Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

Abstract

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הם immunogenic מבנים דנ א חוץ-תאית המופצות על ידי נויטרופילים על מגוון רחב של גורמים מפעילים. רשתות הוכחו לשמש מנגנון הגנה חשוב מארח מלכודות והורג מיקרואורגניזמים. מצד שני, הם היו מעורבים מגוון מחלות אוטואימוניות מערכתיות. הרשתות הן מבנים immunogenic רעילים שמכילים מאגר של autoantigens הרלוונטיים כולל נויטרופילים נגד cytoplasmic נוגדנים (לימור קלו)-הקשורים וסקוליטיס (AAV), זאבת אדמנתית מערכתית (מורן סלם). צורות שונות של רשתות יכולה להיגרם בהתאם הגירוי. הכמות של רשתות ניתן לכמת באמצעות טכניקות שונות כולל מדידת לשחרר דנ א supernatants, מדידת ה-DNA-ומורכבת עם נטו-מולקולות כמו myeloperoxidase (MPO) או elastase נויטרופילים (NE), מדידת הנוכחות של citrullinated שינויים היסטוניים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, או זיהוי cytometric זרימה נטו-רכיבים אשר כולם כוללים תכונות שונות לגבי ירידה לפרטים, רגישות, אובייקטיביות וכמות שלהם. כאן הוא פרוטוקול לכמת ex-vivo נטו היווצרות בצורה מאוד רגיש, תפוקה גבוהה באמצעות קונפוקלית immunofluorescence תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לטפל שאלות מחקר שונים על היווצרות נטו והשפלה על בריאות ומחלה.

Introduction

היווצרות מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא תהליך שבו נויטרופילים משחררים את הדנ א שלהם ברשת חוץ-תאית תלת מימדי (3D) כמו מבנה, ומורכבת עם מגוון רחב של מולקולות מיקרוביאלית ומסוכן, פרטנית, אנזימים cytoplasmic, פפטידים וחלבונים. מבנים immunogenic רעילים אלה יש תפקיד פיזיולוגי ההגנה החיסונית מולדת של אנשים בריאים על ידי השמנה ואת להרוג פתוגנים זיהומיות1. עם זאת, הם גם הוכחו להיות מעורב פקקת2 ומחלות אוטואימוניות מערכתית שונות, כולל נויטרופילים נגד cytoplasmic נוגדנים (לימור קלו)-הקשורים וסקוליטיס (AAV)3, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן )4,5, תסמונת אנטי-פוספוליפידית (APS)2,6, דלקת מפרקים שגרונית (RA), פסוריאזיס, שיגדון7,8,9.

היווצרות נטו במבחנה נחקרה באופן נרחב עם phorbol תרכובת כימית פעילים-12 13-אצטט (PMA), אשר גורם היווצרות נטו מסיבית. עם זאת ביותר פיזיולוגיות לגירויים לגרום הרבה רמות נמוכות יותר של היווצרות נטו10. ללמוד נטו-מפעילים באווירה, לדוגמה, מחלות אוטואימוניות, וזמינותו כמותיים מתוקננת, רגיש, תפוקה גבוהה יש צורך לזהות ולכמת היווצרות נטו. כימות של רשתות הוכיחה להיות מאתגר, כיום מתבצע באמצעות שיטות שונות, כל אחד עם משלהם-יתרונות ומגבלות11. השיטה הנפוצה היא זיהוי ה-DNA supernatants12, אשר הוא אובייקטיבי אבל לא להפלות בין המקור של ה-DNA (אפופטוטיים להיפגע, נמק, רשתות), ולכן היא לא מאוד ספציפי עבור רשתות. שנית, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) של ה-DNA-ומורכבת עם חלבונים ספציפיים נטו, לדוגמה, myeloperoxidase (MPO) או elastase נויטרופילים (NE), הן בגישה יותר ספציפי כדי לזהות רשתות והפגינו היו לתאם עם citrullinated היסטון-3 (CitH3) חיובי רשתות13. עם זאת, לא ידוע שיטה זו רגישים מספיק כדי לאסוף את כל רשתות (למשל, MPO, NE, ורשתות CitH3 שלילי). גישה שלישית היא מיקרוסקופ immunofluorescence המשמש לאיתור שותף לוקליזציה של NET-הקשורים מולקולות (NE, MPO, CitH3) עם דנ א חוץ-תאית לכמת רשתות. שיטה זו היא בדרך כלל ספציפי עבור רשתות, אבל זה לא יכול להיות מיושם כשיטה תפוקה גבוהה ואינה אובייקטיבית עקב הטיית הצופה. בנוסף, שיטה זו לא לקחת בחשבון MPO, NE-, רשתות CitH3-שלילי כי קיימים לעתים קרובות בהתאם ה14,בשימוש נטו-ההדק15. גישות cytometry זרימה לזהות רשתות דרך שונה קדימה/sideward פיזור (FSC/האס) המציין נפיחות של הגרעין ב- NET-טינג נויטרופילים16. שיטה זו לא לוקח בחשבון את צורות שונות של היווצרות נטו כי זוהו, אשר לא עשוי להיות כרוך נפיחות של הגרעין, כגון היווצרות נטו חיוני17. לבסוף, immunofluorescence קונפוקלית הוחל כדי להמחיש ולכמת היווצרות רשת על-ידי ישירות מכתים חוץ-תאי DNA עם צבע תא אטום זה כתמים דנ א חוץ-תאית12,18. באופן כללי, 5-10 שדות ובעוצמת ידנית בחרה, העריך, אשר מכסה 1-5% של כל טוב של 96-ובכן צלחת11,17. בחירה ידנית של תמונות הוא לא תמיד אובייקטיבית, נוטה הטיה ומושכת לא לניתוח תפוקה גבוהה. וזמינותו כימות NET אוטומטיים, תפוקה גבוהה פותחה לאחרונה, אשר עם תמונה 11% היטב באופן תלת-ממד כיסוי מיקרומטר 13 דרך מוערם Z immunofluorescence קונפוקלית, ובכך שמוביל טכניקה רגישה מאוד להעריך רשתות לעומת שיטות קונבנציונליות10. הדו ח הנוכחי מתאר את פרוטוקול האחרונה כדי לכמת את היווצרות נטו דרך assay אוטומטיות, רגישה מאוד באמצעות קונפוקלית 3D, אשר משיגה תחום שבעורך כולל של 45% מכל קידוח ומכסה מיקרומטר 27 דרך Z-במחסן. פרוטוקול זה מתאים לכמת, עם רגישות גבוהה, רמות נמוכות של היווצרות נטו באופן אובייקטיבי ובלתי מוטים באופן.

Protocol

כל החולים בקרות בריא הסכים להשתתף biobank LUMC. שני המחקרים biobanking אושרו על ידי הוועדה האתית LUMC.

1. בידוד של נויטרופילים בריא

  1. להשיג 20 מ של דם היקפיים מתורם בריא שני צינורות מצופים EDTA 10 מ"ל.
  2. מכניסים צינור סטרילי 50 מ ל 10 מ"ל של דם ולהוסיף buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 32.5 מ ל.
  3. הוסף דחיסות צבע (למשל., Ficoll-amidotrizoaat) תחת התאים.
    1. תופסים 14 מ של דחיסות צבע עם 10 מ ל pipet, pipet בקר.
    2. מניחים את pipet על התחתון של הצינור 50 מ.
    3. לקחת את הבקר pipet הנחה pipet, המאפשר מעבר הצבע צפיפות לזרום מתוך pipet חוק המשיכה עד המרבי על ידי אפקט נימי (1-2 מ ל יישאר), ללא שימוש המנוע.
    4. הסר pipet על-ידי הצבת אגודל על גבי pipet, ובכך מונע צפיפות הדרגתי דולף החוצה במהלך הסרת pipet.
  4. לסובב את הצינורות כעשרים דקות ב 912 x g ובטמפרטורת החדר (RT) ללא האצה או בלם.
    הערה: תאי דם אדומים (RBC) ו נויטרופילים צפיפות גבוהה ונמצאות בחלק התחתון של הצינור 50 מ. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) הם נפרדו, על גבי המילוי ההדרגתי צפיפות כמו טבעת לבנה. פלזמה מדולל-PBS יהיה מעל PBMCs. אם יש צורך, PBMCs יכול להיות מבודדת על ידי העברת הטבעת לבן צינור 50 מ עם צעדים נוספים כביסה עם PBS.
  5. הסר בזהירות את הטבעת לבן המכיל PBMCs ראשון, ואחריו הסרת פלזמה מדולל-PBS ולבסוף את צפיפות השכבה הדרגתי ככל האפשר.
  6. כדי לבודד נויטרופילים מהתערובת נויטרופילים/אריתרוציטים, lyse אריתרוציטים מאת קר במים מזוקקים סטריליים.
    1. קח קר בקבוק מים מזוקקים סטריליים, סימן x 10 מרוכזים PBS הבקבוק מהמקרר.
    2. לעבוד מהר בשלב זה. להוסיף 36 מ"ל מים מזוקקים קרים סטרילי ישירות מעל בגדר ולערבב פעם אחת בקפידה. להוסיף 4 מיליליטר 10 x PBS לאחר 20 s כדי ליצור פתרון מול. מערבבים פעם אחת בקפידה.
    3. ספין צינור 5 דקות ב 739 x g ו- C ° 4 (להסרת RBCs). נויטרופילים יהיו בגדר לבן.
    4. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע. בצע שוב את שלב 1.6.2 וודא שבגדר מושעה כראוי.
    5. ספין צינור עבור 5 דקות ב 328 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    6. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של PBS. לספור נויטרופילים ולשמור אותם על קרח.
      הערה: התשואה הצפויה של דם (10 מ"ל) צינור 1 הוא כ- 15-75 מיליון נויטרופילים.

2. תא ניאון אדום תוויות של נויטרופילים

  1. להפוך השעיה נויטרופילים של 10-20 מיליון נויטרופילים ב 2 מ של PBS בשפופרת 15 מ"ל.
  2. להפוך את פתרון של 2 מ ל PBS עם 4 µL של 2 מיקרומטר תא ניאון אדום מקשר (ראה טבלה של חומרים) צינור שונה 15 מ"ל. להוסיף את זה בעדינות כדי ההשעיה נויטרופילים ומערבבים היטב.
  3. דגירה בחושך בדיוק 25 דקות ב 37 ° C כדי להדביק תווית נויטרופילים עם מקשר תא ניאון אדום.
  4. בטל תיוג על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני המכיל 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FCS) ב RT עד 15 mL ולערבב פעם בקפידה. ודא כי בגדר בקפידה resuspended אם גלולה הקימה.
  5. ספין צינור 5 דקות ב 328 x g ו- RT.
  6. הסר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 5 מ של פנול אדום ללא RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו-10% P/S-RT. נחשב נויטרופילים.
    הערה: תא הפסד של 50% יכולה להתרחש לאחר labelling תא ניאון אדום.

3. אינדוקציה של היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

  1. להפוך את התא השעיה של 0.42 x 106 תאים למ"ל פנול אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S.
  2. להוסיף נויטרופילים 37,500 µL 90 לכל טוב בצלחת התחתונה 96-ובכן, שטוח שחור.
  3. להוסיף 10 µL הגירוי שבחרת (למשל, סרה של המטופל) דולר כדי להגיע בריכוז 10% בתוך הבאר. תמיד לכלול פקד שלילי (בינוני) בשלושה עותקים.
  4. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המבוקש, הנע בין 30 דקות ל 2, 4 או 6 ח' המקננת במשך 4 שעות הוא הציע.
  5. לחשב את אמצעי האחסון הדרושים כדי להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום דנ א לצבוע (ראה טבלה של חומרים), כדי להגיע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבאר. להפוך predilution אם יש צורך RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S בריכוז 5 מיקרומטר.
  6. להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום DNA צבע 15 דקות לפני תום זמן הדגירה. המשך הדגירה למשך עוד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  7. הסר את תגובת שיקוע (~ 125 µL) היטב ולאחסן במידת הצורך. להוסיף 100 µL של 4% paraformaldehyde (PFA). גילינו ולהמשיך מיד בשלב 4.

4. נטו ויזואליזציה עם Immunofluorescence גבוהה-תוכן, רזולוציה גבוהה 3D מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. קביעת ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence על ידי לחיצה על הגדרת רכישה.
    1. לחץ על הכרטיסיה קביעת תצורה .
    2. בחר את המטרה ואת המצלמה. לבחור המטרה X Apo למבדה 10 עם מצב רכישה של הקדמוניות מיקרומטר 60 קונפוקלי.
    3. לחץ על צלחת , בחר את הצלחת 96-ובכן פלסטיק. בחר את האתרים כדי לבקר ובחר מספר קבוע של אתרים. מלאו 3 עמודות ושורות 3 ללא חפיפה (0 מיקרומטר), אשר מכסים את סך של 45% של הבאר.
    4. לחץ על רכישה. בחר לאפשר התמקדות מבוססת לייזר. בחר לרכוש סדרות סדרות/שעה Z במידת הצורך.
    5. לחץ על אתר פוקוס אוטומטי.
      1. לחץ על המוקד על צלחת התחתון | את הגדר על ידי עובי התחתון. על הבאר הראשונית למצוא את הדגימה, לבחור את הבאר הראשונה רכשה. פוקוס אוטומטי אתר, בחר ' כל האתרים.
    6. לחץ על אורכי גל.
      1. עבור המספר של אורכי גל, לבחור 2. TL הצללה תיקון עידון הרמה, לבחור 2.
      2. עבור גל 1, בחר טקסס אדום.
        1. עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z היסט, פוסט לייזר היסט 1.1 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10.
      3. גל 2, בחר FITC.
        1. עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z קיזוז מתוך w1 0 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10.
        2. עבור אפשרויות רכישה, בחר סדרת Z ו תמונה מוקרנת 2D המרבי. עבור אפשרויות רכישה, בחר תיקון הצללה | את.
    7. בחר סדרת Z. בחר את מספר שלבים: 10. בחר את גודל הצעד: 3 מ מ (טווח הכולל יהיה מיקרומטר 27).
  2. לשים את הצלחת קונפוקלית immunofluorescence.
    1. לחץ על הכרטיסיה הפעל .
      1. למלא את הצלחת שם ותיאור ובחר מיקום האחסון.
      2. בחר הבארות שצריך לרכוש.
  3. בחר זמן החשיפה FITC, טקסס אדום.
  4. לחץ על צלחת לרכוש כדי להפעיל את הרכישה, אשר יעביר כ 1 h לכל צלחת.

5. ניתוח של היווצרות נטו

  1. להשתמש בתמונה עיבוד תוכנית שנועדה לצורך ניתוח מדעי תמונות רב-ממדי (ראה טבלה של חומרים) לנתח את היווצרות נטו.
  2. להעביר את נתוני התמונה נרכשת כונן קשיח נפרדים.
  3. בחר את הצבע הוספת הכלי.
    1. בחר w1 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים.
    2. בחר w2 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים.
      הערה: להשתמש במאקרו סטנדרטית משתמשת w1 בשם הקובץ כדי להוסיף צבע אדום לתמונות טקסס אדום ומשתמש w2 להוסיף צבע ירוק התמונות FITC.
  4. בחר ניתוח מאקרו.
    1. בחר w1, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 100).
    2. בחר w2, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 500).
    3. בחר את מיקום היעד עבור קובץ גיליון אלקטרוני, להפעיל ניתוח ולשמור קבצי יומן רישום לאחר מכן.
  5. ניתוח נתונים בגיליון אלקטרוני.

Representative Results

היווצרות מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) לכמת באופן תלת-ממד על-ידי לכימות דנ א חוץ-תאית מוכתם יותר מ-10 Z-חבילות עם 3 מרחק מיקרומטר החל המטוס מוקד היטב כל. על ידי מדידת השטח המצטבר, הרגישות של גדל assay (איור 1 א'). נויטרופילים מבודד יש טוהר רשע 98.7% עם סטיית תקן (SD) של 1.10% שנמדד בדגימות שונות 14 מ ומשום שונים. האחוז הממוצע של כדוריות דם אדומות הוא SD 1.1% ± 1.04% והוא האחוז הממוצע של monocytes 0.085% ± 0.17% SD (נתונים לא מוצג). השטח של נויטרופילים ויטראז'ים עם תמונה הם לכמת רק ב מישור מוקד כל היטב, אשר בהתאמה באופן משמעותי ספירת נויטרופילים סך כל היטב עם מקדם המתאם פירסון של 0.99 (מרווח הביטחון 95% [CI] 0.985-0.997, p < 0.0001) (איור 1B). התוצאה נציג של כימות של נטו-צורה נויטרופילים מגורה עם 10% סרה AAV המטופלים או בינונית (MED) כפקד שלילי, המבוטא המצטבר באזור ה-DNA מוכתם חוץ-תאית Z מעל 10-במחסן לכל תמונה נויטרופילים (איור 1 C)-תמונות של נציג תמונות של נויטרופילים unstimulated (איור 2 א) ושל רשתות מגורה AAV נויטרופילים (איור 2B) מוצגים.

Figure 1
איור 1: כימות של היווצרות נטו על ידי מדידת דנ א חוץ-תאית, ספירת נויטרופילים. (א) אזור מצטברת לכמת יותר מ-10 Z-חבילות עבור כל טוב עבור unstimulated נויטרופילים (MED), נויטרופילים מגורה עם 10% סרום של לימור קלו-הקשורים וסקוליטיס (AAV) חולים (n = 4) לכמתו תוכנית עיבוד תמונה. כל גירוי נבדקה שהפקידים, כל נקודה מייצג את הערך החציוני. ספירת אזור ותא אדום התאים שכותרתה פלורסנט (B) היו לכמת במישור המוקד של כל טוב על-ידי התוכנית עיבוד תמונה (R2 = 0.99, p < 0.0001). היווצרות נטו (C) מתבטאת כאזור המצטבר לכל תמונה נויטרופילים (תא שטח). זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של כל שהפקידים מותווים לכל גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונות של כימות נטו assay. נויטרופילים שכותרתה פלורסנט מוצגים באדום, ויטראז'ים דנ א חוץ-תאית מוצג בצבע ירוק. 10 x לתכנן למדא Apo אובייקטיבי. (א) Unstimulated נויטרופילים. מגורה עם סרום AAV נויטרופילים (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

החלק הקריטי ביותר של assay זו הוא הצורך להשתמש נויטרופילים טרי מבודדים עבור ניסוי כי נויטרופילים הם קצרי חיים ולא מתים כשהם קפואים. הדבר מחייב תורם בריא בכל פעם, אשר יכול לסבך וריאציות בשל מאפיינים התורם. אחת מהווריאציות האלה הוא מצב ההפעלה של נויטרופילים. נויטרופילים יכול להיות מופעל כבר ויוו לפני בידוד. בנוסף, נויטרופילים יכול להיות מופעל בכל השלבים בידוד ובפרט במהלך פירוק של אריתרוציטים, ולכן מטפל מנוסה של נויטרופילים נדרשת כדי למזער את ההפעלה של נויטרופילים. באופן כללי, בידוד של נויטרופילים צריכה להתבצע בהקדם האפשרי לאחר לקיחת דם, לא צריך אפשרות להשהות את הניסוי כדי למנוע הפעלת ספונטנית מוגזמת. שנית, יש להימנע טיפול אגרסיבי של נויטרופילים. ככזה, היתרון הבולט של הפרוטוקול המתואר הוא ההתערבות pipetting מינימלי, ברגע נויטרופילים הם נזרע בצלחת 96-ובכן. חשוב מכך, מצב ההפעלה של נויטרופילים מורה־הדרך בתנאי unstimulated, שבו ניתן assay הזה ברגישות לזהות רמות נמוכות של היווצרות נטו. גורם נוסף שיש בהם להשפיע וזמינותו הוא השימוש של FCS במדיום. האחוז של FCS הצטמצמה מ 10% ל-2% כדי למנוע הדיכוי אפשרי של היווצרות רשת על-ידי נוגד חמצון פעילות19,20 או את ההפעלה אפשרי של נויטרופילים למרות החום איון. תרבות ללא FCS או עם שימוש סוגים שונים של מדיה לא נוסה. פקד unstimulated או בינונית תמיד נלקחת לאורך בעת ביצוע וזמינותו יש אינדיקציה של האות הרקע (למשל, את מצב ההפעלה של נויטרופילים). העלייה הקיפול עבור כל גירוי לעומת הדגימה unstimulated מוצג כדי להשיג תוצאות עקביות על ניסויים שונים באמצעות הגירוי אותו.

גורם חשוב עבור רקע גבוה אפשרי מכתימה של דנ א חוץ-תאית, כי הוא קשור תהליך היווצרות נטו. וזמינותו הנוכחי מנסה להפחית את זה על-ידי הסרת חוץ-תאי DNA ההכתמה מיד לאחר תקופת דגירה קצרה של 15 דקות על ידי ניתוח הצלחת ישירות לאחר קיבוע. לכן, זה הכרחי להשתמש מיקרוסקופ קונפוקלי מתקדם בעל מספיק מהירות וכוח אנליטיות כדי ללכוד את הצלחת 96-ובכן בתוך 1-2 ח' אוטומטית הגדרה של זמן החשיפה, פוקוס מומלצת. ככזה, ההגדרה מיקרוסקופ יכול להשתנות בין כל מדגם ולהתנסות ביחס לסף עוצמת צבע אשר הכרחי לאיכות תמונה אופטימלית באופן כללי. ההשפעות האחרון בסופו של דבר היכולת לכמת בצורה נכונה נויטרופילים, רשתות, ההגדרה המיטבית ולכן צריך להיות מאושרות על ידי באמצעות שליטה במספר דגימות (למשל, סרום של פקדים בריא). במהלך הניתוח של תמונות שנתפסו, מאפשר השימוש של פיקסל הסף וכן גודל הסף בתוכנית ניתוח מבחר טוב של היווצרות נטו.

דנ א חוץ-תאית, נגזר מערך נטו יכול להיות התוצאה של מסלולים ברורים מוות, כולל NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis או אפילו שאינו lytic תהליך היווצרות נטו חיוני1. ככזה, מגבלה של וזמינותו הנוכחי היא על ידי צביעת רק עבור דנ א חוץ-תאית שאין אין בידול אפשרי בין היווצרות נטו מסלולים אחרים של מוות התא הרלוונטי. ניתן להשיג זאת על-ידי שימוש גם מעכבי סלקטיבי של מסלולים ברורים מוות להפלות בין הצורות לגורם המרכזי עליו מושתתת היווצרות נטו או לאשר על-ידי immunostainings נפרד הנוכחות של סמנים נטו ספציפי, כגון citH3 ו- NE, שותף מקומי עם ה-DNA. לוקליזציה שיתוף של דנ א חוץ-תאית עם citH3 ו- NE לאחרונה אושרה הזה assay10. היתרון של הימנעות נטו סמני הספציפי הזה assay, מאפשר להעריך כל צורות היווצרות נטו המוביל ההבלטה של ה-DNA על ידי נויטרופילים כמו מלא ואובייקטיבי ככל האפשר עם הפוטנציאל של ההקרנה תפוקה גבוהה. תחולתה של פרוטוקול זה הוכח בלימוד נמוך אינדוקציה נטו רמת מתווכת על-ידי המערכת החיסונית מתחמי חיסון למחלה שבה היכולת לזהות הבדלים כמותיים יכול להיות חשוב יותר מאשר הסוג של תהליך מעורב10,21,22. ומציינת כי assay כימות נטו הרומן הזה יכול להיות בעל ערך מוסף לחוקרים שונים לחקור היבטים שונים של היווצרות נטו. שינויים קטנים וזמינותו מיושמים בקלות: התאמת תקופת גירוי, השימוש סמן נטו האהוב עליך להתמקד מוות מסוים אחד שביל שמוביל היווצרות נטו, השימוש הגדלה שונות או השימוש של קריטריונים שונים נטו ב כימות וניתוח.

לסיכום, פרוטוקול מסופק הוא מאוד רגיש assay בהרחבה ישימה עבור כימות חצי אוטומטיות של היווצרות נטו על ההערכה של ex-vivo אינדוקציה של רשתות על גירויים שונים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה של Eline ג'יי Arends ו Y.K. אונו טנג נתמך על ידי ההולנדי כליות הקרן (17OKG04), אחוות קלינית מארגון הולנד למחקר מדעי (90713460). העבודה לורה ס ון דאם נתמכת על ידי העמותה לחקר ראומטולוגיה (FOREUM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua Sterile H2O B. Braun, Melsungen, Germany 12604052
Fetal bovine serum (FCS) Bodinco, Alkmaar, The Netherlands Used in high concentrations it could influcence NET formation
Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL LUMC, Leiden, The Netherlands 97902861
Immunofluorescence confocal microscope Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralization PBS (10x) Gibco, Paisley, UK 70011-036
Penicillin/streptomycin (p/s) Gibco, Paisley, UK 15070063
Phenol red free RPMI 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 11835-063 Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal
Phosphate-buffered saline (PBS) B. Braun, Melsungen, Germany 174628062
PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA PKH26GL-1KT PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan
Program for scientific multidimensional images analysis ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 52400-025
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye Gibco, Paisley, UK 57020
Trypan blue stain 0.4% Sigma Aldrich, Germany 17942E
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate Falcon, NY, USA 353219

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
  2. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  4. Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
  5. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
  6. Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
  7. Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
  8. Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
  9. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
  10. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  13. Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
  14. Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
  15. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
  16. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  17. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  18. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
  19. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
  20. von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  21. Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
  22. Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
  23. Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 143 נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות) נויטרופילים מיקרוסקופ immunofluorescence אימונולוגיה אדמנתית מערכתית לימור קלו-הקשורים וסקוליטיס זאבת דלקת כליות לופוס
תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arends, E. J., van Dam, L. S.,… More

Arends, E. J., van Dam, L. S., Kraaij, T., Kamerling, S. W. A., Rabelink, T. J., van Kooten, C., Teng, Y. K. O. A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation. J. Vis. Exp. (143), e59150, doi:10.3791/59150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter