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Immunology and Infection

एक उच्च प्रवाह परख का आकलन करने के लिए और न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन यों तो

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक अति संवेदनशील और उच्च प्रवाह न्युट्रोफिल extracellular जाल (नेट) के लिए परख अर्द्ध स्वचालित ठहराव के इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीन आयामी फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo नेट गठन । इस प्रोटोकॉल के लिए अलग उत्तेजनाओं के बाद शुद्ध गठन और गिरावट का मूल्यांकन किया जा सकता है और संभावित शुद्ध लक्षित चिकित्सा अध्ययन किया जा सकता है ।

Abstract

न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) immunogenic extracellular डीएनए संरचनाओं कि ट्रिगर की एक विस्तृत विविधता पर न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किया जा सकता है । जाल एक महत्वपूर्ण मेजबान रक्षा तंत्र के रूप में सेवा करने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि ट्रैप और सूक्ष्मजीवों को मारता है । दूसरी ओर, वे विविध प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों में फंसाया गया है । जाल immunogenic और विषाक्त संरचनाओं कि विरोधी न्युट्रोफिल cytoplasmic एंटीबॉडी (ऐंका)-एसोसिएटेड वाहिकाशोथ (AAV) और प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE) सहित प्रासंगिक प्रतिजनों के एक पूल होते हैं । जाल के विभिंन रूपों उत्तेजना के आधार पर प्रेरित किया जा सकता है । जाल की राशि supernatants में डीएनए रिलीज को मापने सहित विभिंन तकनीकों का उपयोग कर quantified जा सकता है, डीएनए को मापने-myeloperoxidase (MPO) या न्युट्रोफिल elastase (NE) की तरह शुद्ध अणुओं के साथ जटिल, फॉस्फोलिपिड lgg की उपस्थिति मापने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा histones, या शुद्ध-घटक है जो सभी अपनी विशिष्टता, संवेदनशीलता, निष्पक्षता, और मात्रा के बारे में अलग विशेषताएं है के cytometric का पता लगाने के प्रवाह । यहां तीन आयामी इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक उच्च संवेदनशील, उच्च प्रवाह तरीके में पूर्व vivo नेट गठन यों तो एक प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल के लिए शुद्ध गठन और स्वास्थ्य और रोग में गिरावट के बारे में विभिंन अनुसंधान प्रश्नों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) के गठन की प्रक्रिया है जिसमें न्यूट्रोफिल एक extracellular तीन आयामी (3 डी) वेब संरचना की तरह, रोगाणुरोधी और खतरनाक अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ जटिल में उनके डीएनए जारी है, दानेदार और cytoplasmic एंजाइमों, पेप्टाइड्स और प्रोटीन । इन immunogenic और विषाक्त संरचनाओं को फँसाने और संक्रामक रोगजनकों की हत्या द्वारा स्वस्थ व्यक्तियों की सहज प्रतिरक्षा रक्षा में एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका है1. हालांकि, वे भी घनास्त्रता2 और विभिंन प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों में शामिल होने का प्रदर्शन किया गया है, सहित विरोधी न्युट्रोफिल cytoplasmic एंटीबॉडी (ऐंका)-एसोसिएटेड वाहिकाशोथ (AAV)3, प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE )4,5, antiphospholipid सिंड्रोम (ए पी एस)2,6, रुमेटी गठिया (आरए), सोरायसिस, और गाउट7,8,9।

इन विट्रो नेट गठन व्यापक रूप से रासायनिक यौगिक phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) है, जो बड़े पैमाने पर शुद्ध गठन लाती है के साथ अध्ययन किया गया है । हालांकि सबसे शारीरिक उत्तेजनाओं शुद्ध गठन10के बहुत निचले स्तर को प्रेरित । अध्ययन करने के लिए शुद्ध-में चलाता है, उदाहरण के लिए, एक स्व-प्रतिरक्षित रोग सेटिंग, एक मानकीकृत, संवेदनशील, उच्च प्रवाह मात्रात्मक परख का पता लगाने और शुद्ध गठन यों तो की जरूरत है । जाल के ठहराव के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है और वर्तमान में विभिंन तरीकों से किया जाता है, अपने स्वयं के फायदे और सीमाओं11के साथ प्रत्येक । एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विधि supernatants12में डीएनए का पता लगाने है, जो उद्देश्य है, लेकिन डीएनए के मूल के बीच भेदभाव नहीं करता है (अपोप्तोटिक, गल, जाल), और इसलिए जाल के लिए बहुत विशिष्ट नहीं है. दूसरे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) डीएनए-नेट के साथ परिसर में विशिष्ट प्रोटीन, उदाहरण के लिए, myeloperoxidase (MPO) या न्युट्रोफिल elastase (NE), एक और अधिक विशिष्ट दृष्टिकोण के लिए जाल का पता लगाने और कर रहे थे को अच्छी तरह से सहसंबंधी बनाना प्रदर्शन फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन-३ (CitH3) सकारात्मक आकाराची१३. हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि इस विधि के लिए पर्याप्त सभी जाल लेने के लिए संवेदनशील है (जैसे, MPO, NE, और CitH3 नकारात्मक जाल) । एक तीसरा दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी है कि नेट से जुड़े अणुओं के सह स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है (NE, MPO, CitH3) जाल यों तो extracellular डीएनए के साथ. यह विधि आम तौर पर जाल के लिए विशिष्ट है, लेकिन यह एक उच्च प्रवाह पद्धति के रूप में लागू नहीं किया जा सकता और पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह के कारण उद्देश्य नहीं है । इसके अतिरिक्त, इस विधि खाते में नहीं ले MPO-, NE-, CitH3-नकारात्मक जाल है कि अक्सर इस्तेमाल किया नेट-ट्रिगर14,15के आधार पर मौजूद हैं । शुद्ध-टिंग न्यूट्रोफिल16में नाभिक की सूजन का संकेत एक परिवर्तित आगे/sideward तितर बितर (FSC/एसएससी) के माध्यम से जाल का पता लगाने के cytometry दृष्टिकोण प्रवाह । इस विधि खाते में शुद्ध गठन की है कि पहचान की गई है, जो इस तरह के महत्वपूर्ण शुद्ध गठन17के रूप में नाभिक की सूजन शामिल नहीं हो सकता है के विभिंन रूपों में नहीं ले करता है । अन्त में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी कल्पना करने के लिए लागू किया गया है और सीधे एक सेल के साथ extracellular डीएनए धुंधला द्वारा शुद्ध गठन मात्रा-अभेद्य डाई कि दाग extracellular डीएनए12,18. आम तौर पर, 5 से 10 उच्च शक्ति क्षेत्र मैंयुअल रूप से उठाया और मूल्यांकन कर रहे हैं, जो एक अच्छी तरह से ९६ प्लेट11,17के प्रत्येक कुआं के 1-5% शामिल हैं । छवियों के मैनुअल चयन हमेशा उद्देश्य नहीं है, पूर्वाग्रह से ग्रस्त है और उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए आकर्षक नहीं है । एक स्वचालित, उच्च प्रवाह शुद्ध ठहराव परख हाल ही में विकसित किया गया था, जो अच्छी तरह से एक 3 डी जेड के माध्यम से 13 µm को कवर तरीके से 11% image-stacked इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी, जिससे एक अति संवेदनशील तकनीक के लिए नेतृत्व करने के लिए जाल का आकलन पारंपरिक तरीकों की तुलना में10. वर्तमान रिपोर्ट का वर्णन सबसे हाल ही में प्रोटोकॉल के माध्यम से एक स्वचालित, अति संवेदनशील 3d फोकल माइक्रोस्कोपी, जो एक अच्छी तरह से ४५% की कुल imaged क्षेत्र प्राप्त है और जेड के माध्यम से 27 µm कवर का उपयोग परख के माध्यम से शुद्ध गठन-पोट । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संवेदनशीलता, एक उद्देश्य और निष्पक्ष तरीके से शुद्ध गठन के निम्न स्तर के साथ, यों तो उपयुक्त है ।

Protocol

सभी रोगियों और स्वस्थ नियंत्रण LUMC बैंक में भाग लेने के लिए सहमति दी । LUMC एथिकल कमेटी द्वारा दोनों को बैंकिंग स्टडीज की मंजूरी दी गई ।

1. स्वस्थ न्यूट्रोफिल का अलगाव

  1. २ १० मिलीलीटर EDTA-लेपित ट्यूबों में एक स्वस्थ दाता से परिधीय रक्त के 20 मिलीलीटर प्राप्त करें ।
  2. एक बाँझ ५० मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर रक्त डाल और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) अप करने के लिए ३२.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. कोशिकाओं के तहत घनत्व ढाल(जैसे, Ficoll-amidotrizoaat) जोड़ें ।
    1. एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक और प्लास्टिक नियंत्रक के साथ घनत्व ढाल के 14 मिलीलीटर ले लो ।
    2. प्लास्टिक को ५० एमएल ट्यूब के नीचे रखें ।
    3. प्लास्टिक से प्लास्टिक नियंत्रक ले लो, घनत्व ढाल की अनुमति गुरुत्वाकर्षण द्वारा प्लास्टिक से बाहर प्रवाह करने के लिए जब तक अधिकतम केशिका प्रभाव (1-2 मिलीलीटर छोड़ दिया जाएगा) द्वारा, मोटर का उपयोग कर के बिना तक पहुंच जाता है ।
    4. प्लास्टिक के शीर्ष पर एक अंगूठे रखकर प्लास्टिक निकालें, जिससे प्लास्टिक को हटाने के दौरान बाहर लीक से घनत्व ढाल को रोकने ।
  4. ९१२ x जी और कमरे के तापमान (आरटी) में त्वरण या ब्रेक के बिना 20 मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन ।
    नोट: लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और न्यूट्रोफिल एक उच्च घनत्व है और ५० मिलीलीटर ट्यूब के तल पर हैं । परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) अलग और एक सफेद अंगूठी के रूप में घनत्व ढाल के शीर्ष पर हैं । पंजाब-पतला प्लाज्मा PBMCs के ऊपर होगा । यदि आवश्यक हो, PBMCs पंजाब के साथ अतिरिक्त धुलाई कदम के साथ एक नया ५० एमएल ट्यूब के लिए सफेद अंगूठी स्थानांतरित करके अलग किया जा सकता है ।
  5. ध्यान से सफेद PBMCs युक्त अंगूठी को हटाने के पहले, पंजाबियों के हटाने के बाद प्लाज्मा पतला और अंत में जितना संभव घनत्व ढाल परत ।
  6. न्युट्रोफिल/एरिथ्रोसाइट्स मिश्रण से न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए, शीत बाँझ आसुत जल द्वारा लाइसे एरिथ्रोसाइट्स.
    1. ठंड बाँझ आसुत पानी की बोतल और फ्रिज से एक 10x केंद्रित पंजाब कुप्पी ले लो ।
    2. इस चरण के लिए शीघ्रता से कार्य । गोली और मिश्रण एक बार ध्यान से ऊपर ठंडा बाँझ आसुत पानी की ३६ मिलीलीटर सीधे जोड़ें । 20 एस के बाद 10x पंजाबियों के 4 मिलीलीटर जोड़ें एक isotonic समाधान करने के लिए । एक बार सावधानी से मिलाएं ।
    3. ७३९ x g और 4 ° c (RBCs के हटाने के लिए) में 5 मिनट के लिए स्पिन ट्यूब । न्यूट्रोफिल सफेद गोली में होगा ।
    4. supernatant को सावधानीपूर्वक छोड़ें । चरण 1.6.2 फिर से प्रदर्शन और सुनिश्चित करें कि गोली ठीक से निलंबित कर दिया है ।
    5. ३२८ x g और 4 ° c पर 5 मिनट के लिए स्पिन ट्यूब ।
    6. ध्यान से supernatant निकालें और पंजाब के 5 मिलीलीटर में गोली resuspend । न्यूट्रोफिल की गणना करें और उंहें बर्फ पर रखें ।
      नोट: रक्त की 1 ट्यूब से अपेक्षित उपज (10 मिलीलीटर) लगभग 15-75 लाख न्यूट्रोफिल है ।

2. न्यूट्रोफिल के लाल फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग

  1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पंजाब के 2 मिलीलीटर में 10-20 लाख न्यूट्रोफिल के न्युट्रोफिल सस्पेंशन बनाओ ।
  2. 2 एमएल पंजाबियों के 2 µ एम लाल फ्लोरोसेंट सेल लिंकर के 4 µ एल के साथ एक समाधान बनाओ ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब । इस न्युट्रोफिल निलंबन के लिए धीरे जोड़ें और ध्यान से मिश्रण ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर बिल्कुल 25 मिनट के लिए अंधेरे में मशीन लाल फ्लोरोसेंट सेल linker के साथ न्यूट्रोफिल लेबल ।
  4. लेबलिंग को निष्क्रिय RPMI १६४० 10% से युक्त मध्यम, 15 मिलीलीटर तक आरटी में भ्रूण गोजातीय सीरम (FCS) निष्क्रिय और एक बार ध्यान से मिश्रण । सुनिश्चित करें कि गोली सावधानी से resuspend है अगर एक गोली का गठन किया है ।
  5. ३२८ x जी और आरटी में 5 मिनट के लिए स्पिन ट्यूब
  6. supernatant निकालें और phenol लाल मुक्त RPMI १६४० के 5 मिलीलीटर में गोली resuspend 2% FCS और आरटी पर 10% पी/न्यूट्रोफिल की गणना ।
    नोट: लाल फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग के बाद ५०% का सेल नुकसान हो सकता है ।

3. न्युट्रोफिल Extracellular ट्रैप गठन की प्रेरण

  1. phenol रेड फ्री RPMI १६४० मीडियम में 2% FCS और 10% पी/एस के एक सेल सस्पेंशन ०.४२ x 106 कोशिकाओं/
  2. एक काले ९६ में अच्छी तरह से प्रति ९० µ एल में ३७,५०० न्यूट्रोफिल जोड़ें-अच्छी तरह से, फ्लैट नीचे प्लेट ।
  3. चुना उत्तेजना के 10 µ एल जोड़ें (जैसे, रोगी के सीरा) तपसिल में एक अच्छी तरह से 10% की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । तपसिल में हमेशा नकारात्मक नियंत्रण (मीडियम) शामिल करें ।
  4. वांछित समय के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में मशीन, 30 मिनट से लेकर 2, 4 या 6 एच के लिए 4 एच की मशीनिंग का सुझाव दिया है ।
  5. 5 µ एम अभेद्य डीएनए डाई के 25 µ एल जोड़ने की जरूरत मात्रा की गणना ( सामग्री की मेजदेखें), अच्छी तरह से 1 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. यदि RPMI १६४० मध्यम से 2% FCS और एक 5 µ m एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% पी/
  6. 5 µ एम अभेद्य डीएनए डाई के 25 µ एल जोड़ें 15 मिनट की मशीन समय के अंत से पहले । अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 15 मिनट के लिए जारी रखें ।
  7. supernatant निकालें (~ १२५ µ l) बहुत ध्यान से और अगर जरूरत की दुकान । 4% paraformaldehyde (पीएफए) के १०० µ l को जोड़ें । अंधेरे में रखो, और तुरंत कदम 4 के साथ जारी है ।

4.3 डी उच्च सामग्री, उच्च संकल्प इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ शुद्ध दृश्य

  1. अधिग्रहण सेटअप पर क्लिक करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें ।
    1. कॉंफ़िगर टैब पर क्लिक करें ।
    2. उद्देश्य और कैमरे का चयन करें । एक फोकल ६० µm pinhole के अधिग्रहण मोड के साथ 10x एपीओ लैंब्डा उद्देश्य चुनें ।
    3. प्लेट पर क्लिक करें और ९६-अच्छी तरह से प्लास्टिक की थाली चुनें । साइट का चयन करने के लिए यात्रा और साइटों की एक निश्चित संख्या का चयन करें । 3 कॉलम और ओवरलैप (0 µm), जो अच्छी तरह से ४५% की कुल कवर के बिना 3 पंक्तियों में भरें ।
    4. अधिग्रहणपर क्लिक करें । लेज़र-आधारित फ़ोकस सक्षमकरें चुनें. यदि आवश्यकता हो तो Z श्रृंखला/
    5. साइट पर फ़ोकसक्लिक करें ।
      1. प्लेट तल पर ध्यान केंद्रित पर क्लिक करें । नीचे मोटाई से सेट करें। प्रारंभिक अच्छी तरह से नमूना खोजने के लिए, पहले अच्छी तरह से अधिग्रहीत चुनें । साइट का फ़ोकस के लिए, सभी साइट्स चुनें.
    6. तरंग दैर्ध्यपर क्लिक करें ।
      1. तरंग दैर्ध्य की संख्या के लिए, 2 चुनें । TL छायाप्रभाव सुधार शोधन स्तर के लिए, 2 चुनें ।
      2. तरंग दैर्ध्य 1 के लिए, का चयन करें टेक्सास लाल ।
        1. के लिए फ़ोकस विकल्प, का चयन करें लेज़र के साथ z ऑफ़सेट, पोस्ट लेज़र ऑफ़सेट १.१ µm. का उपयोग करें z-स्टैक 200-10 की कस्टम श्रेणी के साथ ।
      3. तरंग दैर्ध्य 2 के लिए, FITC चयन करें ।
        1. के लिए फ़ोकस विकल्प, का चयन करें लेज़र के साथ z ऑफ़सेट से w1 0 µm. 200-10 की कस्टम श्रेणी के साथ z-स्टैक का उपयोग करें ।
        2. अधिग्रहण विकल्पों के लिए, Z श्रृंखला और 2d प्रक्षेपण छवि अधिकतम चुनें । प्राप्ति विकल्पों के लिए, छायाप्रभाव सुधार चुनें । बंद.
    7. Z श्रृंखलाका चयन करें । चरणों की संख्या का चयन करें: 10 । चरण का चयन करें आकार: 3 मिमी (कुल सीमा 27 µm) हो जाएगा ।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी में प्लेट रखो ।
    1. चलाएं टैब पर क्लिक करें ।
      1. प्लेट नाम और विवरण भरें और भंडारण स्थान का चयन करें ।
      2. कुओं का चयन करें जिसे प्राप्त करने की आवश्यकता है ।
  3. टेक्सास रेड और FITC के लिए एक्सपोज़र समय चुनें ।
  4. अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्लेट पर क्लिक करें, जो लगभग 1 ज प्लेट प्रति ले जाएगा ।

5. शुद्ध गठन का विश्लेषण

  1. एक छवि प्रसंस्करण वैज्ञानिक बहुआयामी छवियों के विश्लेषण के लिए डिजाइन कार्यक्रम का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए शुद्ध गठन का विश्लेषण ।
  2. अधिग्रहीत छवि डेटा को एक अलग हार्ड ड्राइव पर स्थानांतरित करें ।
  3. रंग जोड़ने उपकरण का चयन करें ।
    1. w1 का चयन करें और हार्ड ड्राइव में वह फ़ोल्डर चुनें जहां डेटा संग्रहीत है ।
    2. w2 का चयन करें और हार्ड ड्राइव में वह फ़ोल्डर चुनें जहां डेटा संग्रहीत है ।
      नोट: टेक्सास लाल छवियों के लिए लाल रंग जोड़ने के लिए फ़ाइल नाम में w1 का उपयोग करता है और FITC छवियों के लिए हरे रंग को जोड़ने के लिए w2 का उपयोग करता है एक मानक मैक्रो का उपयोग करें ।
  4. विश्लेषण मैक्रो का चयन करें ।
    1. w1का चयन करें, थ्रेशोल्ड मान (तीव्रता थ्रेशोल्ड) चुनें, जो आमतौर पर 10 है. इच्छित पिक्सेल मान (आकार थ्रेशोल्ड, उदा., १००) का चयन करें.
    2. w2का चयन करें, थ्रेशोल्ड मान (तीव्रता थ्रेशोल्ड) चुनें, जो आमतौर पर 10 है. इच्छित पिक्सेल मान (आकार थ्रेशोल्ड, उदा., ५००) का चयन करें.
    3. स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए गंतव्य चुनें, विश्लेषण चलाएं, और बाद में लॉग फ़ाइलें सहेजें ।
  5. किसी स्प्रेडशीट में डेटा का विश्लेषण करें ।

Representative Results

न्युट्रोफिल extracellular ट्रैप (NET) गठन 3 µm दूरी के साथ एक अच्छी तरह से फोकल विमान में बंद शुरू के साथ 10 Z-पोट पर दाग extracellular डीएनए को बढ़ाता द्वारा एक 3 डी तरीके से quantified है । संचई क्षेत्र को मापने के द्वारा, परख की संवेदनशीलता बढ़ जाती है (आंकड़ा 1a) । अलग न्यूट्रोफिल मानक विचलन (एसडी) के १.१०% विभिन्न अलगाव से 14 अलग नमूनों में मापा के साथ ९८.७% की एक मतलब शुद्धता है । लाल रक्त कोशिकाओं का मतलब प्रतिशत १.०४% ± १.१% एसडी और monocytes का मतलब प्रतिशत ०.०८५% ± ०.१७% एसडी है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । सना हुआ न्यूट्रोफिल के कुल क्षेत्र में केवल फोकल विमान में एक अच्छी तरह से quantified हैं, जो ०.९९ (९५% विश्वास अंतराल [CI] 0.985-0.997 के एक पियरसन सहसंबंध गुणांक के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में कुल न्युट्रोफिल गिनती के साथ काफी सहसंबंधी है, p < ०.०००१) (चित्र 1b) । न्यूट्रोफिल में शुद्ध गठन के ठहराव के प्रतिनिधि परिणाम एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में AAV रोगियों या मध्यम (मेड) के 10% सीरा के साथ उत्तेजित, 10 Z पर extracellular डीएनए क्षेत्र के रूप में व्यक्त की छवि वाले न्युट्रोफिल प्रति ढेर (चित्रा 1C). उत्तेजित न्यूट्रोफिल (चित्रा 2a) के प्रतिनिधि छवियों और AAV-उत्तेजित न्यूट्रोफिल (चित्रा बी) में जाल के स्नैपशॉट दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: extracellular डीएनए और न्युट्रोफिल गणना को मापने के द्वारा शुद्ध गठन के ठहराव । (क) क्षेत्र में संचई quantified है पर 10 Z-ढेर के लिए एक अच्छी तरह से उत्तेजित न्यूट्रोफिल के लिए (मेड) और ऐंका के 10% सीरम के साथ प्रेरित न्यूट्रोफिल के लिए-एसोसिएटेड वाहिकाशोथ (AAV) रोगियों (n = 4) एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ quantified । प्रत्येक उत्तेजना तपसिल में परीक्षण किया गया था, प्रत्येक बिंदु औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) लाल फ्लोरोसेंट लेबल सेल क्षेत्र और सेल गणना एक अच्छी तरह से छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के फोकल विमान में quantified थे (आर2 = ०.९९, पी < ०.०००१) । (ग) शुद्ध गठन प्रति imaged न्युट्रोफिल (सेल क्षेत्र) के अनुसार संचई क्षेत्र के रूप में व्यक्त किया जाता है । मतलब एक तपसिल के अर्थ (SEM) मानक त्रुटि उत्तेजना के अनुसार साजिश रची है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: नेट ठहराव परख के स्नैपशॉट । फ्लोरोसेंट बला न्यूट्रोफिल लाल रंग में दिखाया गया है, और दाग extracellular डीएनए हरे रंग में दिखाया गया है । 10x योजना एपीओ लैंब्डा उद्देश्य । (क) उत्तेजित न्यूट्रोफिल. (ख) AAV सीरम के साथ उत्तेजित न्यूट्रोफिल. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस परख का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि न्यूट्रोफिल कम रहते है और मर जब जमे हुए है प्रत्येक प्रयोग के लिए हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की जरूरत है । यह एक स्वस्थ दाता हर बार है, जो कुछ दाता विशेषताओं के कारण रूपांतरों फंसाने सकता है की आवश्यकता है । इन परिवर्तनों में से एक न्यूट्रोफिल की सक्रियण स्थिति है । न्यूट्रोफिल पहले से ही vivo में अलगाव से पहले सक्रिय हो सकता है । इसके अलावा, न्यूट्रोफिल एरिथ्रोसाइट्स के lysis के दौरान विशेष रूप से अलगाव कदम भर में सक्रिय किया जा सकता है, इसलिए न्यूट्रोफिल के एक अनुभवी हेंडलर न्यूट्रोफिल के सक्रियण को कम करने के लिए आवश्यक है । सामांय में, न्यूट्रोफिल के अलगाव के रूप में जल्दी के रूप में संभव के रूप में रक्त ड्राइंग और प्रयोग अत्यधिक सहज सक्रियण से बचने के लिए नहीं रोका जाना चाहिए किया जाना चाहिए । दूसरे, न्यूट्रोफिल के किसी न किसी हैंडलिंग से बचना चाहिए । जैसे, वर्णित प्रोटोकॉल का उल्लेखनीय लाभ ंयूनतम pipetting हस्तक्षेप एक बार न्यूट्रोफिल एक ९६-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण स्थिति सबसे उत्तेजित हालत, जिसमें इस परख संवेदनशील शुद्ध गठन के निंन स्तर का पता लगाने में कर सकते है का मूल्यांकन किया है । एक और पहलू है कि परख प्रभावित कर सकता है माध्यम में FCS का उपयोग है । FCS का प्रतिशत 10% से 2% से कम किया गया है एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि19,20 या गर्मी निष्क्रियता के बावजूद न्यूट्रोफिल के संभावित सक्रियण द्वारा शुद्ध गठन के संभावित दमन से बचने के लिए । FCS के बिना संस्कृति या उपयोग के साथ मीडिया के विभिंन प्रकारों की कोशिश नहीं की गई है । एक उत्तेजित या मध्यम नियंत्रण हमेशा साथ लिया जाता है जब परख प्रदर्शन के लिए पृष्ठभूमि संकेत का एक संकेत है (जैसे, न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण की स्थिति) । उत्तेजित नमूना की तुलना में प्रत्येक उत्तेजना के लिए गुना वृद्धि एक ही उत्तेजना का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगों पर लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रदर्शित किया जाता है.

एक संभव उच्च पृष्ठभूमि के लिए एक महत्वपूर्ण कारक extracellular डीएनए है कि शुद्ध गठन की प्रक्रिया के लिए असंबंधित है के दाग है । वर्तमान परख 15 मिनट की छोटी गर्मी की अवधि के तुरंत बाद extracellular डीएनए धुंधला हटाने और निर्धारण के बाद सीधे प्लेट का विश्लेषण करके इस को कम करने का प्रयास करता है । इसलिए, यह एक उंनत फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि पर्याप्त गति और विश्लेषणात्मक शक्ति के लिए 1 के भीतर ९६-अच्छी तरह से थाली पर कब्जा करने के लिए 2 ज. जोखिम समय और ध्यान के स्वचालित सेटिंग की सिफारिश की है । जैसे, माइक्रोस्कोप सेटिंग प्रत्येक नमूने और रंग तीव्रता दहलीज जो समग्र इष्टतम चित्र गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के संबंध में प्रयोग के बीच भिन्न हो सकते हैं । उत्तरार्द्ध सही ढंग से न्यूट्रोफिल और जाल और इष्टतम सेटिंग इसलिए कई नियंत्रण नमूनों का उपयोग करके पुष्टि की जानी चाहिए करने के लिए अंतिम क्षमता को प्रभावित करता है (जैसे, स्वस्थ नियंत्रण के सीरम). कैप्चर की गई छवियों के विश्लेषण के दौरान, विश्लेषण प्रोग्राम में पिक्सेल थ्रेशोल्ड और आकार थ्रेशोल्ड का उपयोग शुद्ध गठन के बेहतर चयन के लिए अनुमति देता है.

Extracellular डीएनए शुद्ध गठन से व्युत्पंन NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis या भी गैर महत्वपूर्ण शुद्ध गठन1के lytic प्रक्रिया सहित अलग मौत मार्ग, का परिणाम हो सकता है । जैसे, वर्तमान परख की एक सीमा है कि केवल extracellular डीएनए के लिए धुंधला द्वारा कोई शुद्ध गठन और अंय प्रासंगिक सेल मौत रास्ते के बीच भेदभाव संभव है । यह विभिंन रूपों के बीच भेदभाव करने के लिए अलग मौत रास्ते के चुनिंदा अवरोधकों का उपयोग करके इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए संभव है underpinning शुद्ध गठन या citH3 और NE जैसे विशिष्ट नेट मार्करों की उपस्थिति अलग immunostainings द्वारा की पुष्टि, डीएनए के साथ सह-स्थानीयकृत । सह citH3 और NE के साथ extracellular डीएनए के स्थानीयकरण हाल ही में इस परख10के लिए पुष्टि की गई है । इस परख में शुद्ध विशिष्ट मार्कर से बचने का लाभ, शुद्ध गठन के सभी रूपों का आकलन करने के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा डीएनए के बाहर निकालना के लिए अग्रणी के रूप में पूरा और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग की क्षमता के साथ संभव के रूप में उद्देश्य की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता कम स्तर पर शुद्ध प्रेरण ऑटो में प्रतिरक्षा परिसरों-प्रतिरक्षा रोग है जिसमें गुणात्मक और मात्रात्मक मतभेदों का पता लगाने की क्षमता प्रक्रिया के प्रकार से अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है द्वारा मध्यस्थता की पढ़ाई में दिखाया गया है 10,21,22शामिल हैं । illustrating है कि इस उपंयास नेट ठहराव परख अलग शोधकर्ताओं के लिए जोड़ा मूल्य का हो सकता है शुद्ध गठन के विभिंन पहलुओं की जांच । परख करने के लिए छोटे समायोजन आसानी से लागू कर रहे हैं: उत्तेजना अवधि के समायोजन, एक पसंदीदा नेट मार्कर के उपयोग के लिए एक विशिष्ट मौत मार्ग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए शुद्ध गठन के लिए अग्रणी, एक अलग इज़ाफ़ा या विभिंन शुद्ध मानदंडों के उपयोग के उपयोग में ठहराव और विश्लेषण ।

अंत में, प्रदान की प्रोटोकॉल एक उच्च संवेदनशील अर्ध के लिए मोटे तौर पर लागू परख है, विभिंन उत्तेजनाओं पर नेट के पूर्व विवो प्रेरण के मूल्यांकन के लिए शुद्ध गठन के स्वचालित ठहराव ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Eline जे Arends और Y.K. Onno तेंग का काम डच गुर्दा फाउंडेशन (17OKG04), नीदरलैंड संगठन से नैदानिक फैलोशिप वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (९०७१३४६०) द्वारा समर्थित है । लौरा एस वान बांध का काम संधिवातीयशास्त्र में अनुसंधान के लिए फाउंडेशन (FOREUM) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua Sterile H2O B. Braun, Melsungen, Germany 12604052
Fetal bovine serum (FCS) Bodinco, Alkmaar, The Netherlands Used in high concentrations it could influcence NET formation
Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL LUMC, Leiden, The Netherlands 97902861
Immunofluorescence confocal microscope Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralization PBS (10x) Gibco, Paisley, UK 70011-036
Penicillin/streptomycin (p/s) Gibco, Paisley, UK 15070063
Phenol red free RPMI 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 11835-063 Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal
Phosphate-buffered saline (PBS) B. Braun, Melsungen, Germany 174628062
PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA PKH26GL-1KT PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan
Program for scientific multidimensional images analysis ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x) Gibco, Paisley, UK 52400-025
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye Gibco, Paisley, UK 57020
Trypan blue stain 0.4% Sigma Aldrich, Germany 17942E
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate Falcon, NY, USA 353219

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ न्युट्रोफिल extracellular जाल (वेगवेगळ्या) न्यूट्रोफिल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इम्यूनोलॉजी प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग ऐंका-संबद्ध वाहिकाशोथ प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस एक प्रकार का वृक्ष नेफ्रैटिस
एक उच्च प्रवाह परख का आकलन करने के लिए और न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन यों तो
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Arends, E. J., van Dam, L. S., Kraaij, T., Kamerling, S. W. A., Rabelink, T. J., van Kooten, C., Teng, Y. K. O. A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation. J. Vis. Exp. (143), e59150, doi:10.3791/59150 (2019).

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