Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول مقايسة فخ خارج الخلية العَدلات (صافي) حساسة للغاية وعالية إنتاجية للتحديد الكمي شبه الآلي للسابقين تشكيل فيفو نت التي الفلورة مجهرية [كنفوكل] ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم تكوين الصافية وتدهور بعد المحفزات المختلفة، ويمكن استخدامها لدراسة العلاجات المحتملة المستهدفة للشبكة.

Abstract

الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات) هي مكسبه هياكل الحمض النووي خارج الخلية التي يمكن إصدارها من قبل العَدلات على مجموعة متنوعة واسعة من المشغلات. لقد ثبت شباك لتكون بمثابة إليه للدفاع مهمة مضيف الفخاخ ويقتل الكائنات الحية الدقيقة. من ناحية أخرى، قد تورطت في أمراض المناعة الذاتية جهازية متنوعة. شبكات هي هياكل مكسبه والسامة التي تحتوي على مجموعة أوتوانتيجينس ذات الصلة بما في ذلك الأجسام المضادة نيوتروفيل هيولى (ANCA)-المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (إف) والذئبة الحمامية الجهازية (SLE). يمكن الناجمين عن أشكال مختلفة من شبكات اعتماداً على التحفيز. مقدار شبكات يمكن قياسها كمياً باستخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك قياس الإفراج عن الحمض النووي في supernatants، قياس الحمض النووي-الرصاصية مع الصافي بين الجزيئات مثل ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) أو elastase العَدلات (شمال شرق)، قياس وجود سيتروليناتيد هيستونيس المجهري الأسفار، أو تدفق سيتوميتريك الكشف عن مكونات شبكة لها كلها من ميزات مختلفة فيما يتعلق بخصوصية وحساسية، والموضوعية، وكمية. هنا بروتوكول تحديد مقدار السابقين تشكيل فيفو نت بطريقة حساسة للغاية، والفائق باستخدام مجهر الفلورة ثلاثي الأبعاد [كنفوكل]. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعالجة مختلف مسائل البحث عن تكوين NET وتدهور في الصحة والمرض.

Introduction

تشكيل الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات) هو العملية التي العَدلات الإفراج عن عينات من الحمض النووي في شبكة (3D) ثلاثي الأبعاد خارج الخلية مثل هيكل، الرصاصية مع مجموعة واسعة من الجزيئات المضادة للميكروبات والخطرة، الحبيبية و هيولى الإنزيمات، الببتيدات والبروتينات. هذه الهياكل مكسبه والسامة دوراً هاما فسيولوجية في الدفاع المناعي الفطري للأشخاص الأصحاء بمحاصرة وقتل مسببات الأمراض المعدية1. بيد أنهم قد أثبتت أيضا أن تشارك في تجلط الدم2 ومختلف أمراض المناعة الذاتية الشاملة، بما في ذلك الأجسام المضادة نيوتروفيل هيولى (ANCA)-المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (إف)3، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE )4،5،2،متلازمة الفوسفولبيد (الجزائرية)6والتهاب المفاصل الرثياني (RA)، والصدفية والنقرس7،،من89.

ودرست تشكيل الصافي في المختبر على نطاق واسع phorbol المركب الكيميائي 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، مما يؤدي إلى تشكيل شبكة واسعة النطاق. لكن معظم المنبهات الفسيولوجية الحث على مستويات أقل بكثير من تشكيل الصافي10. لدراسة صافي-المشغلات في، على سبيل المثال، وضع أمراض المناعة الذاتية، مطلوب مقايسة كمية موحدة، حساسة، الفائق لكشف وتحديد تشكيل صافي. التحديد الكمي لشبكات قد ثبت أن التحدي وتتم حاليا بأساليب مختلفة، كل منها11المزايا والقيود الخاصة بها. هو أسلوب المستخدمة عادة الكشف عن الحمض النووي في supernatants12، الذي هو الهدف ولكن لا تميز بين الأصل من الحمض النووي (apoptotic، نخرية، شبكات)، وبالتالي فليس محددة جداً لشبكات. ثانيا، يتم اتباع نهج أكثر تحديداً للكشف عن شبكات فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) من الحمض الرصاصية مع البروتينات الخاصة بالشبكة، على سبيل المثال، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) أو elastase العَدلات (شمال شرق)، وأظهرت ترتبط كذلك سيتروليناتيد هيستون-3 (CitH3) إيجابية شباك13. بيد أنه لا يعرف ما إذا كان هذا الأسلوب حساسة بما يكفي لالتقاط جميع الشباك (مثل الخطة الرئيسية للعمليات، ني، وشبكات CitH3 السلبية). وثمة نهج ثالث هو مجهر الفلورة المستخدمة للكشف عن التعريب المشارك من الجزيئات المرتبطة بالشبكة (NE، الخطة الرئيسية للعمليات، CitH3) مع الحمض النووي خارج الخلية لتحديد شبكات. هذا الأسلوب عموما محددة للشباك، ولكن لا يمكن تطبيقه كأسلوب الفائق، وليس الهدف بسبب التحيز المراقب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب لا تأخذ في الاعتبار الخطة الرئيسية للعمليات-، ني-، شبكات CitH3 السلبية التي تكون موجودة غالباً تبعاً لمشغل الشبكة المستخدمة14،15. التدفق الخلوي نهج الكشف عن شبكات من خلال تغير الأمام/سيديوارد مبعثر (منتدى التعاون الأمني/SSC) تشير إلى تورم النواة في صافي-تينغ العَدلات16. هذا الأسلوب لا تراعي الأشكال المختلفة لتشكيل الصافية التي تم تحديدها، مما قد لا تشمل تورم النواة، مثل تشكيل شبكة حيوية17. وأخيراً، طبق مجهرية [كنفوكل] الفلورة تصور وتحديد تشكيل الصافية تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية مع صبغة خلية كتيمة البقع12،الحمض النووي خارج الخلية18مباشرة. عموما، 5 إلى 10 حقول عالية الطاقة يدوياً اختار وتقييمها، الذي يغطي 1-5% من كل بئر من11،لوحة 96-كذلك17. دليل اختيار الصور ليست دائماً موضوعية وعرضه للتحيز وغير جذابة للتحليل الفائق. تحليل الكمي صافية مؤتمتة، الفائق وضعت مؤخرا، تصويرها 11% البئر بطريقة ثلاثية الأبعاد تغطي 13 ميكرون من خلال الفحص المجهري [كنفوكل] الفلورة مكدسة Z، مما يؤدي إلى تقنية حساسة للغاية لتقييم شبكات بالمقارنة مع الأساليب التقليدية10. ويصف التقرير الحالي البروتوكول الأكثر حداثة للتحديد الكمي لتشكيل صافية من خلال مقايسة الآلي، حساسة للغاية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] ثلاثية الأبعاد، مما يحقق المصورة مساحة إجمالية قدرها 45 في المائة من كل بئر ويغطي 27 ميكرون من خلال Z-مداخن. هذا البروتوكول مناسبة للقياس الكمي، مع حساسية عالية، مستويات منخفضة من تشكيل الصافي بطريقة غير متحيزة والهدف.

Protocol

لم يرض جميع المرضى وضوابط صحية للمشاركة في المصرف البيولوجي لومك. كلتا الدراستين بيوبانكينج أقرتها اللجنة الأخلاقية لومك.

1-عزل العَدلات صحية

  1. الحصول على 20 مل دم المحيطي من مانح صحية في أنبوبين المغلفة يدتا 10 مل.
  2. وضع 10 مل دم في أنبوب 50 مل عقيمة وإضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تصل إلى 32.5 مل.
  3. إضافة الكثافة المتدرجة (على سبيل المثال.، أميدوتريزوات فيكل) ضمن الخلايا.
    1. يستغرق 14 مل كثافة المتدرجة مع بيبيت 10 مل وتحكم بيبيت.
    2. مكان بيبيت في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل.
    3. تأخذ وحدة تحكم بيبيت قبالة بيبيت، مما يتيح التدرج كثافة تدفق خارج بيبيت حسب خطورة حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى من تأثير الشعرية (سيتم ترك 1-2 مل)، دون استخدام المحرك.
    4. إزالة بيبيت بوضع إبهام على رأس بيبيت، مما يمنع الكثافة المتدرجة من تسرب أثناء إزالة بيبيت.
  4. وتدور هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 912 x ز ودرجة حرارة الغرفة (RT) دون تسريع أو فرامل.
    ملاحظة: خلايا الدم الحمراء (RBC) والعدلات بكثافة عالية وهي في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل. خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) المنفصلين عن ذويهم وأعلى كثافة التدرج كعصابة بيضاء. سوف تكون البلازما المخفف PBS أعلاه ببمكس. إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون معزولة ببمكس بنقل الخاتم الأبيض إلى أنبوب 50 مل جديدة مع خطوات الغسيل إضافية مع برنامج تلفزيوني.
  5. بعناية إزالة الطوق الأبيض الذي يحتوي على ببمكس أولاً، متبوعاً بإزالة البلازما المخفف برنامج تلفزيوني، وأخيراً كثافة طبقة متدرجة بقدر الإمكان.
  6. لعزل العَدلات من مزيج العَدلات/الكريات الحمراء، الكريات الحمراء بالماء المقطر المعقم البارد.
    1. تأخذ زجاجة ماء مقطر معقم الباردة وعلامة x 10 يتركز برنامج تلفزيوني قارورة من الثلاجة.
    2. العمل بسرعة لهذه الخطوة. إضافة 36 مل ماء المقطر المعقم البارد مباشرة على رأس بيليه ويخلط مرة واحدة بعناية. إضافة 4 مل من 10 x برنامج تلفزيوني بعد 20 ثانية لجعل حلاً متساوي التوتر. المزيج مرة واحدة بعناية.
    3. تدور أنبوب لمدة 5 دقائق في 739 x ز و 4 درجة مئوية (لإزالة كرات الدم الحمراء). وسوف تكون العَدلات في بيليه الأبيض.
    4. تجاهل المادة طافية بعناية. نفذ الخطوة 1.6.2 مرة أخرى وتأكد من بيليه مرحلياً بشكل صحيح.
    5. تدور أنبوب لمدة 5 دقائق في 328 س ز و 4 درجة مئوية.
    6. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني. الاعتماد العَدلات وإبقائهم على الجليد.
      ملاحظة: العائد المتوقع من أنبوب 1 من الدم (10 مل) هو ما يقرب من 15 مليون العَدلات.

2-الأحمر نيون خلية وسمها العَدلات

  1. جعل تعليق العَدلات العَدلات 10 مليون في 2 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل.
  2. جعل حلاً 2 مل برنامج تلفزيوني مع 4 ميليلتر من 2 ميكرومتر خلية الفلورسنت الأحمر رابط (انظر الجدول للمواد) في أنبوب مختلفة 15 مل. إضافة هذا بلطف إلى تعليق العَدلات والمزيج بعناية.
  3. احتضان في الظلام لمدة 25 دقيقة بالضبط في 37 درجة مئوية لتسمية العَدلات مع رابط خلية الفلورسنت الأحمر.
  4. إلغاء تنشيط العلامات عن طريق إضافة إبطال المتوسط RPMI 1640 تحتوي على الحرارة 10% مصل بقرى الجنين (FCS) في الرايت يصل إلى 15 مل والمزيج مرة واحدة بعناية. تأكد من أن بيليه هو حراكه بعناية إذا شكلت بيليه.
  5. تدور أنبوب لمدة 5 دقائق في الرايت و 328 س ز
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل من 1640 RPMI خالية من الفينول الحمراء المتوسطة المحتوية على السفح 2% و 10% P/S في الرايت تعول العَدلات.
    ملاحظة: يمكن أن يحدث فقدان خلايا 50% بعد وضع العلامات الحمراء الخلية الفلورسنت.

3-تنظيم دورات تعريفية لتشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

  1. جعل تعليق خلية 0.42 × 106 خلايا/مل في الفينول الحمراء مجاناً FCS 2% تحتوي على المتوسط RPMI 1640 و 10% P/s.
  2. إضافة 37,500 العَدلات في ميليلتر 90 كل بئر في لوحة سوداء أسفل 96، حسنا، شقة.
  3. إضافة 10 ميليلتر من الحافز الذي اخترته (مثل الأمصال للمريض) في ثلاث نسخ للوصول إلى تركيز 10% في البئر. دائماً تضمين عنصر تحكم سلبية (المتوسطة) في ثلاث نسخ.
  4. احتضان في الظلام في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب، تتراوح من 30 دقيقة إلى 2 أو 4 أو 6 حاء حضانة ليقترح ح 4.
  5. حساب الحجم الحاجة لإضافة 25 ميليلتر من 5 ميكرومتر كتيمة الحمض الخلوي الصبغي صبغ (انظر الجدول للمواد)، للوصول إلى تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في البئر. جعل بريديلوشن إذا لزم الأمر في RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 2% FCS و 10% P/S للحصول على تركيز 5 ميكرومتر.
  6. إضافة 25 ميليلتر من 5 ميكرومتر كتيمة الحمض النووي صبغ 15 دقيقة قبل نهاية فترة الحضانة. تستمر الحضانة لمدة 15 دقيقة أخرى على 37 درجة مئوية في الظلام.
  7. إزالة المادة طافية (~ 125 ميليلتر) بعناية فائقة وتخزينها إذا لزم الأمر. إضافة 100 ميليلتر من 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين). تبقى في الظلام، وفورا تابع مع الخطوة 4.

4-صافي التصور مع مجهرية [كنفوكل] الفلورة عالية الجودة وعالية--محتوى 3D

  1. تكوين الإعدادات على المجهر [كنفوكل] الفلورة بالنقر فوق الإعداد اقتناء.
    1. انقر فوق علامة التبويب تكوين .
    2. حدد الهدف والكاميرا. اختر هدف أمداً Apo X 10 مع وضع اقتناء للثقب ميكرومتر 60 [كنفوكل].
    3. انقر فوق اللوحة واختر لوحة بلاستيكية 96-جيدا. تحديد المواقع التي سيتم زيارة واختيار عدد محدد من المواقع. ملء 3 أعمدة وصفوف 3 دون التداخل (0 ميكرومتر)، والتي تغطي ما مجموعة 45% البئر.
    4. انقر فوق شراء. حدد تمكين الليزر التركيز. حدد الحصول على سلسلة الوقت/سلسلة Z إذا لزم الأمر.
    5. انقر فوق ضبط تلقائي الموقع.
      1. انقر فوق على التركيز في أسفل لوحة | المقاصة بسمك القاع. للبئر الأولى للعثور على النموذج، اختر أول بئر الحصول عليها. لضبط تلقائي للصورة الموقع، اختر كافة المواقع.
    6. انقر فوق في الأطوال الموجية.
      1. للعدد من الأطوال الموجية، اختر 2. لمستوى الصقل تصحيح التظليل TL، اختر 2.
      2. بالنسبة للطول الموجي 1، حدد "أحمر تكساس".
        1. لخيارات ضبط تلقائي، حدد الليزر مع إزاحة Z، وظيفة الليزر إزاحة 1.1 ميكرومتر. استخدام Z-مكدس مع مجموعة مخصصة من 200-10.
      3. بالنسبة للطول الموجي 2، حدد فيتك.
        1. للحصول على خيارات ضبط تلقائي للصورة، حدد طابعة الليزر بإزاحة ض من w1 0 ميكرومتر. استخدام Z-مكدس مع مجموعة مخصصة من 200-10.
        2. للحصول على خيارات، حدد سلسلة Z والإسقاط 2D الصورة كحد أقصى. للحصول على خيارات، حدد "تصحيح التظليل" | إيقاف.
    7. حدد سلسلة Z. حدد العدد من الخطوات: 10. حدد حجم الخطوة: 3 مم (النطاق الإجمالي سيكون 27 ميكرومتر).
  2. وضع اللوحة المجهرية [كنفوكل] الفلورة.
    1. انقر فوق علامة التبويب تشغيل .
      1. ملء لوحة الاسم والوصف واختيار موقع التخزين.
      2. تحديد الآبار التي تحتاج إلى الحصول عليها.
  3. اختر وقت التعرض لتكساس الأحمر وفيتك.
  4. انقر فوق الحصول على لوحة لبدء الحصول على، الذي سوف يستغرق حوالي 1 ح للوحة الواحدة.

5-تحليل لتشكيل شبكة

  1. استخدام صورة تجهيز برنامج صمم لتحليل الصور المتعددة الأبعاد العلمية (انظر الجدول للمواد) لتحليل تكوين NET.
  2. نقل بيانات الصورة المكتسبة إلى محرك أقراص ثابتة منفصلة.
  3. حدد لون إضافة أداة.
    1. حدد w1 واختر المجلد في حيث يتم تخزين البيانات القرص الصلب.
    2. حدد w2 واختر المجلد في حيث يتم تخزين البيانات القرص الصلب.
      ملاحظة: استخدام ماكرو قياسي يستخدم لإضافة اللون الأحمر إلى الصور "الأحمر تكساس" w1 في اسم الملف ويستخدم w2 لإضافة اللون الأخضر إلى الصور فيتك.
  4. حدد الماكرو التحليل.
    1. حدد w1، اختر قيمة العتبة (كثافة العتبة)، التي عادة ما تكون 10. حدد القيمة المطلوبة بكسل (حجم العتبة، مثلاً، 100).
    2. حدد w2، اختر قيمة العتبة (كثافة العتبة)، التي عادة ما تكون 10. حدد القيمة المطلوبة بكسل (حجم العتبة، مثلاً، 500).
    3. اختر الوجهة لملف جدول بيانات، تشغيل تحليل، وحفظ ملفات السجل بعد ذلك.
  5. تحليل البيانات في جدول بيانات.

Representative Results

تشكيل فخ خارج الخلية العَدلات (الصافي) هو كمياً بطريقة ثلاثية الأبعاد بالتحديد الكمي للحمض النووي خارج الخلية الملون على مكدسات ض 10 مع 3 ميكرومتر بعد الانطلاق في المستوى البؤري في كل بئر. عن طريق قياس منطقة التراكمي، حساسية الزيادات المقايسة (الشكل 1A). العَدلات معزولة بدرجة نقاء يعني 98.7 في المائة مع الانحراف المعياري (SD) % 1.10 قيست في العينات المختلفة 14 من العزلة مختلفة. متوسط النسبة المئوية لخلايا الدم الحمراء هو 1.04% ± SD 1.1% وهو متوسط النسبة المئوية وحيدات ± 0، 085% 0.17% SD (البيانات لا تظهر). المساحة الإجمالية الملون العَدلات تصويرها كمياً فقط في المستوى البؤري في كل بئر، ترتبط إلى حد كبير مع إجمالي عدد العَدلات في كل بئر بمعامل ارتباط Pearson 0.99 (فاصل الثقة 95 ٪ [كايماني] 0.985-0.997، ف < 0.0001) (الشكل 1B). نتائج تمثيلية للتحديد الكمي لتشكيل الصافية في العَدلات حفز مع الأمصال 10% من المرضى إف أو المتوسط (ميد) كعنصر تحكم سلبيا، معبراً عنها بالمنطقة الحمض النووي خارج الخلية الملون التراكمي مكدسات ض ما يزيد على 10 كل العَدلات المصورة (الشكل ج 1). يتم عرض لقطات صور الممثل unstimulated العَدلات (الشكل 2A)، وشبكات في العَدلات حفز إف (الشكل 2).

Figure 1
رقم 1: القياس الكمي لتشكيل الصافية بقياس الحمض النووي خارج الخلية وعدد العَدلات- المنطقة (أ) هو تراكمياً كمياً على مدى 10 ض-رزمة لكل جيدا ل unstimulated العَدلات (ميد) والعدلات حفز مع المصل 10% من التهاب الأوعية الدموية المرتبطة ANCA المرضى (إف) (n = 4) كمياً باستخدام برنامج معالجة صور. تم اختبار كل حافز في ثلاث نسخ، كل نقطة تمثل القيمة الوسطية. (ب) خلية وصفت الفلورسنت الأحمر منطقة وخلية العد كانت كمياً في المستوى البؤري لكل بئر ببرنامج معالجة الصور (ص2 = 0.99، ف < 0.0001). يتم التعبير عن تكوين NET (ج) كالمساحة التراكمية لكل العَدلات المصورة (منطقة الخلية). يتم رسم ± يعني الخطأ المعياري للوسط (SEM) لكل ثلاث نسخ كل حافز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: لقطات تحليل الكمي صافية. العَدلات توسم الفلورسنت تظهر باللون الأحمر، ويظهر الحمض النووي خارج الخلية الملون باللون الأخضر. 10 × الهدف "خطة لامدا الاشتقاق". (أ) العَدلات أونستيمولاتيد. (ب) العَدلات حفز مع المصل إف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الجزء الأكثر أهمية من هذا التحليل هو ضرورة استخدام العَدلات طازجة معزولة لكل تجربة لأن العَدلات لم تدم طويلاً ويموت عندما جمدت. وهذا يتطلب من المانحين صحي كل الوقت، والتي يمكن أن توريط بعض الاختلافات بسبب خصائص الجهات المانحة. واحدة من هذه الاختلافات هي حالة التنشيط العَدلات. يمكن تنشيط العَدلات في المجراة قبل عزلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تفعيل العَدلات طوال خطوات العزل لا سيما أثناء تحلل الكريات الحمراء، ولذلك مطلوب معالج ذوي خبرة من العَدلات للتقليل من تفعيل العَدلات. وبصفة عامة، ينبغي أن يجري عزل العَدلات وقت ممكن بعد الدم الرسم والتجربة لا ينبغي أن يكون مؤقتاً لتجنب التنشيط العفوية المفرطة. وثانيا، ينبغي تجنب معالجة الخام من العَدلات. على هذا النحو، هو ميزة ملحوظة لبروتوكول وصف التدخلات بيبيتينج الحد الأدنى مرة واحدة هي تبذر العَدلات في صفيحة 96-جيدا. الأهم من ذلك، هو أفضل تقييم حالة التنشيط العَدلات في حالة أونستيمولاتيد، الذي كشف هذا التحليل يمكن حس مرهف مستويات منخفضة من تشكيل صافي. العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر في التحليل هو استخدام FCS في الأجل المتوسط. النسبة المئوية السفح قد انخفضت من 10% إلى 2% لتجنب إمكانية قمع تشكيل صافي المضادة للأكسدة النشاط19،20 أو إمكانية تنشيط العَدلات على الرغم من الحرارة المنظمة. لم يحاكم الثقافة دون FCS أو باستخدام أنواع مختلفة من وسائل الإعلام. عنصر تحكم أونستيمولاتيد أو المتوسط تتخذ دائماً على طول عند القيام الفحص أن يكون مؤشرا لإشارة المعلومات الأساسية (مثل حالة التنشيط، من العَدلات). يتم عرض زيادة إضعاف لكل الحوافز مقارنة بالعينة unstimulated تحقيق نتائج متسقة عبر تجارب مختلفة باستخدام نفس الحافز.

هو تلطيخ عاملاً هاما لخلفية ارتفاع ممكن للحمض النووي خارج الخلية التي لا صلة لها بعملية تشكيل صافي. التحليل الحالي محاولات للحد من هذا عن طريق إزالة تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية مباشرة بعد فترة الحضانة قصيرة من 15 دقيقة وتحليل اللوحة مباشرة بعد التثبيت. ولذلك، من الضروري أن تستخدم مجهر [كنفوكل] متقدمة التي لديها ما يكفي من السرعة والقوة التحليلية لالتقاط لوحة 96-جيدا داخل 1 إلى 2 حاء الآلي من المستحسن استخدام الإعداد من وقت التعرض والتركيز. على هذا النحو، يمكن أن تختلف بين كل عينة الإعداد المجهر والتجربة فيما يتعلق بعتبة كثافة اللون هو أمر ضروري لجودة الصورة المثلى عموما. تأثيرات هذه الأخيرة ولذلك ينبغي تأكيد القدرة في نهاية المطاف كمياً بشكل صحيح العَدلات والشباك والإعداد الأمثل باستخدام عينات مراقبة متعددة (مثل مصل لضوابط صحية). أثناء تحليل الصور الملتقطة، يتيح استخدام عتبة بكسل وحجم الحد الفاصل في برنامج تحليل لاختيار أفضل من تشكيل الصافية.

الحمض النووي خارج الخلية المستمدة من تشكيل صافي يمكن أن يكون نتيجة لمسارات الموت متميزة، بما في ذلك نيتسيس، نيكروبتوسيس، بيروبتوسيس، فيروبتوسيس أو حتى غير الحال عملية تشكيل شبكة حيوية1. على هذا النحو، حد من تحليل هذا أن يوجد تلطيخ فقط للحمض النووي خارج الخلية أي تمييز ممكن بين تشكيل الصافية ومسارات موت الخلية ذات الصلة الأخرى. من الممكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام أما مثبطات انتقائية لمسارات الموت متميزة بتميز بين الأشكال المختلفة التي تدعم تشكيل الصافية أو تأكيد وجود علامات صافي محددة، مثل citH3 وني، قبل إيمونوستينينجس منفصلة شارك المترجمة مع الحمض النووي. وأكدت مؤخرا التعريب المشارك من الحمض النووي خارج الخلية مع citH3 وني لهذا الإنزيم10. ميزة تجنب صافي علامات محددة في هذا التحليل، يسمح بتقييم صافي تشكيل مما أدى إلى قذف الحمض النووي من العَدلات كاملة وموضوعية بقدر الإمكان مع إمكانية الفرز الفائق بجميع أشكاله. وقد تبين مدى انطباق هذا البروتوكول في دراسة التعريفي صافي مستوى منخفض بمجمعات محصنة في أمراض المناعة الذاتية القدرة على الكشف عن الاختلافات النوعية والكمية التي قد يكون أكثر أهمية من نوع عملية وساطة تشارك10،،من2122. توضح أن هذا التحليل الكمي صافي رواية يمكن أن تكون القيمة المضافة لمختلف الباحثين للتحقيق في الجوانب المختلفة لتشكيل شبكة. تعديلات صغيرة للمقايسة وتنفذ بسهولة: تعديل فترة التحفيز أو استخدام علامة صافي المفضلة لديك للتركيز على مسار الموت محددة واحدة مما أدى إلى تشكيل شبكة أو استخدام التكبير المختلفة أو استخدام معايير مختلفة صافية في القياس الكمي والتحليل.

وفي الختام، وينص البروتوكول مقايسة المطبقة على نطاق واسع حساسة للغاية للتحديد الكمي شبه الآلي لتشكيل الصافية للتقييم السابقين فيفو الاستقراء من الشباك على محفزات مختلفة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

عمل الين J. عرندس وتنغ أونو مجموعة تدعمها "مؤسسة الكلي الهولندية" (17OKG04)، الزمالة السريرية من "منظمة هولندا" "البحث العلمي" (90713460). العمل لورا س. فإن دام معتمد من قبل مؤسسة البحوث في "أمراض الروماتيزم" (دعت).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua Sterile H2O B. Braun, Melsungen, Germany 12604052
Fetal bovine serum (FCS) Bodinco, Alkmaar, The Netherlands Used in high concentrations it could influcence NET formation
Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL LUMC, Leiden, The Netherlands 97902861
Immunofluorescence confocal microscope Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralization PBS (10x) Gibco, Paisley, UK 70011-036
Penicillin/streptomycin (p/s) Gibco, Paisley, UK 15070063
Phenol red free RPMI 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 11835-063 Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal
Phosphate-buffered saline (PBS) B. Braun, Melsungen, Germany 174628062
PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA PKH26GL-1KT PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan
Program for scientific multidimensional images analysis ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 52400-025
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye Gibco, Paisley, UK 57020
Trypan blue stain 0.4% Sigma Aldrich, Germany 17942E
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate Falcon, NY, USA 353219

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
  2. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  4. Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
  5. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
  6. Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
  7. Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
  8. Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
  9. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
  10. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  13. Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
  14. Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
  15. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
  16. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  17. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  18. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
  19. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
  20. von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  21. Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
  22. Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
  23. Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 143، العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات)، العَدلات، مجهر الفلورة، علم المناعة، أمراض المناعة الذاتية الجهازية، التهاب الأوعية الدموية المرتبطة ANCA، الذئبة الحمامية المجموعية، التهاب الكلية الذئبة
مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arends, E. J., van Dam, L. S.,… More

Arends, E. J., van Dam, L. S., Kraaij, T., Kamerling, S. W. A., Rabelink, T. J., van Kooten, C., Teng, Y. K. O. A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation. J. Vis. Exp. (143), e59150, doi:10.3791/59150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter