E sc ギャグ HLA A2 アゴニスト sc E183 HLA A2 の低レベルを表現しました。WT ・ V152E sc ギャグ HLA A2 強化、IFN γ 産生と脱顆粒 (図 3、D)、共同アゴニスト pMHC に TCR バインディングが共同アゴニスト pMHC 依存性 cd8 陽性 T 細胞活性化強化の必要がないことを示唆しています。シングル チェーン MHC クラス I の技術は、ここで示す、TCR はおよび/または T 細胞の抗原認識と活性化に必要な分子を調査するコレセプター MHC クラス I 知られているペプチド結合を変更するのには使用することができます。
図 1: 単一のチェーン HLA A2 構築人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化における共同アゴニストを調査するために使用します。(A) 溶かされた人間 β2ミクログロブリン、選択、柔軟なグリシン セリン リンカー (GGGGSGGGGS GGGGS)、人間の β2ミクログロブリン、柔軟なペプチドから共有信号系列から成る scHLA A2 構造の模式図グリシン セリン リンカーと HLA A2 重鎖。(B) 人工抗原提示人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化で co 作動を調査する細胞を生成するために使用するプラスミドの模式図: テトラサイクリン リプレッサー、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でアゴニスト sc E183 HLA A2非促進共同アゴニスト sc ギャグ HLA A2 恒常活性プロモーターの制御下で。(C) 設計の抗原提示細胞を使用して調査される co の模式図: T-レックス CHO 細胞 (ないのヒトの MHC の発現)、T レックスの CHO 細胞 (非促進共同アゴニスト pMHC) sc ギャグ HLA A2 の恒常高レベルを表現テトラサイクリン (アゴニスト ペプチドの低レベル) の不在で sc E183 HLA A2 の低い「漏れやすい」レベルを表現する T-レックス CHO 細胞、T レックス CHO 細胞 (アゴニスト ペプチドの高レベル)、テトラサイクリン存在下で sc E183 HLA A2 の高レベルを表現する T-レックス町細胞sc E183 HLA A2 の低レベルと高レベル sc ギャグ HLA A2 (アゴニスト ペプチドの低レベル) および共同アゴニスト ペプチドの高レベルを表現します。(D) セル設計された抗原抗 HLA A2 抗体を用いた細胞株を提示の表面の汚損します。示されている数字は、ライブセル ゲートの MHC 汚れの MFI の値を示します。データ設計抗原提示細胞を用いた HLA A2 提示 E183 ペプチドに対する特定の TCR のような抗体の細胞 5 独立実験 (E) 表面染色の代表。示されている数字は、ライブセル ゲートの MHC 汚れの MFI の値を示します。5 独立した実験の代表的なデータ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サイトカイン産生および cd8 CTL クローン人間 E183 HLA A2 特有の脱顆粒共同作動薬 pMHC の存在が強化されています。(A) 細胞内インターフェロン-γ 3 h 刺激示された A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの染色抗原提示細胞を設計。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(B) 細胞は、CD107a 染色 A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローン後 3 h 刺激示された設計抗原提示細胞表面します。表示される番号は、CD107a 染色陽性の割合や cd8 陽性 T 細胞集団の CD107a MFI を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 共同アゴニスト-仲介された T 細胞活性化強化を複雑な共同アゴニスト pMHC に TCR バインド必要としません。(A) sc E183 HLA A2 の V152E 突然変異は E183 HLA A2 特定人間 cd8 CTL クローンのアクティブ化を廃止します。T-レックス CHO 細胞の高発現 (テトラサイクリン誘導) WT または V152E の突然変異体 sc E183 HLA A2 は、3 h の E183 HLA A2 特定人間 cd8 CTL クローンを刺激するために使用されました。T 細胞の活性化細胞の IFN-γ の染色を用いて定量化。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(B) HLA A2 のペプチド結合溝内 V152E の突然変異の場所です。(C) 複合 sc ギャグ HLA A2 共同作動薬 pMHC の V152E の突然変異に co agonist 依存性活性化強化廃止しません。細胞内インターフェロン-γ 染色 A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの 4 h 刺激示された後に、抗原提示細胞が設計されています。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(D) 複雑な sc ギャグ HLA A2 共同作動薬 pMHC の V152E の突然変異に co agonist 依存性活性化強化廃止しません。表面 CD107a を汚すセル A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの 3 h 刺激示された抗原提示細胞に設計された後。表示される番号は、CD107a 染色陽性の割合や cd8 陽性 T 細胞集団の CD107a MFI を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
提案するプロトコルは、人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化における分子間相互作用の解明の堅牢なツールを提供します。人間の T 細胞のアクティブ化中に co されるの調査のための重要なステップは、アゴニスト pMHC 細胞表面発現 pMHC Apc 共同アゴニスト pMHC 式の有無について等しいアゴニストを確保するための制御です。実験体制の共同アゴニスト pMHC アゴニストを構築し pMHC 定量化 TCR のような抗体10、を使用して supertransfection がそれに続く作動薬 pMHC の少量を表現する単一細胞クローンを使用して、これは、32. アゴニスト sc pMHC 式は、時間をかけて変更することが、TCR のような抗体を用いた実験で使用されている Apc のアゴニスト pMHC 表面式を定量化する重要です。特定の TCR のような抗体がない場合アゴニスト scMHC-蛍光タンパク質融合として表現できる、全内部反射蛍光顕微鏡などの機密性の高い顕微鏡法を使用しては、その細胞表面発現を定量化し、35,36しますさらに、共同作動薬 pMHC の細胞表面発現37CMV プロモーターのメチル化依存性および非依存を黙らせるために、時間をかけて減少し抗体染色と流れフローサイトメトリー解析を用いた監視する必要があります。繰り返し FACS の並べ替えに必要なとき。Sc pMHC 式の比較的限られた損失で最大 5 週間 CHO 細胞培養を行ったが。我々 はすぐに知られている sc MHC の発現と細胞の信頼性の高い在庫を確保するための選択/並べ替え後 CHO 細胞を凍結をお勧めします。
示されたプロトコルのいくつかの手順は、機器の可用性によって、または特定の研究目的に応じて変更できます。たとえば、PBMC 拡散潜在的なガンマ (または x) を必要としない方法を使用すると抑制 (ステップ 3.2.1) にすることができます照射、マイトマイシン C38による治療など。セル ステップ 3.3.1 でこするのではなく、金属キレート剤39を含む非酵素的細胞解離バッファーを使用できます。異なる Tcr 町細胞エクスプレス ハムスター MHC を表現する CTL クローン人間のクラス I の分子とこれらがここで学んだ CTL ラインの関連がより適しているように抗原提示システムを変更ことができますさらに、(図 2 aと。図 3 a、認められなかった融合 CHO 細胞 T 細胞応答)、他の人間の Tcr がありますいくつかの xenoreactivity を示す可能性があります。ハムスター β 2-microglubulin をノックして削減することができますまたは CRISPR/Cas9; を使用してをタップこと場合は、ハムスターの MHC のクラス I の式または CRISPR/Cas9 を介する β 2 microglubulin またはタップをノックアウトした後、人間の APC ラインを使用ことができます。
ここで紹介する実験システムは、事前定義されたペプチドを提示 MHC 分子と TCR および CD8 の相互作用の正確に制御できます。たとえば、我々 は以前にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞9,10coagonist を介した活性化促進を廃止 CD8 バインディング40 coagonist pMHC の突然変異に排除 TCR 廃止に対し共同作動薬 pMHC との相互作用には、coagonist を介した活性化強化10の影響はなかった。ただし、シングル チェーン MHC 構造の使用には、いくつか制限があります。たとえば、時間だし、複数プラスミドで異なるペプチドとその後 transfections 細胞選別と sc MHC の世代にこの実験のシステムを使用して複数の共同アゴニスト ペプチドをテストするのには手間のかかるシーケンスします。以前、マウス T 細胞活性化8,9, 複数共同アゴニスト ペプチドをテストにマウス タップ欠損細胞株 RMA-s を使用したが、このアプローチはタップ欠乏人間 T2 細胞ラインと10、最も可能性の高い成功しませんでした。タップに依存しないペプチド41に表現。実験体制のもう一つの制限は、T 細胞の活性化をトリガーするために必要な共同作動薬 pMHC の臨界量を決定する目的のため共同アゴニスト pMHC 分子の量を変更するための高速化手法を行いません。また、使用されるテトラサイクリン誘導システムでは許可されませんアゴニストの滴定単一セルのレベルで pMHC 数量テトラサイクリン濃度を変更するさまざまなテトラサイクリン濃度 HLA A2 陽性細胞の割合を変えるとなくセルごとごとに HLA A2 レベル。現在行っている別のアプローチ脂質二重膜42、以前マウス cd 4 + T 細胞活性化4中 co 作動を調査する使用を使用することですまたは提示定額でアゴニスト pMHC ビーズ、共同作動薬 pMHC のさまざまな量の存在。これらの代替実験系の共同作動薬 pMHC の量が異なると同様に、複数の共同アゴニスト ペプチド配列の高速テストように紫外線分解ペプチド技術4,43と組み合わせて使用すると、.
Sc MHC 技術は、単一のチェーン MHC クラス II 分子を提示済みペプチドは、哺乳類の細胞表面44に正常に表現されているように人間またはマウスの CD4 T 細胞の co されるの調査に適用もなることができます。また、sc MHC 技術の使用は HLA 大腸菌などの非古典的 MHC の分子の調査に拡張できます。Sc HLA-E は、前に記載されている、その表現45人間の T 細胞の活性化を阻害することが示されています。興味の別の非古典的 MHC 分子は CD1 ペプチド46の代わりに脂質を提示です。細胞表面に発現することと関連する脂質配位子47をバインドする CD1 重鎖と β 2-ミクログロブリンから成る Sc 構造が示されています。シングル チェーン MHC 技術 T および NK 細胞の活性化に分子間相互作用を調査するための調査ツールとして大きな可能性があります。
Disclosures
著者は競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、シンガポール保健省の下にそのデザイナーデュオに R571-002-012-592, 国立研究財団 Investigatorship R571-000-272-281 デザイナーデュオに作成によって N.R.J.G. にその CBRG/0064/2014 年の下で国の医学研究評議会によって支えられました。。、、a. b. へのシンガポールのトランスレーショナル ・ リサーチ (星) 奨励賞 (ナノ材研/スター/013/2012)専門家細胞選別の NUS 免疫プログラム フロー中核施設から博士ポール ハッチンソンと氏テオ郭ヒュイに感謝しております。原稿の批判的読解のエリヤ陳に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
| Blasticidin | Gibco | R21001 | |
| Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
| F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
| Geneticin | Gibco | 10131035 | |
| GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
| Hygromycin | Gibco | 10687010 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
| Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
| 10x PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
| Recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
| Recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
| 10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Antibodies | |||
| CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
| CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
| CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
| HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
| IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |
References
- Gascoigne, N. R. Do T cells need endogenous peptides for activation? Nature Reviews. Immunology. 8 (11), 895-900 (2008).
- Gascoigne, N. R., Zal, T., Yachi, P. P., Hoerter, J. A. Co-receptors and recognition of self at the immunological synapse. Current Topics in Microbiology and Immunology. 340, 171-189 (2010).
- Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
- Krogsgaard, M., et al. Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity. Nature. 434 (7030), 238-243 (2005).
- Ebert, P. J., Jiang, S., Xie, J., Li, Q. J., Davis, M. M. An endogenous positively selecting peptide enhances mature T cell responses and becomes an autoantigen in the absence of microRNA miR-181a. Nature Immunology. 10 (11), 1162-1169 (2009).
- Lo, W. L., et al. An endogenous peptide positively selects and augments the activation and survival of peripheral CD4+ T cells. Nature Immunology. 10 (11), 1155-1161 (2009).
- Yachi, P. P., Ampudia, J., Gascoigne, N. R., Zal, T. Nonstimulatory peptides contribute to antigen-induced CD8-T cell receptor interaction at the immunological synapse. Nature Immunology. 6 (8), 785-792 (2005).
- Yachi, P. P., Lotz, C., Ampudia, J., Gascoigne, N. R. T cell activation enhancement by endogenous pMHC acts for both weak and strong agonists but varies with differentiation state. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2747-2757 (2007).
- Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
- Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
- Juang, J., et al. Peptide-MHC heterodimers show that thymic positive selection requires a more restricted set of self-peptides than negative selection. The Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1223-1234 (2010).
- Anikeeva, N., et al. Quantum dot/peptide-MHC biosensors reveal strong CD8-dependent cooperation between self and viral antigens that augment the T cell response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (45), 16846-16851 (2006).
- Anikeeva, N., Gakamsky, D., Scholler, J., Sykulev, Y. Evidence that the density of self peptide-MHC ligands regulates T-cell receptor signaling. PloS One. 7 (8), e41466 (2012).
- Schuren, A. B., Costa, A. I., Wiertz, E. J. Recent advances in viral evasion of the MHC Class I processing pathway. Current Opinion in Immunology. 40, 43-50 (2016).
- Bubenik, J. MHC class I down regulation, tumour escape from immune surveillance and design of therapeutic strategies. Folia Biologica. 51 (1), 1-2 (2005).
- Apps, R., et al. Influence of HLA-C expression level on HIV control. Science. 340 (6128), New York, N.Y. 87-91 (2013).
- Cebecauer, M., et al. CD8+ cytotoxic T lymphocyte activation by soluble major histocompatibility complex-peptide dimers. The Journal of Biological Chemistry. 280 (25), 23820-23828 (2005).
- Sporri, R., Reis e Sousa, C. Self peptide/MHC class I complexes have a negligible effect on the response of some CD8+ T cells to foreign antigen. European Journal of Immunology. 32 (11), 3161-3170 (2002).
- Ljunggren, H. G., et al. Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346 (6283), 476-480 (1990).
- Kotsiou, E., Brzostek, J., Gould, K. G. Properties and applications of single-chain major histocompatibility complex class I molecules. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (3), 645-655 (2011).
- Hansen, T. H., Connolly, J. M., Gould, K. G., Fremont, D. H. Basic and translational applications of engineered MHC class I proteins. Trends in Immunology. 31 (10), 363-369 (2010).
- Yu, Y. Y., Netuschil, N., Lybarger, L., Connolly, J. M., Hansen, T. H. Cutting edge: single-chain trimers of MHC class I molecules form stable structures that potently stimulate antigen-specific T cells and B cells. Journal of Immunology. 168 (7), Baltimore, Md. 3145-3149 (2002).
- Mitaksov, V., et al. Structural engineering of pMHC reagents for T cell vaccines and diagnostics. Chemistry & Biology. 14 (8), 909-922 (2007).
- Truscott, S. M., et al. Disulfide bond engineering to trap peptides in the MHC class I binding groove. Journal of Immunology. 178 (10), Baltimore, Md. 6280-6289 (2007).
- Truscott, S. M., et al. Human major histocompatibility complex (MHC) class I molecules with disulfide traps secure disease-related antigenic peptides and exclude competitor peptides. The Journal of Biological Chemistry. 283 (12), 7480-7490 (2008).
- Bertoletti, A., Ferrari, C. Innate and adaptive immune responses in chronic hepatitis B virus infections: towards restoration of immune control of viral infection. Postgraduate Medical Journal. 89 (1051), 294-304 (2013).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81 (8), 4215-4225 (2007).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Gehring, A. J., et al. The level of viral antigen presented by hepatocytes influences CD8 T-cell function. Journal of Virology. 81 (6), 2940-2949 (2007).
- Bertoni, R., et al. Human histocompatibility leukocyte antigen-binding supermotifs predict broadly cross-reactive cytotoxic T lymphocyte responses in patients with acute hepatitis. The Journal of Clinical Investigation. 100 (3), 503-513 (1997).
- Goulder, P. J., et al. Patterns of immunodominance in HIV-1-specific cytotoxic T lymphocyte responses in two human histocompatibility leukocyte antigens (HLA)-identical siblings with HLA-A*0201 are influenced by epitope mutation. The Journal of Experimental Medicine. 185 (8), 1423-1433 (1997).
- Sastry, K. S., et al. Targeting hepatitis B virus-infected cells with a T-cell receptor-like antibody. Journal of Virology. 85 (5), 1935-1942 (2011).
- vanden Berg, H. A., et al. Cellular-level versus receptor-level response threshold hierarchies in T-cell activation. Frontiers in Immunology. 4, 250 (2013).
- Moots, R. J., Matsui, M., Pazmany, L., McMichael, A. J., Frelinger, J. A. A cluster of mutations in HLA-A2 alpha 2 helix abolishes peptide recognition by T cells. Immunogenetics. 34 (3), 141-148 (1991).
- Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), e53158 (2015).
- Mariati,, Koh, E. Y., Yeo, J. H., Ho, S. C., Yang, Y. Toward stable gene expression in CHO cells. Bioengineered. 5 (5), 340-345 (2014).
- Matsushita, S., Tanaka, Y., Matsuoka, T., Nakashima, T. Clonal expansion of freshly isolated CD4T cells by randomized peptides and identification of peptide ligands using combinatorial peptide libraries. European Journal of Immunology. 31 (8), 2395-2402 (2001).
- Heng, B. C., Cowan, C. M., Basu, S. Comparison of enzymatic and non-enzymatic means of dissociating adherent monolayers of mesenchymal stem cells. Biological Procedures Online. 11, 161-169 (2009).
- Smith, K., et al. Sensory adaptation in naive peripheral CD4 T cells. The Journal of Experimental Medicine. 194 (9), 1253-1261 (2001).
- Wei, M. L., Cresswell, P. HLA-A2 molecules in an antigen-processing mutant cell contain signal sequence-derived peptides. Nature. 356 (6368), 443-446 (1992).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Bakker, A. H., et al. Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3825-3830 (2008).
- Rhode, P. R., et al. Single-chain MHC class II molecules induce T cell activation and apoptosis. Journal of Immunology. 157 (11), Baltimore, Md. 4885-4891 (1996).
- Crew, M. D., Cannon, M. J., Phanavanh, B., Garcia-Borges, C. N. An HLA-E single chain trimer inhibits human NK cell reactivity towards porcine cells. Molecular Immunology. 42 (10), 1205-1214 (2005).
- Van Kaer, L., Wu, L., Joyce, S. Mechanisms and Consequences of Antigen Presentation by CD1. Trends in Immunology. 37 (11), 738-754 (2016).
- Im, J. S., et al. Direct measurement of antigen binding properties of CD1 proteins using fluorescent lipid probes. The Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 299-310 (2004).
