Summary
이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
호 중구 extracellular 함정 (그물)는 면역성 extracellular DNA 구조를 다양 한 트리거 시 호 중구에 의해 출시 될 수 있습니다. 그물 트랩 및 미생물을 죽이고 하는 중요 한 호스트 방어 메커니즘으로 설명 되는. 다른 한편으로, 그들은 다양 한 조직의 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 그물은 관련 autoantigens 안티 neutrophil 세포질 항 체 (ANCA) 등의 풀을 포함 하는 면역성 및 독성 구조-관련 된 맥 (AAV) 및 반성 루 푸 스 (SLE). 그물의 다른 형태의 자극에 따라 유도 될 수 있다. 그물의 양은 supernatants, DNA-complexed myeloperoxidase (MPO) 또는 호 중구 elastase (네브라스카), 같은 NET-분자와 citrullinated의 존재를 측정 측정에 DNA 자료를 측정을 포함 하는 다른 기술을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 형광 현미경 검사 법, 또는 그들의 특이성, 감도, 객관성, 및 수량에 관한 서로 다른 기능을가지고 있는 모든 NET 구성 요소 흐름 cytometric 검출 히스톤. 여기는 3 차원 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 매우 민감한, 높은 처리량 방식에서 vivo 그물 형성 전 계량 하는 프로토콜이입니다. 이 프로토콜은 네트워크 형성 및 건강과 질병에서 저하에 대 한 다양 한 연구 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있습니다.
Introduction
호 중구 extracellular 함정 (그물)의 형성은 호 중구 구조, 광범위 한 항균 및 위험한 분자, 세부적인 complexed와 같은 extracellular 3 차원 (3D) 웹에 그들의 DNA를 출시 하는 과정 및 세포질 효소, 펩 티 드 그리고 단백질입니다. 이러한 면역성 및 독성 구조 트랩을 죽이 전염 성 병원 체1건강 한 개인의 타고 난 면역성이 있는 방위에서 중요 한 생리 적인 역할을 있다. 그러나, 그들은 있다 또한 입증 되었습니다 혈전 증2 고 안티 neutrophil 세포질 항 체 (ANCA)를 포함 하 여 다양 한 조직 자기 면역 질병-폐색 (AAV)3, 반성 루 푸 스 (SLE 관련 )4,5, antiphospholipid 증후군 (APS)2,6, 류 마티스 관절염 (RA), 건 선, 그리고 통풍7,,89.
그물 형성 체 외 널리는 화학 화합물 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA), 대규모 네트워크 형성을 유도 하는 공부 되었다. 그러나 가장 생리 적 자극 그물 형성10의 다량 저수준을 유도. 연구에서 예를 들어 자기 면역 질병, NET 트리거 표준화, 민감한, 높은 처리량 양적 분석 결과 감지 하 여 계량 그물 형성 필요 하다. 그물의 정량화 어려운 것을 입증 했다 고 현재 각각 그들의 자신의 이점 및 제한 사항11가지 방법으로 수행 됩니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 supernatants12, 목표만 이며, DNA (apoptotic, 괴 사 성, 그물)의 사이 차별 하지 않습니다 따라서 그물에 대 한 매우 구체적이 DNA의 탐지 이다. 둘째, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs)의 DNA complexed NET 특정 단백질, 예를 들어 myeloperoxidase (MPO) 또는 호 중구 elastase (네브라스카), 그물을 검색 하는 보다 구체적인 접근 방식을 고와 잘 상관 관계를 증명 했다 citrullinated 히스톤-3 (CitH3) 긍정적인 그물13. 그러나, 그것은이 방법은 모든 그물 (예: MPO, NE, 및 CitH3 부정적인 그물)를 데리 러 충분히 과민 인지 알 수 없습니다. 세 번째 방법은 그물 계량 extracellular DNA와 NET 관련 분자 (네브라스카, MPO, CitH3)의 공동 지역화를 감지 하는 데 사용 되는 면역 형광 검사 현미경 검사 법입니다. 이 메서드는 일반적으로 특정 그물, 하지만 그것은 높은 처리량 방법으로 적용할 수 없습니다 관찰자 편견 때문에 중요 하지 않은. 또한,이 방법은 고려 하지 않습니다 계정 MPO-, 네-, CitH3-부정적인 그물 자주 사용된 NET 트리거14,15에 따라 존재 하는. 교류 cytometry 방법을 그물-팅 neutrophils16핵의 붓기를 나타내는 변경된 앞 으로/측면 분산형 (FSC/SSC)을 통해 그물을 검색. 이 방법은 고려 하지 않습니다 계정에 확인 되었습니다, 생명 그물 형성17등 핵의 붓기를 포함 하지 수 있는 그물 형성의 다른 형태. 마지막으로, 면역 형광 검사 confocal 현미경 시각화 하 고 extracellular DNA12,18얼룩 셀 스며들 지 않는 염료와 extracellular DNA를 직접 얼룩에 의해 그물 형성 계량 적용 되었습니다. 일반적으로, 5 ~ 10 전력 필드는 수동으로 선택 및 평가, 96 잘 접시11,17의 각의 1-5%를 커버 하. 이미지의 수동 선택은 항상 객관적, 바이어스 경향이 높은 처리량 분석에 대 한 매력. 자동화, 높은 처리량 NET 정량화 분석 결과 최근에 3D 방식으로 덮고 그물을 평가 하는 매우 중요 한 기술을 선도 함으로써 Z 쌓아 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법을 통해 13 µ m 우물의 11%를 몇 군데 개발 되었다 10기존 방법 비해. 현재 보고서는 3D confocal 현미경 검사 법, 각의 45%의 전체 이미지 면적을 달성 하 고 Z 스택을 통해 27 µ m 커버를 사용 하 여 자동화 된, 매우 중요 한 분석 결과 통해 네트워크 형성을 계량 하는 가장 최근의 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 높은 감도, 낮은 수준에서 객관적이 고 공평한 방식으로 그물 형성의 계량에 적합.
Protocol
모든 환자와 건강 한 컨트롤 LUMC biobank에 참여 동의. 두 biobanking 연구 LUMC 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 건강 한 호 중구의 격리
- 2 개의 10 mL EDTA 코팅 관에 건강 한 기증자 로부터 말 초 혈액의 20 mL를 얻을.
- 살 균 50 mL 튜브에 혈액 10 mL를 넣어 고 추가 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 최대 32.5 mL.
-
추가 셀 아래 밀도 그라데이션 (예:., Ficoll-amidotrizoaat).
- 받아 밀도의 14 mL를 피펫으로 컨트롤러와 10ml 피펫으로 그라데이션
- 50 mL 튜브의 하단에 피펫으로 장소.
- 모 세관 효과 의해 최대에 도달할 때까지 중력 있는 피펫으로에서 흐름 밀도 그라데이션 수를 피펫으로 오프 피펫으로 컨트롤러를가지고 (1-2 mL 남아 있을 것입니다), 모터를 사용 하지 않고.
- 피펫으로 피펫으로의 제거 하는 동안 밖으로 누출에서 밀도 그라데이션 방지 피펫으로 위에 엄지를 삽입 하 여 제거 합니다.
- 912 x g 및 가속 또는 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 20 분 동안 튜브를 회전 합니다.
참고: 적혈구 (RBC)와 호 중구 높은 밀도 있고 50 mL 튜브의 하단에 있습니다. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 있으며 분리 밀도 그라데이션 위에 흰색 링으로. PBS 희석 플라즈마는 PBMCs에 위에 있을 것입니다. 필요한 경우 PBMCs 추가 세척 단계 PBS 가진 새로운 50 mL 튜브에 백색 반지를 전송 하 여 고립 될 수 있다. - 조심 스럽게 PBS 희석 플라즈마 및 마지막으로 가능한 만큼 밀도 그라디언트 레이어 제거 다음 PBMCs를 포함 하는 것은 첫째, 백색 반지 제거.
-
Neutrophil/적혈구 믹스에서 호 중구 분리, 차가운 멸 균 증류수로 적혈구를 lyse.
- 차가운 멸 균 증류수 물 병을 10 배 집중 냉장고에서 PBS 플라스 크.
- 이 단계에 대 한 신속 하 게 작동 합니다. 펠 릿 위에 직접 냉 멸 균 증류수의 36 개 mL를 추가 하 고 한 번 신중 하 게 섞으십시오. 20 후 10 x PBS의 4 개 mL를 추가 isotonic 솔루션 s. 한 번 신중 하 게 믹스.
- 5 분 739 x g 와 4 ° C (Rbc의 제거)에 대 한 튜브를 회전 합니다. 호 중구는 흰색 펠 릿에 있을 것입니다.
- 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 합니다. 1.6.2 단계를 다시 수행 하 고 펠 릿 제대로 중단 된 ㄴ 다는 것을 확인.
- 328 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 튜브를 회전
- 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 PBS의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend. 호 중구 계산 하 고 얼음에 그들을 유지.
참고: 혈액 (10 mL)의 1 튜브에서 예상된 수확량은 약 백만 15-75 호 중구.
2. 빨간 형광 세포 호 중구의 라벨
- 2 mL PBS의 15 mL 튜브에서에 10-20 백만 호 중구의 호 중구 정지를 확인 합니다.
- 2 µ M 빨간색 형광 셀 링커의 4 µ L 2 mL PBS의 솔루션 ( 재료의 표참조) 다른 15 mL 튜브에. 부드럽게 호 중구 정지에 이것을 추가 하 고 신중 하 게 혼합.
- 빨간 형광 셀 링커는 중 성구를 37 ° C에서 정확히 25 분 동안 어둠 속에서 품 어.
- 비활성화 라벨 10% 열 포함 된 RPMI 1640 매체 비활성화 소 태아 혈 청 (FCS)을 추가 하 여 실시간에 최대 15 mL와 혼합 한 번 신중 하 게. 펠 릿을 형성 하는 경우 펠 릿 신중 하 게 resuspended 다는 것을 확인 하십시오.
- 328 x g 및 실시간 5 분에 대 한 튜브를 회전
- 제거는 상쾌한 고 페 놀 레드 무료 RPMI 1640의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 2 %FCS 및 10% 포함 된 중간 P/S 실시간에는 호 중구 계산.
참고: 50%의 셀 손실 빨간 형광 셀 라벨 후 발생할 수 있습니다.
3입니다. 호 중구 Extracellular 함정 형성의 유도
- 셀 정지 0.42 x 106 셀/mL에 페 놀 레드 RPMI 1640 중간 포함 2 %FCS 10%를 무료 하 게 P/s.
- 검은 96-글쎄, 플랫 바닥 접시에 잘 당 90 µ L에서 37,500 neutrophils를 추가 합니다.
- 우물에서 10%의 농도 도달 하는 3 중에서 선택한 자극 (예를 들어, 환자의 세라)의 10 µ L를 추가 합니다. 항상 3 중에 부정적인 제어 (중간)를 포함 합니다.
- H. 잠복기 4 h 제안에 대 한 2, 4 또는 6에서 30 분까지 원하는 시간에 대 한 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어.
- 필요한 추가 25 µ L 5 µ M 스며들 지 않는 DNA의 염색 ( 재료의 표참조), 우물에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 볼륨을 계산 합니다. 만들기는 predilution 필요한 경우 RPMI 1640 중간 포함 2 %FCS 10 %P / S 5 µ M 농도를.
- 보육 시간의 끝 전에 5 µ M 스며들 지 않는 DNA 염색 15 분의 25 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 37 ° C에서 또 다른 15 분 동안 부 화를 계속 합니다.
- 매우 신중 하 게 상쾌한 (~ 125 µ L)를 제거 하 고 필요한 경우 저장. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 100 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 유지 하 고 즉시 4 단계를 계속.
4. NET 시각화 3D이 콘텐츠, 고해상도 면역 형광 검사 Confocal 현미경 검사 법으로
-
인수 설정을 클릭 하 여 면역 형광 검사 confocal 현미경에 설정을 구성 합니다.
- 구성 탭에서 클릭 합니다.
- 목표와 카메라를 선택 합니다. Confocal 60 µ m의 작은 구멍의 수집 모드와 10 X Apo 람다 목표를 선택 합니다.
- 접시 에 클릭을 선택 플라스틱 96 잘 접시. 방문 하 여 고정 된 수의 사이트를 선택 사이트를 선택 합니다. 커버는 잘의 45%의 총 오버랩 (0 µ m), 없이 3 행과 3 열을 입력 합니다.
- 수집을 클릭 합니다. 초점 레이저 기반 활성화선택 하십시오. 필요한 경우 인수 Z 시리즈/시계열 을 선택 합니다.
- 사이트 자동 초점을 클릭 하십시오.
- 접시 바닥에 초점 을 클릭 | 바닥 두께 의해 떨어져 설정합니다. 첫 번째 잘 선택, 샘플을 찾을 수 초기 잘 인수. 사이트 자동 초점에 대 한 모든 사이트를 선택 합니다.
- 파장을 클릭 하십시오.
- 파장의 수 2를 선택 하십시오. TL 음영 보정 상세 레벨에 대 한 2를 선택 합니다.
- 파장 1, 텍사스 레드를 선택 합니다.
- 자동 옵션을 선택 레이저 Z 오프셋에 대 한 게시 레이저 오프셋 1.1 µ m. 사용 Z-스택 사용자 지정 범위 200-10의.
- 파장 2 FITC를 선택 합니다.
- 자동 옵션에 대 한 선택 레이저 w1에서 Z 오프셋 0 µ m.를 사용 하 여 Z-스택 200-10의 사용자 지정 범위.
- 인수 옵션에 대 한 Z 시리즈 및 최대 2D 프로젝션 이미지를 선택 합니다. 인수 옵션 선택 음영 보정 | .
- Z 시리즈를 선택 합니다. 단계 수를 선택: 10. 단계 크기 선택: 3 m m (전체 범위는 27 µ m를 될 것입니다).
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면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법에는 접시를 넣어.
- 실행 탭을 클릭 하십시오.
- 플레이트 이름 및 설명을 입력 하 고 저장 위치를 선택 합니다.
- 취득 하는 우물을 선택 합니다.
- 실행 탭을 클릭 하십시오.
- 텍사스 레드와 FITC에 대 한 노출 시간을 선택 합니다.
- 취득 접시 접시 당 약 1 시간을 걸릴 것입니다 인수, 시작을 클릭 하십시오.
5입니다. 그물 형성 분석
- 그물 형성 분석을 과학적인 다차원 이미지 ( 재료의 표참조)의 분석에 대 한 설계 된 프로그램을 처리 하는 이미지를 사용 합니다.
- 획득된 한 이미지 데이터를 별도 하드 드라이브를 전송.
-
도구를 추가 하는 색상을 선택 합니다.
- W1 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다.
- W2 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다.
참고: 텍사스 레드 이미지에 붉은 색을 추가 하려면 파일 이름에 w 1를 사용 하 여 녹색 색상 이미지를 추가 FITC w2 사용 하는 표준 매크로 사용 합니다.
-
분석 매크로 선택 합니다.
- W1선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 100)을 선택 합니다.
- W2선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 500)를 선택 합니다.
- 분석, 실행 스프레드시트 파일의 대상을 선택 하 고 나중에 로그 파일을 저장.
- 스프레드시트에서 데이터를 분석 합니다.
Representative Results
호 중구 extracellular 함정 (그물) 형성 3D 방식에서 3 µ m 거리에 각 잘 초점면에서 시작 10 Z-스택을 통해 스테인드 extracellular DNA를 측정 하 여 정량 이다. 누적 영역 (그림 1A) 분석 결과 증가의 감도 측정 하 여 격리 된 호 중구는 98.7% 1.10% 다른 격리에서 14 다른 견본에서 측정의 표준 편차 (SD)의 의미 순도. 적혈구의 평균 백분율은 1.04% ± 1.1 %SD 그리고 monocytes의 평균 백분율은 0.085% ± 0.17 %SD (데이터 표시 되지 않음). 얼룩진된 neutrophils 몇 군데의 전체 면적에 각 잘 각 잘 0.99 (95% 신뢰 구간 [CI] 0.985 0.997의 피어슨 상관 계수와 총 호 중구 수를 크게 연관 있는 초점면에만 계량은 p < 0.0001) (그림 1B). 호 중구에서 그물 형성의 정량화의 대표적인 결과 자극 AAV 환자 또는 매체 (MED)의 10% 세라와 누적 스테인드 extracellular DNA 영역으로 표현 된 부정적인 컨트롤로 군데 neutrophil (그림 당 10 Z-스택 1 C). AAV 자극 호 중구 (그림 2B)에 대표 이미지 unstimulated neutrophils (그림 2A)와 그물의 스냅샷을 표시 됩니다.
그림 1: extracellular DNA와 호 중구 수를 측정 하 여 그물 형성의 정량화. 각 잘 unstimulated neutrophils (MED)와 호 중구 (AAV) 환자 ANCA 연관 된 맥의 혈 청 10%와 자극에 대 한 (A) 지역 10 Z 스택을 통해 누적 계량 (n = 4)는 이미지 처리 프로그램 계량. 각 자극 3 중에서 테스트 되었습니다, 그리고 각 지점 평균 값을 나타냅니다. (B) 붉은 형광 이라는 세포 공간과 세포 수는 이미지 처리 프로그램에 의해 각의 초점면에 계량 했다 (R2 = 0.99, p < 0.0001). (C) 그물 형성 군데 neutrophil (셀 영역) 당 누적 영역으로 표시 됩니다. 각 3 중의 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차는 자극 당 플롯 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: NET 정량화 분석 결과의 스냅샷을. 형광 이라는 neutrophils 빨간색으로 표시 되 고 얼룩진된 extracellular DNA는 녹색으로 표시 됩니다. Apo 람다 계획 목표 x 10입니다. (A) Unstimulated 호 중구입니다. (B) 호 중구 AAV 혈 청을 자극된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 분석 결과의 가장 중요 한 부분은 때문에 호 중구 단기 고정 면 죽을 각 실험에 대 한 갓 고립 된 중 성구를 사용 하는 필요. 이 건강 한 기증자를 기증자 특성 때문에 몇 가지 유사 콘텐츠를 옭 아 매기 수 때마다 필요 합니다. 이러한 변화 중 하나는 호 중구의 활성화 상태입니다. 호 중구는 이미 생체 조건 격리 전에 활성화 될 수 있습니다. 또한, 호 중구는 적혈구의 세포 중 특히 격리 단계에 걸쳐 활성화 될 수 있다, 따라서 호 중구의 경험된 처리기 호 중구의 활성화를 최소화 하는 데 필요한. 일반적으로, 호 중구의 격리 혈액 그림 후 최대한 빨리 수행 해야 하 고 실험 과도 한 자발적인 활성화를 방지 하는 일시 중지 안 한다. 둘째, 호 중구의 거친 취급은 피해 야 한다. 이와 같이, 설명된 프로토콜의 주목할 만한 장점은 호 중구 96 잘 접시에 시드는 일단 최소 pipetting 개입입니다. 중요 한 것은,은 호 중구의 활성화 상태입니다 unstimulated 상태는이 분석 결과 민감하게 그물 형성의 저급을 검색할 수 있습니다 가장 평가 된다. 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요소는 매체에서 FCS의 사용 이다. FCS의 비율 10%에서 그물 형성의 가능한 억제를 피하기 위해 2% 항 산화 활동19,20 또는 열 비활성화에도 불구 하 고 호 중구의 가능한 활성화 감소 되었습니다 했다. 문화 FCS 없이 또는 미디어의 사용 종류와 시도 하지는. Unstimulated 또는 매체 제어는 항상 촬영 따라 분석 결과 수행할 때 배경 신호 (예:, 의 활성화 상태는 호 중구)의 표시를. Unstimulated 샘플에 비해 각 자극에 대 한 배 증가 같은 자극을 사용 하 여 다양 한 실험을 통해 일관 된 결과 달성 하기 위해 표시 됩니다.
가능한 높은 백그라운드에 대 한 중요 한 요소가 그물 형성의 과정에 관련 있는 extracellular DNA의 얼룩은. 현재 분석 결과 15 분의 짧은 잠복기 후 즉시 extracellular DNA 얼룩을 제거 하 여 및 고정 후 직접 접시를 분석 하 여 이것을 줄이기 위해 시도 합니다. 따라서, 그것은 충분 한 속도 96 잘 접시를 잡으려고 분석 성능 고급 confocal 현미경을 사용 하 여 필수 1-2 헤 자동 내 노출 시간 및 초점의 설정 것이 좋습니다. 따라서, 현미경 설정을 각 샘플 사이 변화 하 고 전반적으로 최적의 화질을 위해 필요한 컬러 강도 임계값에 관하여 실험 수 있습니다. 후자의 영향 최종 기능 중 성구 및 그물 및 최적의 설정은 올바르게 계량을 따라서 여러 컨트롤 샘플 (예를 들어, 건강 한 컨트롤의 혈 청)을 사용 하 여 확인 한다. 캡처된 이미지의 분석 동안 픽셀 임계값 및 분석 프로그램에서 크기 임계값을 사용 하 여 NET 형성의 더 나은 선택을 허용합니다.
NET에서 파생 하는 extracellular DNA 고유 죽음 통로, NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis 또는 중요 한 그물 형성1의 비 용균성 과정 등의 결과 수 있습니다. 따라서, 현재의 분석 결과 한계 extracellular DNA에만 얼룩이 여는 아무 차별화 가능한 그물 형성 및 다른 관련 세포 죽음 통로 사이입니다. 그것은 그물 형성을 underpinning 다른 모양 사이 차별 또는 별도 immunostainings에 의해 citH3, 네브라스카, 등 특정 NET 마커의 존재를 확인 고유 죽음 통로의 선택적 억제제 중 하나를 사용 하 여 이것을 달성 하는 것 DNA와 지역화 공동. CitH3와 extracellular DNA와 네브라스카의 공동 지역화 최근이 분석 결과10에 대 한 확인 되었습니다. 이 분석 결과에서 NET 특정 마커를 방지의 장점은 완전 하 고 높은 처리량 검열의 잠재력을 최대한 객관적으로 호 중구에 의해 DNA의 입체로 이어지는 네트워크 형성의 모든 형태를 평가 하기 위해 수 있습니다. 이 프로토콜의 적용은 낮은 수준의 순 유도는 질적, 양적 차이 감지 하는 능력 과정의 종류 보다 더 중요 한 수 있습니다 자동-면역 질환에서 면역 단지에 의해 중재를 공부에 보였다 참여10,,2122. 보여주는이 소설 NET 정량화 분석 결과 다른 연구자 네트워크 형성의 다양 한 측면을 조사에 대 한 부가 가치의 될 수 있습니다. 작은 조정 분석 결과를 쉽게 구현: 조정 자극 기간, 그물 형성을 선도 하는 하나의 특정 죽음 통로에 초점을 좋아하는 순수한 마커를 사용 하 여, 다른 배율 사용 또는 다른 NET 기준의 사용 정량화 그리고 분석입니다.
끝으로, 제공 하는 프로토콜 비보 전 유도의 그물의 다른 자극에 따라 평가 대 한 네트워크 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감한 광범위 하 게 적용 가능한 분석 결과 이다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Eline J. Arends와 영 규 과장 켜기 없음 탱의 작품은 네덜란드 신장 재단 (17OKG04), 과학 연구 (90713460)를 위한 네덜란드 조직에서 임상 친교에 의해 지원 됩니다. 로 라 미 밴 Dam의 작품 연구 류 마티스 (FOREUM)를 위한 재단에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
| Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
| Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
| Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
| Penicillin/streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
| Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
| PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
| Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
| RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
| Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
| 96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |
References
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