Summary
Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.
Abstract
Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) çok çeşitli Tetikleyiciler üzerine nötrofil tarafından yayımlanan immünojenik ekstraselüler DNA yapıları vardır. Ağlar yakalar ve mikroorganizmaları öldüren bir önemli ana savunma mekanizması olarak hizmet göstermiştir. Öte yandan, onlar çeşitli sistemik otoimmün hastalıklarda karıştığı olmuştur. Ağları olan bir havuz ile ilgili autoantigens anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar (ANCA) dahil olmak üzere içeren immunojenik ve toksik yapılar-ilişkili vaskülit (AAV) ve sistemik lupus eritematozus (SLE). Ağları farklı formları bağlı olarak uyarıcı bağlı olmak. NETs miktarda DNA sürümde supernatants, DNA-citrullinated varlığı ölçme complexed NET-moleküllerin myeloperoxidase (MPO) veya nötrofil elastase (NE), gibi ile ölçme ölçme de dahil olmak üzere farklı yöntemlerle sayılabilir histon floresan mikroskopi veya akış sitometrik algılama da kendi özgüllük, hassasiyet, objektiflik ve miktar ile ilgili farklı özelliklere sahip NET bileşenleri tarafından. İşte üç boyutlu ayirt confocal mikroskobu kullanılarak ex vivo NET oluşumu çok hassas, yüksek üretilen iş bir şekilde ölçmek için bir protokol. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve yıkımı sağlığı ve hastalıkları hakkında çeşitli araştırma soruları çözmek için uygulanabilir.
Introduction
Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) oluşumu nötrofil onların DNA yapısı, antimikrobiyal ve tehlikeli molekülleri, taneli geniş bir complexed gibi bir hücre dışı üç boyutlu (3D) Web yayın işlemidir ve sitoplazmik enzim, peptidler ve proteinler. Bu immunojenik ve toksik yapılar bindirme ve öldürme Bulaşıcı patojenler1tarafından sağlıklı bireylerin doğuştan gelen bağışıklık savunmak için önemli bir fizyolojik role sahiptir. Ancak, onlar da tromboz2 ve anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar (ANCA) dahil olmak üzere çeşitli sistemik otoimmün hastalıklar dahil olmak gösterilmiştir-Vaskülit (AAV)3, sistemik lupus eritematozus (SLE ilişkili )4,5, antifosfolipid sendromu (APS)2,6, romatoid artrit (RA), sedef ve gut7,8,9.
İn vitro NET oluşumu kimyasal bileşik phorbol 12-myristate 13-hangi büyük NET oluşumuna neden olmaktadır asetat ile (PMA), yaygın olarak okudu. Ancak fizyolojik uyaranlar en NET oluşumu10çok daha düşük seviyede ikna etmek. Çalışma NET-Tetikleyiciler, örneğin, bir ortamda otoimmün hastalığı, standart, hassas, yüksek üretilen iş nicel tahlil algılamak ve NET oluşumu ölçmek için gereklidir. Miktar ağlarının zorlu olduğu kanıtlanmıştır ve şu anda farklı yöntemleri, her biri kendi avantajları ve sınırlamalar11tarafından gerçekleştirilir. DNA tespiti amacı ama DNA (apoptotik, çürümüş, ağlar), kökeni arasında ayrımcılık yok ve bu nedenle çok ağlar için özel değildir supernatants12, sık kullanılan bir yöntemdir. İkinci olarak, NET-spesifik proteinler, örneğin, myeloperoxidase (MPO) veya nötrofil elastase (NE), ile enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs), DNA complexed ağlar algılamak için daha açık bir yaklaşım ve de ile ilişkilendirmek için gösterdi citrullinated histon-3 (CitH3) pozitif ağlar13. Ancak, bu yöntem tüm ağlar (örneğin, MPO, NE ve CitH3 negatif ağlar) almak için hassas olup bilinmemektedir. NET ilişkili molekülleri (NE, MPO, CitH3) ağlar ölçmek için hücre dışı DNA ile ortak yerelleştirme algılamak için kullanılan ayirt mikroskobu üçüncü bir yaklaşımdır. Bu yöntem genellikle ağlar için özeldir, ama bu yüksek üretilen iş yöntemi olarak uygulanamaz ve objektif gözlemci önyargı nedeniyle değil. Ayrıca, bu yöntem MPO-, NE-, sık kullanılan NET-tetikleyici14,15bağlı olarak mevcut CitH3 negatif ağlar göz önünde bulundurur değil. Akış Sitometresi yaklaşımlar NET-ting nötrofil16çekirdeğinde şişmesi gösteren bir ileri/yana değiştirilen dağılım (FSC/SSC) aracılığıyla ağları algılar. Bu yöntem hayati NET oluşumu17gibi çekirdek şişmesi dahil değil, tespit edilen, NET oluşumu türleri dikkate almaz. Son olarak, ayirt confocal mikroskobu görselleştirmek ve doğrudan hücre dışı DNA hücre dışı DNA12,18lekeleri hücre geçirimsiz bir boya boyama tarafından NET oluşumu ölçmek için uygulanmıştır. Genel olarak, 5-10 yüksek güçlü alanları el ile aldım ve değerlendirildi, hangi her şey bir 96-şey plaka11,171-%5 kapsar. Görüntüleri el ile seçimi her zaman nesnel, önyargı eğilimli ve yüksek üretilen iş analizi için çekici değil değildir. Hangi iyi %11 13 µm böylece ağları değerlendirmek için bir son derece hassas teknik lider Z-yığılmış ayirt confocal mikroskobu aracılığıyla kapsayan bir 3D şekilde yansıma bir otomatik, yüksek üretilen iş NET miktar tahlil son zamanlarda geliştirildi geleneksel yöntemlerle10' a kıyasla. Geçerli raporu her şey % 45'i toplam görüntülü alan elde ve Z yığınlarının üzerinden 27 µm kapsar 3D confocal mikroskobu kullanarak bir otomatik, son derece hassas tahlil aracılığıyla NET oluşumu ölçmek için en son protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, objektif ve tarafsız şekilde NET oluşumunda seviyesinin düşük yüksek bir hassasiyet ile ölçmek uygundur.
Protocol
Bütün hasta ve sağlıklı kontrol LUMC biobank katılmak için onay verdi. Her iki biobanking çalışmalar LUMC Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. yalıtım sağlıklı nötrofil
- 20 mL periferik kan EDTA kaplı iki 10 mL tüpler sağlıklı bir donörden elde edilir.
- Kan 10 mL steril 50 mL tüp içinde koyun ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin 32,5 mL.
-
Yoğunluk gradient (e.g., Ficoll-amidotrizoaat) altında hücreleri ekleyin.
- Yoğunluk 14 mL kadar bir 10 mL damlalıklı ve damlalıklı denetleyicisi ile degrade al.
- Damlalıklı 50 mL tüp dibinde yerleştirin.
- Maksimum kapiller etkisiyle ulaşılana kadar yerçekimi tarafından dışarı damlalıklı akmaya yoğunluk gradient izin damlalıklı denetleyicisi damlalıklı kapalı al (1-2 mL kalmamış olabilir), motor kullanmadan.
- Damlalıklı böylece damlalıklı kaldırılması sırasında sızıntı yoğunluk gradient önleme damlalıklı, üstüne bir başparmak koyarak kaldırın.
- Tüpler 20 dk 912 x g ve oda sıcaklığında (RT) hızlanma ve fren için spin.
Not: Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve nötrofil yüksek yoğunluklu ve 50 mL tüp altındadır. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) ayrılmış ve yoğunluk gradient üstüne beyaz bir halkası olarak. PBS seyreltilmiş plazma PBMCs olacak. Gerekirse, PBMCs beyaz yüzük PBS ile ek yıkama adımlarla yeni bir 50 mL tüp aktararak izole. - Dikkatli bir şekilde PBMCs önce içeren beyaz yüzük çıkarılması PBS seyreltilmiş plazma ve son olarak mümkün olduğu kadar yoğunluk degrade katman tarafından takip çıkarın.
-
Nötrofil nötrofil/eritrositler mix dan ayırmak için eritrositler soğuk steril distile su tarafından parçalayıcı.
- Soğuk steril distile su şişesi al ve 10 x PBS şişe buzdolabından yoğunlaşmıştır.
- Hızlı bir şekilde iş için bu adım. 36 mL soğuk steril distile su doğrudan Pelet üzerine ve bir kez dikkatlice karıştırın. 10 x PBS 4 mL 20 sonra ekleyin s izotonik bir çözüm yapmak. Bir kez dikkatlice karıştırın.
- Tüp 5 min vasıl 739 x g ve 4 ° C (RBCs kaldırılmak) için spin. Nötrofil beyaz Pelet olacak.
- Dikkatle süpernatant atmak. Adım 1.6.2 yeniden uygulayın ve Pelet düzgün askıya alınır emin olun.
- Tüp vasıl 328 x g 5 min ve 4 ° c için spin
- Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS 5 mL resuspend. Nötrofil sayısı ve buz üzerinde tutun.
Not: Beklenen 1 tüp kan (10 mL) yaklaşık 15-75 milyon nötrofil verimidir.
2. kırmızı floresan hücre nötrofil etiketleme
- 10-20 milyon nötrofil nötrofil süspansiyon PBS 2 mL 15 mL tüp içinde olun.
- 2 mL PBS bir çözüm ile 2 µM kırmızı floresan hücre bağlayıcı 4 µL olun ( Tablo malzemelerigörmek) farklı 15 mL tüp içinde. Bu yavaşça nötrofil süspansiyon ve dikkatlice karıştırın.
- Karanlıkta tam olarak 25 dk 37 ° C'de nötrofil kırmızı floresan hücre bağlayıcı ile etiketlemek için kuluçkaya.
- RPMI 1640 orta % 10 ısı içeren fetal Sığır serum (FCS) inaktive ekleyerek RT en çok 15 mL karışımı etiketleme ve bir kez dikkatlice devre dışı. Bir Pelet oluşturmuştur Eğer Pelet dikkatli bir şekilde resuspended emin olun.
- Tüp 328 x g ve RT. 5 min için spin
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet 5 mL RPMI 1640 fenol red-Alerjik resuspend Orta % 2 FCS ve % 10 içeren P/S RT. saymak nötrofiller.
Not: Bir hücre kaybı % 50 kırmızı floresan hücre etiketleme sonra ortaya çıkabilir.
3. indüksiyon nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu
- Ücretsiz RPMI 1640 orta içeren % 2 FCS ve %10 0,42 106 hücre/mL fenol kırmızı x bir hücre süspansiyon yapmak P/S.
- 37.500 nötrofil siyah 96-şey, düz alt plaka bir kuyu başına 90 µL ekleyin.
- Seçilen uyarıcı (örneğin, hastanın sera) 10 µL % 10 iyi bir konsantrasyon ulaşmak için nüsha ekleyin. Her zaman negatif kontrol (orta) nüsha içerir.
- Karanlıkta 37 ° C'de 30 dk arasında değişen 2, 4 veya 6 h. kuluçka için 4 h önerilir için istenen kez kuluçkaya.
- Birimin 25 eklemek µL 5 µM geçirimsiz DNA'ın (bkz. Tablo reçetesi) iyi 1 µM son bir konsantrasyon ulaşmak için boya hesaplamak. Bir predilution yapmak gerekirse RPMI 1640 orta içeren % 2 FCS ve % 10 P/S 5 mikron konsantrasyonu elde edilir.
- 5 µM geçirimsiz DNA boya 15 dk 25 µL kuluçka süresi sona ermeden ekleyin. Karanlıkta 37 ° C'de kuluçka başka bir 15 dakika devam.
- Süpernatant (~ 125 µL) çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve gerekirse saklayın. 100 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Karanlıkta bırakın ve hemen adım 4 ile devam edin.
4. NET görselleştirme ile 3D yüksek içeriği, yüksek çözünürlüklü ayirt Confocal mikroskobu
-
Ayirt confocal mikroskobunun edinme kurulum üzerinde tıklatarak ayarlarını yapılandırır.
- Konfigürasyon tanımla sekmesini tıklatın.
- Objektif ve kamera seçeneklerini belirleyin. 10 X Apo Lambda amacı ile bir confocal 60 µm iğne deliği bir satın alma modu seçin.
- Plaka üzerinde tıklatın ve 96-şey Plastik tabak seçin. Ziyaret edin ve siteleri sabit bir dizi seçim için siteleri seçin. 3 sütun ve iyi % 45 toplam kapsayan 3 satır çakışma (0 µm), olmadan doldurun.
- Satın almaüzerinde'yi tıklatın. Lazer tabanlı odaklanarak etkinleştir' i seçin. Z serisi/saat serisi elde etmek gerekirse seçin.
- Site otomatik odaklamaüzerinde'yi tıklatın.
- Tıklayın plaka alt odak | Off-Set alt kalınlığı tarafından. Örnek bulmak için ilk şey seçmek için ilk iyi satın aldı. Site otofokus için tüm siteleri seçin.
- Dalgaboyuüzerinde'yi tıklatın.
- Dalga boylarında numarası için 2 2 TL gölgelendirme düzeltme arıtma düzeyi için seçin.
- Dalga boyu 1, Texas kırmızıyı seçin.
- Otomatik odaklama seçenekleri, select Z ofset, laserle için lazer ofset 1.1 µm. Kullanım Z-yığını ile özel bir sıra 200-10 post.
- Dalga boyu 2, FITC seçin.
- Otomatik odaklama seçenekleri için seçin w1 Z ofset ile 0 µm. Kullanım Z-yığın 200-10 özel bir dizi ile lazer.
- Z serisi ve 2D projeksiyon görüntü maksimum edinme seçeneklerini seçin. Satın alma seçenekleri için gölgelendirme düzeltme seçin | Kapalı.
- Z Serisiseçin. Adım sayısını seçin: 10. Adım boyu seçin: 3 mm (Toplam Aralık 27 µm olacak).
-
Plaka ayirt confocal mikroskobu koymak.
- Çalıştır sekmesinde tıklatın.
- Plaka adı ve açıklama doldurmak ve depolama konumu seçin.
- Elde edilebilir için ihtiyacınız wells seçin.
- Çalıştır sekmesinde tıklatın.
- Pozlama süresi Texas kırmızı ve FITC için seçin.
- Elde plaka plaka başına yaklaşık 1 saat sürer satın başlatmak için tıklatın.
5. analiz NET oluşumu
- Bir görüntü işleme ( Tablo malzemelerigörmek) bilimsel çok boyutlu görüntüleri analiz için NET oluşumu analiz etmek için tasarlanmış bir program kullanın.
- Elde edilen görüntü verilerini ayrı bir sabit diske aktarmak.
-
Araç ekleyerek rengini seçin.
- W1 seçin ve belgili tanımlık sert sokmak verilerin nerede saklanacağı klasörü seçin.
- W2 seçin ve belgili tanımlık sert sokmak verilerin nerede saklanacağı klasörü seçin.
Not: W1 kırmızı renk Texas kırmızı resimlere eklemek için dosya adını kullanan ve yeşil renk FITC görüntüler eklemek için w2 kullanan standart bir makro kullanın.
-
Analiz makroyu seçin.
- W1seçin, genellikle 10 olan eşik değer (yoğunluk eşik) seçin. İstediğiniz piksel değeri (boyutu eşiğini, örneğin, 100) seçin.
- W2seçin, genellikle 10 olan eşik değer (yoğunluk eşik) seçin. İstediğiniz piksel değeri (boyutu eşiğini, örneğin, 500) seçin.
- Elektronik tablo dosyası için hedef seçin çalıştırmak analiz ve günlük dosyaları daha sonra kaydedin.
- Elektronik tablodaki verileri analiz.
Representative Results
Nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumu 3D bir şekilde her şey odak düzlemi başlayan 3 µm mesafe ile 10 Z yığınlarının üzerinde lekeli ekstraselüler DNA miktarının tarafından sayılabilir. Toplu Alan, tahlil artar (Şekil 1A) duyarlılığını ölçerek. İzole nötrofil %98.7 %1,10 14 farklı örnekleri farklı izolasyonların cinsinden standart sapma (SD) ile ortalama saflığı var. Kırmızı kan hücrelerinin ortalama yüzde %1.04 ± % 1.1 SD ve monosit ortalama yüzdesini %0.085 ± %0.17 SD (veri gösterilmez). Toplam alan lekeli nötrofil görüntüsü sadece önemli ölçüde her iyi Pearson korelasyon katsayısı 0,99 (% 95 güven aralığı [CI] 0.985-0.997 ile toplam nötrofil sayısı ile ilişkilendirmek, her şey odak düzlemi içinde sayılabilir p < 0.0001) (Şekil 1B). Miktar nötrofil NET oluşumu temsilcisi sonucu % 10 sera AAV hastalar veya orta (MED) ile toplu lekeli ekstraselüler DNA alanı olarak ifade edilen bir negatif kontrol olarak görüntülü nötrofil (şekil başına 10 Z yığınlarının uyarılmış 1 C). anlık görüntülerin temsilcisi unstimulated nötrofil (Şekil 2A) ve ağlarının AAV uyarılmış nötrofil (Şekil 2B) gösterilir.
Şekil 1: hücre dışı DNA ve nötrofil sayısı ölçme tarafından NET oluşumu Quantification. Her unstimulated nötrofil (MED) için iyi ve nötrofiller için (AAV) hastaların % 10 ANCA ile ilişkili vaskülit serumla teşvik için(a)alan 10 Z yığınlarının üzerinde üst üste sayılabilir (n = 4) bir görüntü işleme programı ile sayılabilir. Her uyarıcı nüsha test edildi, ortanca değer her noktasını temsil eder. (B) kırmızı floresan etiketli hücre alan ve hücre sayısı görüntü işleme programı tarafından her şey odak düzlemi içinde sayısal (R2 0,99, p < 0,0001 =). (C) NET oluşumu görüntülü nötrofil (hücre alan) başına toplu alanı olarak ifade edilir. Her nüsha (SEM) ortalaması ortalama ± standart hatasını uyarıcı çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: anlık görüntülerini NET miktar tahlil. Floresan etiketli nötrofil kırmızıyla gösterilir ve lekeli ekstraselüler DNA yeşille gösterilir. 10 x Apo Lambda planı amaç. (A)Unstimulated nötrofiller. (B) nötrofil AAV serum ile uyarılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu tahlil en kritik parçası nötrofil kısa ömürlü ve dondurulmuş ne zaman ölmek çünkü taze izole nötrofil her deneme için kullanmak için ihtiyaçtır. Bu varyasyonlar donör özellikleri nedeniyle işe bulaştırmak her zaman sağlıklı bir donör gerektirir. Bu varyasyonlar biridir nötrofil harekete geçirmek durum. Nötrofil zaten içinde vivo yalıtım önce aktif. Ayrıca, nötrofiller özellikle eritrositler lizis sırasında yalıtım adımları etkinleştirilebilmesi için bu nedenle nötrofil deneyimli bir işleyicisi nötrofil aktivasyonu en aza indirmek için gereklidir. Genel olarak, nötrofil yalıtım en kısa zamanda çizim kan sonra yapılmalıdır ve deneme aşırı kendiliğinden harekete geçirmek önlemek için duraklatıldı değil. İkinci olarak, kaba işleme nötrofil-meli var olmak kaçmak. Bu nedenle, nötrofil bir 96-şey plaka numaralı seribaşı bir kez açıklanan protokol önemli avantajı en az pipetting müdahaleler olduğunu. Önemlisi, nötrofil etkinleştirme durumunu en iyi bu tahlil hassas NET oluşumu seviyesinin düşük algılayabilir unstimulated durumda değerlendirilir. Tahlil etkileyen bir başka faktör orta FCS kullanımıdır. FCS yüzdesi % 10 dan % NET oluşumu mümkün bastırılması önlemek için 2 için antioksidan aktivite19,20 veya nötrofil ısı inactivation rağmen mümkün aktivasyonu tarafından azaltılan. Kültür FCS olmadan ya da medya kullanım farklı tipleri ile çalıştı değil. Bir unstimulated veya orta denetimi her zaman boyunca tahlil yaparken arka plan sinyal (örneğin, harekete geçirmek durum nötrofil) belirtisi için alınır. Unstimulated örneğe göre her uyarıcı kat artış aynı uyarıcı kullanarak farklı deneyler üzerinde tutarlı sonuçlar elde etmek için görüntülenir.
NET oluşum sürecine ilgisi yoktur hücre dışı DNA'ın olası yüksek arka plan için önemli bir faktör boyama. Bu hücre dışı DNA hemen kısa kuluçka süresi 15 dk sonra boyama kaldırma ve plaka doğrudan fiksasyon sonra analiz azaltmak mevcut tahlil çalışır. Bu nedenle, yeterince hız 96-şey plaka yakalamak için analitik güç sahip ve gelişmiş bir confocal mikroskop kullanmak için esastır içinde 1-2 h. otomatik odaklama ve çekim hızı ayar önerilir. Bu nedenle, mikroskop ayar her örnek arasında değişir ve genel olarak en iyi görüntü kalitesi için gerekli olan renk yoğunluğu eşik ile ilgili deneme. İkinci etkileri nötrofil ve ağlar ve en iyi ayarı doğru ölçmek için nihai yeteneği bu nedenle birden fazla denetim örnekleri (örneğin, sağlıklı kontrol serumu) kullanarak onaylanması. Çekilen fotoğraf analizi sırasında NET oluşumu daha iyi bir seçim için bir piksel eşik ve boyutu eşiğini analiz programında kullanımına izin verir.
NET oluşumu türetilmiş hücre dışı DNA'sı farklı ölüm yolları, NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis veya hayati NET oluşumu1bile litik süreci de dahil olmak üzere sonucu olabilir. Bu nedenle, bir sınırlama mevcut testin sadece hücre dışı DNA için boyama tarafından hiçbir farklılaşma NET oluşumu ve diğer ilgili hücre ölüm yolları arasında mümkün olmasıdır. Bu NET oluşumu destek farklı formlar arasında ayırımcılık veya ayrı immunostainings tarafından citH3 ve NE gibi belirli NET işaretleri varlığını doğrulamak için farklı ölüm yolları her iki seçmeli inhibitörleri kullanarak elde etmek mümkündür, DNA ile birlikte lokalize. Hücre dışı DNA citH3 ile ve NE eş lokalizasyonu son zamanlarda bu tahlil10için onaylamıştır. Bu tahlil NET belirli işaretleyicilerini kaçınarak avantajı sağlar NET oluşumu DNA ekstrüzyon için tam ve potansiyeli yüksek üretilen iş tarama ile mümkün olduğunca objektif olarak olarak nötrofil tarafından önde gelen her türlü değerlendirmek için. Bu iletişim kuralı uygulanabilirliği düşük düzey NET indüksiyon yeteneği nitel ve nicel farklılıkları algılamak için işlem türü önemli olabilir otoimmün hastalık bağışıklık kompleksleri tarafından aracılı okumak gösterilmiştir dahil10,21,22. Bu roman NET miktar tahlil NET oluşumu çeşitli yönlerini incelemek farklı araştırmacılar için katma değeri olabilir gösteren. Tahlil ufak değişiklikler uygulamaya kolayca: stimülasyon dönemi, NET oluşumu için önde gelen bir belirli ölüm yolu odaklanmak için favori bir NET marker kullanımı, farklı büyütme kullanımı veya farklı NET ölçütünde kullanımı düzeltilmesi miktar ve analiz.
Sonuç olarak, gelen doğrulama yarı otomatik miktar farklı uyaranlara üzerine ağlar ex vivo indüksiyon değerlendirilmesi için NET oluşumu için çok hassas geniş uygulanabilir tahlil olduğunu.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Eline J. Arends ve Y.K. Onno Teng çalışmalarını Hollandalı böbrek Vakfı (17OKG04), bilimsel araştırma (90713460) Hollanda kuruluştan klinik arkadaş grubu tarafından desteklenir. Laura S. van Dam'ın iş Vakfı araştırma Romatoloji (FOREUM) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
| Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
| Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
| Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
| Penicillin/streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
| Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
| PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
| Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
| RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
| Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
| 96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |
References
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
- Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
- Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
- Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
- Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
- Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
- Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
- Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).
