Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En høy gjennomstrømming analysen vurdere og kvantifisere nøytrofile ekstracellulære felle formasjon

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en svært følsom og høy gjennomstrømning nøytrofile ekstracellulære felle (NET) analysen for den semi-automatisert kvantifiseringen av ex vivo NET dannelsen av immunofluorescence tredimensjonal AC confocal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes til å evaluere netto dannelse og fornedrelse etter ulike stimuli og kan brukes til å studere mulige NET-målrettet terapi.

Abstract

Nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er immunogenic ekstracellulære DNA-strukturer som kan bli utgitt av nøytrofile på en rekke utløsere. Garn har vist seg for å fungere som en viktig vert forsvar mekanisme som feller og dreper mikroorganismer. På den annen side, har de vært innblandet i ulike systemisk autoimmune sykdommer. Nettene er immunogenic og giftig strukturer som inneholder et utvalg av relevante autoantigens inkludert anti-neutrophil cytoplasmatiske antistoffer (ANCA)-tilknyttede vaskulitt (AAV) og systemisk lupus erythematosus (SLE). Ulike former for garn kan bli indusert avhengig av stimulans. Mengden av nett kan kvantifiseres bruke ulike teknikker som måler DNA utgivelse i supernatants, måle DNA-kompleksbundet med NET-molekyler som myeloperoxidase (MPO) eller nøytrofile elastase (NE), måle tilstedeværelsen av citrullinated histones av fluorescens mikroskopi eller flyt cytometric påvisning av NET-komponenter som har forskjellige funksjoner om deres spesifisitet, følsomhet, objektivitet og antall. Her er en protokoll for å kvantifisere ex vivo NET formasjon i en svært sensitive, høy gjennomstrømming måte ved å bruke tredimensjonale immunofluorescence AC confocal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes for å løse ulike problemstillinger om NET dannelse og fornedrelse i helse og sykdom.

Introduction

Dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er prosessen der nøytrofile løslate deres DNA i en ekstracellulære tredimensjonale (3D) web som struktur, kompleksbundet med et bredt spekter antimikrobielle og farlig molekyler, granulerte og cytoplasmatiske enzymer, peptider og proteiner. Disse immunogenic og giftige strukturer har en viktig fysiologiske rolle i medfødte immunsystemet forsvaret av friske individer ved overlapping og drepe smittsomme patogener1. Men de har også blitt vist for å være involvert i trombose2 og ulike systemisk autoimmune sykdommer, inkludert anti-neutrophil cytoplasmatiske antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitt (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antiphospholipid syndrom (APS)2,6, revmatoid artritt (RA), psoriasis og gikt7,8,9.

In vitro netto dannelsen har vært mye studert med det kjemiske sammensatte phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), som induserer massive netto formasjon. Men mest fysiologiske stimuli indusere mye lavere nivåer av netto formasjon10. Å studere NET-utløsere i, for eksempel en autoimmun sykdom setting, er en standardisert, følsom, høy gjennomstrømming kvantitative analysen nødvendig for å oppdage og kvantifisere netto formasjon. Kvantifisering av garn har vist seg for å være utfordrende og utføres nå av forskjellige metoder, hver med sine egne fordeler og begrensninger11. En vanlig metode er oppdagelsen av DNA i den supernatants12, som er målet, men ikke diskriminerer mellom opprinnelsen til DNA (apoptotisk, nekrose, garn), og derfor er ikke meget spesifikk for garn. For det andre enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) av DNA-kompleksbundet med NET-spesifikke proteiner, for eksempel myeloperoxidase (MPO) eller nøytrofile elastase (NE), er en mer konkret tilnærming til oppdage garn og ble vist for å korrelere med citrullinated histone-3 (CitH3) positive garn13. Men er det ikke kjent om denne metoden er sensitive nok til å plukke opp alle garn (f.eks MPO, NE, og CitH3 negative nett). En tredje tilnærming er immunofluorescence mikroskopi som brukes til å oppdage co lokalisering av NET-assosiert molekyler (NE, MPO, CitH3) med ekstracellulære DNA å kvantifisere garn. Denne metoden er vanligvis spesifikke for garn, men det kan ikke brukes som høy gjennomstrømming og ikke mål på grunn av observatør bias. I tillegg tar denne metoden ikke hensyn MPO-, NE-, CitH3-negativ garn som er ofte avhengig av brukt NET-utløser14,15. Flow cytometri tilnærminger oppdage garn gjennom et endret forover/sidelengs scatter (FSC/SSC) indikerer hevelse av kjernen i NET-ting nøytrofile16. Denne metoden tar ikke hensyn til ulike former for netto formasjon som har blitt identifisert, som ikke kanskje involverer hevelse i kjernen, som avgjørende netto formasjon17. Til slutt, immunofluorescence AC confocal mikroskopi er brukt for å visualisere og kvantifisere netto dannelsen av direkte flekker ekstracellulære DNA med en celle-ugjennomtrengelig fargestoff som flekker ekstracellulære DNA12,18. Vanligvis er 5 til 10 høyeffekts felt manuelt plukket og vurdert, som dekker 1-5% av hver brønn en 96-brønns plate11,17. Manuelt valg av bilder er ikke alltid objektiv, utsatt for partiskhet og ikke attraktiv for høy gjennomstrømming analyse. En automatisert, høy gjennomstrømming netto kvantifisering analysen ble nylig utviklet, som avbildet 11% av brønnen i en 3D måte dekker 13 µm gjennom Z-stablet immunofluorescence AC confocal mikroskopi, og dermed fører til en svært følsom teknikk å vurdere garn i forhold til konvensjonelle metoder10. Gjeldende rapport beskriver den nyeste protokollen for å kvantifisere netto formasjon gjennom en automatisert, svært følsom analysen med 3D AC confocal mikroskopi, som oppnår et bildebasert totalareal på 45% av hver brønn og dekker 27 µm gjennom Z-stabler. Denne protokollen er egnet til å kvantifisere, med en høy følsomhet, lave nivåer av netto formasjon i en objektiv og upartisk måte.

Protocol

Alle pasienter og sunn kontroller samtykket i å delta i LUMC biobank. Begge biobanking studier ble godkjent av LUMC etiske komiteen.

1. isolering av sunn nøytrofile

  1. Få 20 mL perifert blod fra en frisk donor i to 10 mL EDTA-belagt rør.
  2. Sette 10 mL blod i et sterilt 50 mL rør og legge fosfat bufret saltvann (PBS) til 32,5 mL.
  3. Legg til tetthet gradert (f.eks., Ficoll-amidotrizoaat) under cellene.
    1. Ta opp 14 mL av gradient med 10 mL Pipetter og Pipetter kontrolleren.
    2. Sted Pipetter nederst på 50 mL tube.
    3. Ta Pipetter kontrolleren av Pipetter, slik at tetthet graderingen strømme ut av Pipetter av tyngdekraften til maksimumsverdien nås av kapillær effekt (1-2 mL vil stå), uten å bruke motoren.
    4. Fjerne Pipetter ved å plassere en tommel på Pipetter, og dermed hindre tetthet gradert lekker under fjerning av pipetter.
  4. Spinne rør for 20 min på 912 x g og romtemperatur (RT) uten akselerasjon og brems.
    Merk: Røde blodlegemer (RBC) og nøytrofile har en høy tetthet og er på bunnen av 50 mL tube. Perifert blod mononukleære celler (PBMCs) er atskilt og over tetthet graderingen som en hvit ring. PBS-utvannet plasma vil være over PBMCs. Eventuelt PBMCs kan isoleres ved å overføre hvit ringen til en ny 50 mL tube med ekstra vask trinn med PBS.
  5. Forsiktig fjerne hvit ringen som inneholder PBMCs først, etterfulgt av fjerning av plasma PBS-utvannet og til slutt tetthet gradert laget så mye som mulig.
  6. For å isolere nøytrofile fra nøytrofile/erytrocytter mix, lyse erytrocytter ved kaldt sterilt destillert vann.
    1. Ta kaldt sterilt destillert vann flaske og 10 x konsentrert PBS kolbe fra kjøleskapet.
    2. Arbeide raskt for dette trinnet. Legg 36 mL kaldt sterilt destillert vann direkte over pellet og bland når nøye. Legge til 4 mL 10 x PBS etter 20 s å lage en isotonic løsning. Bland når nøye.
    3. Spinne rør for 5 min 739 x g og 4 ° C (for fjerning av RBCs). Nøytrofile vil være i det hvite pellet.
    4. Forsiktig kaste nedbryting. Utføre trinn 1.6.2 igjen og sikre pellet er suspendert riktig.
    5. Spin rør for 5 min 328 x g og 4 ° C.
    6. Nøye fjerne nedbryting og resuspend pellet i 5 mL av PBS. Telle nøytrofile og holde dem på isen.
      Merk: Forventet avkastning fra 1 tube blod (10 mL) er ca 15-75 millioner nøytrofile.

2. røde fluorescerende celle merking av nøytrofile

  1. Foreta en nøytrofile suspensjon av 10-20 millioner nøytrofile i 2 mL PBS i en 15 mL tube.
  2. Lage en løsning på 2 mL PBS med 4 µL av 2 µM røde fluorescerende celle koblingsfunksjonalitet (se Tabell for materiale) i en annen 15 mL tube. Legg dette forsiktig til nøytrofile suspensjon og bland forsiktig.
  3. Inkuber i mørket nøyaktig 25 min på 37 ° C Merk nøytrofile med røde fluorescerende celle linker.
  4. Deaktiver merkingen ved å legge RPMI 1640 medium som inneholder 10% varme inaktivert fosterets bovin serum (FCS) på RT opptil 15 mL og bland når nøye. Kontroller at pellet er nøye resuspended hvis pellets har dannet.
  5. Spin rør for 5 min på 328 x g og RT.
  6. Fjerne nedbryting og resuspend pellets i 5 mL av fenol red-fri RPMI 1640 medium som inneholder 2% FCS og 10% P/S på RT. telle nøytrofile.
    Merk: Cellen tap av 50% kan oppstå etter rød fluorescerende celle merking.

3. induksjon av nøytrofile ekstracellulære felle formasjon

  1. Gjøre en celle suspensjon av 0.42 x 106 celler/mL i fenol rødt RPMI 1640 medium som inneholder 2% FCS og 10% P/S.
  2. Legge til 37 500 nøytrofile i 90 µL per brønn i en svart 96-brønnen, flat bunn plate.
  3. Legge til 10 µL av valgte stimulans (f.eks sera av pasient) i tre eksemplarer å nå en konsentrasjon på 10% i brønnen. Alltid inkludere en negativ kontroll (middels) i tre eksemplarer.
  4. Inkuber i mørket på 37 ° C for tiden, alt fra 30 minutter til 2, 4 eller 6 h. rugende for 4 h er foreslått.
  5. Beregne volumet nødvendig til 25 µL av 5 µM ugjennomtrengelig DNA fargestoff (se Tabell for materiale), for å nå en siste konsentrasjon på 1 µM i brønnen. Gjøre en predilution om nødvendig i RPMI 1640 medium som inneholder 2% FCS og 10% P/S for å få en 5 µM konsentrasjon.
  6. Legge til 25 µL 5 µM ugjennomtrengelig DNA fargestoff 15 minutter før slutten av inkubasjon tiden. Fortsette inkubasjonstiden for en annen 15 min på 37 ° C i mørket.
  7. Fjern nedbryting (~ 125 µL) nøye og lagre hvis nødvendig. Legg 100 µL av 4% paraformaldehyde (PFA). Mørkt, og umiddelbart gå videre til trinn 4.

4. NET visualisering med 3D høyt innhold, høy oppløsning Immunofluorescence AC Confocal mikroskopi

  1. Konfigurer innstillingene på immunofluorescence AC confocal mikroskopet ved å klikke på kjøp oppsettet.
    1. Klikk på fanen Konfigurer .
    2. Velg målsettingen og kameraet. Velg 10 X Apo Lambda målet med en oppkjøpet modus av en AC confocal 60 µm pinhole.
    3. Klikk på Plate og velg 96-brønns plast plate. Velg stedene å besøke og velge et bestemt antall områder. Fyll ut 3 kolonner og 3 rader uten overlapping (0 µm), som dekker totalt 45% av brønnen.
    4. Klikk på Kjøp. Velg Aktiver Laser-basert fokus. Velg Erverve Z serien/klokkeslett serien hvis nødvendig.
    5. Klikk på nettstedet autofokus.
      1. Klikk på fokus på Plate nederst | Off-Set av bunnen tykkelse. For det første godt finne utvalgsgjennomsnittet, velger du den første brønnen kjøpt. Nettstedet autofokus, velge alle områder.
    6. Klikk på bølgelengder.
      1. Antall bølgelengder, Velg 2. TL skyggelegging korreksjon raffinement nivået, Velg 2.
      2. Bølgelengde 1, velge Texas Red.
        1. For autofokus alternativer, Velg laser med Z offset, legge laser forskyvning 1.1 µm. Bruk Z stabel med et tilpasset utvalg av 200-10.
      3. For bølgelengde 2, velger du FITC.
        1. For autofokus alternativer, Velg som er laser med Z forskyvningen fra w1 0 µm. Bruk Z stabel med et tilpasset utvalg av 200-10.
        2. Velg Z-serien og 2D-projeksjon bilde maksimal alternativene oppkjøpet. Oppkjøpet alternativene, velger skyggelegging korrigering | Av.
    7. Velg Z-serien. Velg antall trinn: 10. Velge trinn: 3 mm (total rekkevidde vil bli 27 µm).
  2. Sett platen i immunofluorescence AC confocal mikroskopi.
    1. Klikk kategorien kjøre .
      1. Fyll ut platen navn og beskrivelse og velge lagringsplasseringen.
      2. Velg brønnene som må anskaffes.
  3. Velg eksponeringstid for Texas rød og FITC.
  4. Klikk på Erverve Plate å starte oppkjøpet, som vil ta ca 1t per plate.

5. analyse av netto formasjon

  1. Bruk en bildebehandling program utviklet for analyse av vitenskapelig flerdimensjonale bilder (se Tabell of Materials) til å analysere netto dannelsen.
  2. Overføre ervervet bildedataene til en egen harddisk.
  3. Velg fargen legge til verktøy.
    1. Velg w1 og velg mappen i harddisken der dataene er lagret.
    2. Velg w2 og velg mappen i harddisken der dataene er lagret.
      Merk: Bruk standard makroen som bruker w1 i filnavnet til rød farge til Texas Red bildene og bruker w2 legge grønn farge til FITC bilder.
  4. Velg analyse makro.
    1. Velg w1, angi terskelverdien (intensitet terskel), som vanligvis er 10. Velg ønsket bildepunktverdien (størrelse terskel, eksempelvis 100).
    2. Velg w2, angi terskelverdien (intensitet terskel), som vanligvis er 10. Velg ønsket bildepunktverdien (størrelse terskel, f.eks 500).
    3. Velg målet for regnearkfilen, Kjør analyse, og lagre loggfiler etterpå.
  5. Analysere data i et regneark.

Representative Results

Nøytrofile ekstracellulære felle (NET) formasjon er kvantifisert i en 3D måte av kvantifisere farget ekstracellulære DNA over 10 Z-stabler med 3 µm avstand starter på fokalplanet i hver brønn. Ved å måle samlede området, følsomheten av analysen øker (figur 1A). De isolerte nøytrofile har en gjennomsnittlig renhet på 98.7% med standardavviket (SD) på 1,10% målt i 14 forskjellige prøver fra ulike isolasjoner. Mener prosentandelen av røde blodlegemer er 1.04% ± 1,1% SD mener prosentandelen av monocytter er 0.085% ± 0,17% SD (data ikke vist). Det totale området av flekker nøytrofile fotografert er kvantifisert i fokalplanet i hver brønn, som korrelerer betydelig med totalt nøytrofile teller i hver brønn med en Pearson korrelasjonskoeffisient av 0,99 (95% konfidensintervall [CI] 0.985-0.997, p < 0,0001) (figur 1B). Representant utfallet av kvantifisering av netto formasjon i nøytrofile stimulert med 10% sera AAV pasienter eller medium (MED) som en negativ kontroll, uttrykt som kumulative stained ekstracellulære DNA området over 10 Z-stabler per fotografert nøytrofile (figur 1 C). øyeblikksbilder av representant bilder av unstimulated nøytrofile (figur 2A) og garn i AAV-stimulert nøytrofile (figur 2B) vises.

Figure 1
Figur 1: kvantifisering av netto dannelsen ved å måle ekstracellulære DNA og nøytrofile teller. (A) området er kumulativt kvantifisert over 10 Z-stabler for hver godt for unstimulated nøytrofile (MED) og nøytrofile stimulert med 10% serum av ANCA-assosiert vaskulitt (AAV) pasienter (n = 4) kvantifisert et bildebehandling program. Hver stimulans ble testet i tre eksemplarer, hvert punkt representerer medianverdien. (B) rød fluorescerende merket område og celle celletall kvantifisert i fokalplanet i hver brønn av programmet bildebehandling (R2 = 0,99, p < 0,0001). (C) netto formasjon uttrykkes kumulative området per fotografert nøytrofile (celle-området). Gjennomsnittlig ± standardfeil av gjsnitt (SEM) av hver tre eksemplarer tegnes per stimulans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: øyeblikksbilder av netto kvantifisering analysen. Fluorescerende merket nøytrofile er vist i rødt, og farget ekstracellulære DNA vises i grønt. 10 x Plan Apo Lambda mål. (A) Unstimulated nøytrofile. (B) nøytrofile stimulert med AAV serum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den viktigste delen av denne analysen er behovet for å bruke fersk isolert nøytrofile for hvert eksperiment fordi nøytrofile er kortvarige og dø når frosset. Dette krever en frisk donor hver gang, som kunne implisere noen variasjoner på grunn av donor egenskapene. En av disse variantene er aktiviseringen rang av nøytrofile. Nøytrofile kan aktiveres allerede i vivo før isolasjon. I tillegg nøytrofile kan aktiveres gjennom punktene isolasjon spesielt under lysis av erytrocytter, derfor en erfaren handler nøytrofile er nødvendig for å minimere aktivering av nøytrofile. Generelt, isolering av nøytrofile skal utføres så snart som mulig etter blod tegne og eksperimentet bør ikke stoppes midlertidig for å unngå overdreven spontan aktivering. Dernest bør uforsiktig håndtering av nøytrofile unngås. Som sådan, er den bemerkelsesverdige fordelen med beskrevet protokollen minimal pipettering intervensjonene når nøytrofile er sådd i en 96-brønns plate. Viktigere, er aktiviseringen rang av nøytrofile best ilignet i unstimulated tilstand, som denne analysen finner følsomt lave nivåer av netto formasjon. En annen faktor som kan påvirke analysen er bruk av FCS i mediet. Andelen FCS er blitt avtatt fra 10% til 2% å unngå mulig undertrykkelse av netto dannelsen av antioksidant aktivitet19,20 eller mulig aktivering av nøytrofile tross varme inaktivering. Kultur uten FCS eller bruke ulike typer medier har ikke vært forsøkt. En unstimulated eller middels kontroll er alltid tatt langs når analysen har en indikasjon på bakgrunn signal (f.eks, aktivisering rang av nøytrofile). Fold øker for hver stimulans sammenlignet unstimulated prøven vises for å oppnå konsistente resultater over forskjellige eksperimenter ved hjelp av samme stimulans.

En viktig faktor for en mulig høy bakgrunn er flekker ekstracellulære DNA som er relatert til prosessen med netto formasjon. Nåværende analysen forsøker å redusere dette ved å fjerne den ekstracellulære DNA flekker umiddelbart etter kort vekst på 15 min og analysere platen direkte etter fiksering. Derfor er det viktig å bruke en avansert AC confocal mikroskop som har nok fart og analytisk kraften 96-brønns platen innen 1 til 2 h. automatisert eksponeringstid og fokus er anbefalt. Slik kan innstillingen mikroskop variere mellom hver prøve og eksperimentere med hensyn til farge intensitet terskelen som er nødvendig for samlet optimal bildekvalitet. Sistnevnte påvirkninger eventuell evnen å riktig kvantifisere nøytrofile og garn og den optimale innstillingen bør derfor bli bekreftet av flere kontroll utvalg (f.eks serum sunn kontroller). Under analysen av bildene gir bruk av en piksel terskelen og size terskel i analyseprogrammet et bedre utvalg av netto formasjon.

Ekstracellulære DNA fra NET formasjon kan være et resultat av forskjellige død, inkludert NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller selv ikke-lytisk prosessen med viktig netto formasjon1. Slik er en begrensning av nåværende analysen at av flekker bare for ekstracellulære DNA det er ingen forskjell mulig mellom netto formasjon og andre relevante celle død trasé. Det er mulig å oppnå dette ved å bruke enten selektiv hemmere av forskjellige død å skille mellom ulike former underbygger netto formasjon eller bekrefte av separat immunostainings tilstedeværelse av bestemte netto markører, som citH3 og NE, Co lokalisert med DNA. Den co lokaliseringen av ekstracellulære DNA med citH3 og NE har nylig blitt bekreftet for denne analysen10. Fordelen med å unngå NET bestemt markører i denne analysen, kan vurdere alle former for netto formasjon fører til ekstrudering DNA av nøytrofile så fullstendig og så objektiv som mulig med potensial for høy gjennomstrømming screening. Anvendelsen av denne protokollen har vært vist i studier lavt nivå netto induksjon formidlet av immun komplekser i auto-immune sykdommer som muligheten til å oppdage kvalitativ og kvantitativ forskjeller kan være viktigere enn Prosesstypen involvert10,21,22. Illustrerer at denne romanen netto kvantifisering analysen kan være av verdi for ulike forskere å undersøke ulike sider av netto formasjon. Små justeringer analysen implementeres enkelt: justering av stimulering perioden, bruk av en favoritt netto markør å fokusere på en bestemt død sti fører til netto formasjon, bruk av en annen forstørrelse eller bruk av ulike netto kriterier i kvantifisering og analyse.

Avslutningsvis er protokollen gitt en svært sensitive bredt aktuelt analysen for den semi-automatisert kvantifiseringen av netto formasjon for vurdering av ex vivo induksjon av garn på ulike stimuli.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Eline J. Arends og Y.K. Onno Teng støttes av nederlandske nyre Foundation (17OKG04), klinisk fellesskap fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (90713460). Laura S. van DAMS arbeid støttes av grunnlaget for forskning i Rheumatology (FOREUM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua Sterile H2O B. Braun, Melsungen, Germany 12604052
Fetal bovine serum (FCS) Bodinco, Alkmaar, The Netherlands Used in high concentrations it could influcence NET formation
Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL LUMC, Leiden, The Netherlands 97902861
Immunofluorescence confocal microscope Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralization PBS (10x) Gibco, Paisley, UK 70011-036
Penicillin/streptomycin (p/s) Gibco, Paisley, UK 15070063
Phenol red free RPMI 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 11835-063 Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal
Phosphate-buffered saline (PBS) B. Braun, Melsungen, Germany 174628062
PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA PKH26GL-1KT PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan
Program for scientific multidimensional images analysis ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 52400-025
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye Gibco, Paisley, UK 57020
Trypan blue stain 0.4% Sigma Aldrich, Germany 17942E
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate Falcon, NY, USA 353219

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
  2. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  4. Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
  5. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
  6. Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
  7. Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
  8. Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
  9. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
  10. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  13. Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
  14. Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
  15. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
  16. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  17. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  18. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
  19. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
  20. von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  21. Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
  22. Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
  23. Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 nøytrofile ekstracellulære feller (nett) nøytrofile immunofluorescence mikroskopi immunologi systemisk autoimmun sykdom ANCA-assosiert vaskulitt systemisk lupus erythematosus lupus nefritt
En høy gjennomstrømming analysen vurdere og kvantifisere nøytrofile ekstracellulære felle formasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arends, E. J., van Dam, L. S.,… More

Arends, E. J., van Dam, L. S., Kraaij, T., Kamerling, S. W. A., Rabelink, T. J., van Kooten, C., Teng, Y. K. O. A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation. J. Vis. Exp. (143), e59150, doi:10.3791/59150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter