Summary
Denne protokol beskriver en meget følsom og høj overførselshastighed neutrofile ekstracellulære fælde (NET) assay for semi-automatiske kvantificering af ex vivo nettet formation ved immunfluorescens tredimensionale Konfokal mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at evaluere netto dannelse og nedbrydning efter forskellige stimuli og kan bruges til at undersøge potentielle NET-målrettede behandlinger.
Abstract
Neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er immunogen ekstracellulære DNA strukturer, som kan udledes af neutrofiler ved en bred vifte af udløsere. Net har vist sig for at fungere som en vigtig vært forsvarsmekanisme, der fælder og dræber mikroorganismer. På den anden side har de været involveret i forskellige systemiske autoimmune sygdomme. NETs er immunogen og giftige strukturer, der indeholder en pulje af relevante autoantigens, herunder anti-neutrofile cytoplasmatisk antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitis (AAV) og systemisk lupus erythematosus (SLE). Forskellige former for redskaber kan være fremkaldt afhængigt af stimulus. Mængden af redskaber kan kvantificeres ved hjælp af forskellige teknikker, herunder måling af DNA udgivelse i supernatanter, måling af DNA-kompleksbundet med NET-molekyler som myeloperoxidase (MPO) eller neutrofile elastase (NE), måling af tilstedeværelsen af citrullinated histoner af Fluorescens mikroskopi eller flow cytometric påvisning af NET-komponenter, som alle har forskellige karakteristika med hensyn til deres specificitet, sensitivitet, objektivitet og mængde. Her er en protokol til at kvantificere ex vivo NET dannelse i en yderst følsom, høj overførselshastighed måde ved hjælp af tre-dimensionelle immunofluorescens Konfokal mikroskopi. Denne protokol kan anvendes for at løse forskellige forskningsspørgsmål om netto dannelse og nedbrydning i sundhed og sygdom.
Introduction
Dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er den proces, hvor neutrofiler frigive deres DNA i en ekstracellulære tredimensionale (3D) web-lignende struktur, kompleksbundet med en bred vifte af antimikrobielle og farlige molekyler, granulerede og cytoplasmatisk enzymer, peptider og proteiner. Disse immunogen og giftige strukturer har en fysiologisk rolle i medfødte immun forsvaret af raske personer ved fældefangst og dræbe smittefarlige patogener1. De har imidlertid også påvist for at være involveret i trombose2 og forskellige systemiske autoimmune sygdomme, herunder anti-neutrofile cytoplasmatisk antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitis (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antiphospholipid syndrom (APS)2,6, leddegigt (RA), psoriasis og gigt7,8,9.
In vitro netto dannelse er blevet bredt undersøgt med det kemiske stof phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), der inducerer massive netto dannelse. Men mest fysiologiske stimuli fremkalde meget lavere niveauer af netto dannelse10. Til undersøgelse NET-udløsere i, for eksempel, en autoimmun sygdom indstilling, en standardiseret, følsomme, høj overførselshastighed kvantitative analyse er nødvendig for at påvise og kvantificere netto dannelse. Kvantificering af NETs har vist sig for at være en udfordring og er i øjeblikket udføres af forskellige metoder, hver med deres egen fordele og begrænsninger11. En almindeligt anvendt metode er påvisning af DNA i supernatanter12, som er mål, men ikke diskriminerer mellem oprindelsen af DNA (apoptotiske, nekrotisk, garn), og er derfor ikke meget specifikke for net. For det andet enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) af DNA-kompleksbundet med NET-specifikke proteiner, f.eks myeloperoxidase (MPO) eller neutrofile elastase (NE), er en mere specifik tilgang til at opdage redskaber og blev vist sig for at korrelere godt med citrullinated Histon-3 (CitH3) positiv net13. Det vides dog ikke, om denne metode er følsom nok til at afhente alle redskaber (fx, MPO, NE, og CitH3 negative net). En tredje metode er immunofluorescens mikroskopi, der bruges til at påvise Co lokalisering af NET-associerede molekyler (NE, MPO, CitH3) med ekstracellulære DNA til at kvantificere net. Denne metode er generelt specifikke for net, men det kan ikke anvendes som en høj overførselshastighed metode og er ikke mål på grund af observatør bias. Desuden, tager denne metode ikke hensyn MPO-, NE-, CitH3-negative redskaber, der findes hyppigt afhængigt af den anvendte NET-trigger14,15. Flow flowcytometri tilgange opdage net gennem en ændret fremad/sidelæns scatter (FSC/SSC) med angivelse af hævelse af kernen i NET-Tinget neutrofiler16. Denne metode tager ikke hensyn til de forskellige former for NET formation, som er blevet identificeret, som ikke kan medføre hævelse af kernen, som vital netto dannelse17. Endelig er immunofluorescens Konfokal mikroskopi blevet anvendt for at visualisere og kvantificere netto dannelsen af direkte farvning ekstracellulære DNA med en celle-vandtætte farvestof, der pletter ekstracellulære DNA12,18. Generelt er 5 til 10 high-power felter manuelt plukket og vurderet, som dækker 1-5% af hver godt en 96-brønd plade11,17. Manuel udvælgelse af billeder er ikke altid objektive, tilbøjelige til bias og ikke attraktivt for høj overførselshastighed analyse. En automatiseret, høj overførselshastighed netto kvantificering assay blev for nylig udviklet, som afbildet 11% af brønden i 3D måde dækker 13 µm gennem Z-stacked immunofluorescens Konfokal mikroskopi, hvilket vil føre til en yderst følsom teknik at vurdere net sammenlignet med konventionelle metoder10. Den aktuelle rapport beskriver den seneste protokol for at kvantificere netto dannelse gennem en automatiseret, yderst følsom analyse ved hjælp af 3D Konfokal mikroskopi, som opnår en samlet afbildet areal på 45% af hver brønd og dækker 27 µm gennem Z-stakke. Denne protokol er egnet til at kvantificere, med en høj følsomhed, lave niveauer af netto dannelse i en objektiv og upartisk måde.
Protocol
Alle patienter og raske kontrolpersoner indvilliget i at deltage i LUMC biobank. Begge biobanking undersøgelser blev godkendt af LUMC etiske udvalg.
1. isolering af sunde neutrofiler
- Opnå 20 mL af perifert blod fra en sund donor i to 10 mL EDTA-beklædt rør.
- Sætte 10 mL af blod i en steril 50 mL tube og tilføje fosfatbufferet saltopløsning (PBS) op til 32,5 mL.
-
Tilføje tæthed farveforløb (e.g., Ficoll-amidotrizoaat) under cellerne.
- Tage op 14 mL af tæthed gradient med 10 mL pipette og afpipetteres controller.
- Sted afpipetteres på bunden af 50 mL tube.
- Tage afpipetteres controller off med pipette overfoeres, tillader tæthed farveforløb til at flyde ud af pipette af tyngdekraften, indtil dette maksimum nås af kapillar virkning (1-2 mL vil stå), uden brug af motor.
- Fjerne afpipetteres ved at placere en tommelfinger ovenpå med pipette overfoeres, derved forhindre tæthed farveforløb fra siver ud under fjernelse af en pipette.
- Spin rør i 20 min. på 912 x g og stuetemperatur (RT) uden acceleration eller bremse.
Bemærk: Røde blodlegemer (RBC) og neutrofile har en høj densitet og nederst i 50 mL tube. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) er adskilt og oven i tæthed farveforløb som en hvid ring. PBS-fortyndet plasma vil ligge over PBMC. Hvis det er nødvendigt, kan være isoleret PBMC ved at overføre den hvide ring til en ny 50 mL tube med ekstra vask trin med PBS. - Fjern forsigtigt den hvide ring indeholdende PBMC først, efterfulgt af fjernelse af PBS-fortyndet plasma og endelig tæthed gradient layer så meget som muligt.
-
For at isolere neutrofiler fra neutrofile/erytrocytter mix, lyse erytrocytter af kolde sterilt destilleret vand.
- Tag koldt sterilt destilleret vand flaske og en 10 x koncentreret PBS kolben fra køleskabet.
- Arbejde hurtigt for dette trin. Tilføje 36 mL koldt sterilt destilleret vand direkte på pellet og blandes én gang omhyggeligt. Der tilsættes 4 mL 10 x PBS efter 20 s til at foretage en isotonisk løsning. Bland en gang nøje.
- Dreje røret i 5 min på 739 x g og 4 ° C (for fjernelse af røde blodlegemer). Neutrofiler vil være i den hvide pellet.
- Omhyggeligt supernatanten. Udfør trin 1.6.2 igen og sørg for pellet er indstillet korrekt.
- Spin rør for 5 min på 328 x g og 4 ° C.
- Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspenderes i 5 mL PBS. Tæller neutrofile og holde dem på is.
Bemærk: Forventet udbytte fra 1 tube blod (10 mL) er cirka 15-75 millioner neutrofiler.
2. rødt fluorescerende celle mærkning af neutrofiler
- Gøre en neutrofile suspension af 10-20 millioner neutrofiler i 2 mL PBS i en 15 mL tube.
- Gøre en løsning med 2 mL PBS med 4 µL af 2 µM rødt fluorescerende celle linker (Se Tabel af materialer) i en anden 15 mL tube. Tilføj dette forsigtigt til den neutrofile suspension og blandes omhyggeligt.
- Inkuber i mørke for nøjagtigt 25 min ved 37 ° C til at mærke neutrofile med rødt fluorescerende celle linker.
- Inaktivere mærkning ved at tilføje RPMI 1640 medium indeholdende 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FCS) på RT op til 15 mL og blandes én gang nøje. Sørg for, at pellet er nøje genopslemmes hvis en pellet har dannet.
- Dreje røret i 5 min på 328 x g og RT.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 5 mL af phenol rød-fri RPMI 1640 medium, der indeholder 2% FCS og 10% P/S på RT. tælle neutrofiler.
Bemærk: En celletab på 50% kan forekomme efter rødt fluorescerende celle mærkning.
3. induktion af neutrofile ekstracellulære fælde dannelse
- Gøre en cellesuspension af 0.42 x 106 celler/mL i phenol rød gratis RPMI 1640 medium indeholdende 2% FCS og 10% P/S.
- Tilføj 37,500 neutrofiler i 90 µL pr. brønd i en sort 96 brønde, flad bundplade.
- Tilføje 10 µL af den valgte stimulus (fx sera af patienten) i tre eksemplarer til at nå frem til en koncentration på 10% i brønden. Altid medtage en negativ kontrol (medium) i tre eksemplarer.
- Inkuber i mørke ved 37 ° C i den ønskede tid, lige fra 30 min. til 2, 4 eller 6 h. inkubere for 4 h er foreslået.
- Beregning af volumen behov for at tilføje 25 µL af 5 µM uigennemtrængelige DNA farvning (Se Tabel af materialer), for at nå frem til en endelig koncentration på 1 µM i brønden. Om nødvendigt foretage en predilution i RPMI 1640 medium indeholdende 2% FCS og 10% P/S til en 5 µM koncentration.
- Tilføj 25 µL af 5 µM uigennemtrængelige DNA farvestof 15 min inden udgangen af inkubationstiden. Fortsætte inkubation i en anden 15 min ved 37 ° C i mørke.
- Fjern supernatanten (~ 125 µL) meget omhyggeligt og gemme evt. Tilsæt 100 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Holde i mørke, og straks fortsætte med trin 4.
4. netto visualisering med 3D High-indhold, høj opløsning immunofluorescens konfokalmikroskopi
-
Konfigurere indstillingerne på immunofluorescens Konfokal mikroskop ved at klikke på opsætningen erhvervelse.
- Klik på fanen Konfigurér .
- Vælg målet og kameraet. Vælge 10 X Apo Lambda målet med en erhvervelse tilstand af en Konfokal 60 µm pinhole.
- Klik på pladen og vælge den 96-brønd plastik plade. Vælg de steder at besøge og vælge et fast antal websteder. Udfyld 3 kolonner og 3 rækker uden overlapning (0 µm), som dækker i alt 45% af brønden.
- Klik på Køb. Vælg Aktiver Laser-baseret med fokus. Vælg Erhverve Z serie/Time Series , hvis nødvendigt.
- Klik på Site autofokus.
- Klik på fokus på plade bunden | Off-Set af bunden tykkelse. For den oprindelige godt at finde eksemplet, skal du vælge den første godt erhvervet. Site autofokus, vælge alle websteder.
- Klik på bølgelængder.
- For antallet bølgelængder, vælge 2. Vælg 2 for TL skygge korrektion videreudvikling plan.
- For bølgelængde 1, Vælg Texas rød.
- For autofokus indstillinger, Vælg laser med Z offset, bogføre laser offset 1,1 µm. Brug Z-stakken med et brugerdefineret datoområde 200-10.
- For bølgelængde 2, Vælg FITC.
- Autofokus indstillinger, Vælg, der laser med Z forskydning fra w1 0 µm. Brug Z-stakken med en brugerdefineret række 200-10.
- Vælg Z-serien og 2D projektion billede maksimale for indstillingerne erhvervelse. For erhvervelse indstillinger, Vælg skygge korrektion | Off.
- Vælge Z-serien. Vælg antallet trin: 10. Vælg størrelsen, trin: 3 mm (samlede vifte vil være 27 µm).
-
Sæt pladen i immunofluorescens Konfokal mikroskopi.
- Klik på fanen Kør .
- Udfyld plade navn og beskrivelse og vælge lagerplaceringen.
- Vælg de brønde, der skal erhverves.
- Klik på fanen Kør .
- Vælg eksponeringstid for Texas rød og FITC.
- Klik på Erhverve plade at starte købet, som vil tage ca. 1 h pr. plade.
5. analyse af netto dannelse
- Bruge en billedbehandling program designet til analyse af videnskabelige multidimensional billeder (Se Tabel af materialer) at analysere netto dannelse.
- Dataoverførslen erhvervede billede til en separat harddisk.
-
Vælg den farve, tilføje værktøj.
- Vælg w1 og vælge mappen på den harddisk, hvor dataene er gemt.
- Vælg w2 og vælge mappen på den harddisk, hvor dataene er gemt.
Bemærk: Brug en standard makro, der bruger w1 i filnavnet til at tilføje røde farve til Texas rød billeder og bruger w2 for at tilføje grøn farve til FITC billeder.
-
Vælg analyse makro.
- Vælg w1, vælge tærskelværdien (intensitet tærskel), som normalt er 10. Vælg den ønskede pixelværdi (størrelse grænse, fx 100).
- Vælg w2, vælge tærskelværdien (intensitet tærskel), som normalt er 10. Vælg den ønskede pixelværdi (størrelse grænse, fx 500).
- Vælg destination til regnearksfilen, køre analyse, og gemme log-filer bagefter.
- Analysere data i et regneark.
Representative Results
Neutrofile ekstracellulære fælde (NET) dannelse er kvantificeret i en 3D måde af kvantificere farves ekstracellulære DNA over 10 Z-stakke med 3 µm afstand starter ud på fokalplan i hver brønd. Ved at måle det samlede areal, følsomhed af assay stiger (figur 1A). De isolerede neutrofiler har 98,7% med standardafvigelse (SD) på 1,10% målt i 14 forskellige prøver fra forskellige isolering betyder renhed. Den gennemsnitlige procentdel af røde blodlegemer er 1,04% ± 1,1% SD og den gennemsnitlige procentdel af monocytter 0.085% ± 0,17% SD (data ikke vist). Det samlede areal af bejdset neutrofiler afbildet er kvantificeret kun i brændplanet i hver brønd, som korrelerer betydeligt med den samlede neutrofiltal i hver brønd med en Pearson korrelationskoefficient på 0,99 (95% konfidensinterval [CI] 0.985-0.997, p < 0,0001) (figur 1B). Repræsentative resultatet af kvantificering af netto dannelse i neutrofile stimuleret med 10% sera AAV patienter eller medium (MED) som negativ kontrol, udtrykt som kumulative farvede ekstracellulære DNA område over 10 Z-stakke pr. afbildet neutrofile (figur 1 C). Snapshots af repræsentative billeder af unstimulated neutrofiler (figur 2A) og redskaber i AAV-stimuleret neutrofile (figur 2B) er vist.
Figur 1: kvantificering af netto dannelsen af ekstracellulære DNA og neutrofiltal. (A) område er kumulativt kvantificeret over de 10 Z-stakke for hver godt for unstimulated neutrofile (MED) og neutrofile stimuleret med 10% serum fra dyr af ANCA-associerede vaskulitis (AAV) patienter (n = 4) kvantificeres med en billedbehandling program. Hver stimulus blev testet i tre eksemplarer, hvert punkt repræsenterer middelværdien. (B) rødt fluorescerende mærket område og celle celletal var kvantificeret i brændplanet af hver brønd ved billedbehandling program (R2 = 0,99, p < 0,0001). (C) netto dannelse er udtrykt i samlede areal pr. afbildet neutrofile (celle område). Gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM) af hver tre eksemplarer er afbildet pr. stimulus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Snapshots af netto kvantificering assay. Fluorescerende mærket neutrofile er vist med rødt, og farvede ekstracellulære DNA er vist i grøn. 10 x Plan Apo Lambda mål. (A) Unstimulated neutrofiler. (B) neutrofile stimuleret med AAV serum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den mest kritiske del af denne analyse er behovet for at bruge frisk isolerede neutrofiler til hvert eksperiment, fordi neutrofile er kortvarig og dø når frosne. Dette kræver en sund donor hver gang, som kunne belaste nogle variationer på grund af donor karakteristika. En af disse variationer er aktivisering statussen i neutrofile. Neutrofiler kan aktiveres allerede in vivo før isolation. Derudover neutrofiler kan aktiveres i hele isolation trin navnlig under lysering af erytrocytter, derfor en erfaren handler af neutrofiler er påkrævet for at minimere aktivering af neutrofile. I almindelighed, isolation af neutrofiler bør udføres hurtigst muligt efter blod tegne og forsøget bør ikke afbrydes midlertidigt for at undgå overdreven spontan aktivering. For det andet bør hårdhændet behandling af neutrofiler undgås. Som sådan, er bemærkelsesværdige fordelen ved den beskrevne protokol minimal pipettering interventionerne når neutrofiler udsås i en 96-brønd plade. Vigtigere, er aktivisering statussen i neutrofile bedst vurderet i den unstimulated tilstand, hvori dette assay kan nænsomt opdage lave niveauer af netto dannelse. En anden faktor, der kan påvirke analysen er brugen af FCS i mediet. Procentdelen af FCS er faldet fra 10% til 2% for at undgå mulige undertrykkelse af netto dannelsen af antioxidant aktivitet19,20 eller mulige aktivering af neutrofile trods varmen inaktivering. Kultur uden FCS eller bruge forskellige typer af medier har ikke blevet prøvet. En unstimulated eller mellemlang kontrol er altid taget langs når du udfører analysen til at have en indikation af baggrunden signal (f.eks., aktivisering status i neutrofile). Fold stigning for hver stimulus i forhold til den unstimulated prøve vises for at opnå ensartede resultater over forskellige eksperimenter ved hjælp af den samme stimulus.
En vigtig faktor for et muligt høj baggrund farvning af ekstracellulære DNA, der er relateret til processen med netto dannelse. Den foreliggende analyse forsøger at reducere dette ved at fjerne den ekstracellulære DNA farvning umiddelbart efter den korte inkubationstiden 15 min. og ved at analysere pladen direkte efter fiksering. Derfor er det vigtigt at anvende en avanceret Konfokal mikroskop, der har nok hastighed og analytisk magt til at fange den 96-brønd plade inden for 1 til 2 h. automatiseret indstilling af eksponeringstid og fokus kan anbefales. Som sådan, kan indstillingen mikroskop varierer mellem hver prøve og eksperimentere med hensyn til farve intensitet grænseværdi, som er nødvendige for samlet optimal billedkvalitet. De sidstnævnte påvirkninger den eventuelle evne til korrekt kvantificere neutrofile og redskaber og den optimale indstilling skal derfor bekræftes ved hjælp af flere kontrolprøver (fx serum sund kontrol). Under analysen af optagne billeder, brugen af en pixel tærskel og størrelse tærskel i programmet analyse giver mulighed for en bedre udvalg af NET dannelse.
Ekstracellulære DNA stammer fra netto dannelse kan være resultatet af forskellige død veje, herunder NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller endog ikke-lytisk proces af vitale netto dannelse1. Som sådan, er en begrænsning af den nuværende assay, at ved farvning kun for ekstracellulære DNA der er ingen differentiering mellem netto dannelse og andre relevante celle død veje. Det er muligt at opnå dette ved hjælp af enten selektiv hæmmere af særskilte død veje til at diskriminere mellem de forskellige former for netto dannelse eller bekræfte af separate immunostainings tilstedeværelsen af specifikke NET markører, såsom citH3 og NE, Co lokaliseret med DNA. Co lokaliseringen af ekstracellulære DNA med citH3 og NE er for nylig blevet bekræftet i denne analyse10. Fordelen ved at undgå netto specifikke markører i denne analyse, giver mulighed for at vurdere alle former for netto dannelse fører til ekstrudering af DNA af neutrofiler som komplet og så objektiv som muligt med potentialet i high throughput screening. Anvendeligheden af denne protokol har vist sig at studere lav niveau netto induktion medieret af immunkomplekser i auto-immun sygdom, hvor evnen til at opdage kvalitative og kvantitative forskelle kan være vigtigere end typen proces involverede10,21,22. Illustrerer, at denne roman netto kvantificering assay kan være af merværdi for forskellige forskere til at undersøge forskellige aspekter af netto dannelse. Små justeringer til analysen gennemføres let: justering af perioden stimulation, brugen af en favorit netto markør til at fokusere på én bestemt død vej fører til netto dannelse, brug af forskellige forstørrelse eller brugen af forskellige NET kriterier i kvantificering og analyse.
Afslutningsvis er protokollen i henhold en yderst følsomme bredt gældende assay for semi-automatiske kvantificering af netto dannelse evaluering af ex vivo induktion af net på forskellige stimuli.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Eline J. Arends og Y.K. Onno Teng arbejde støttes af den nederlandske nyre Foundation (17OKG04), klinisk Fellowship fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (90713460). Laura S. van Dams arbejde støttes af fonden for forskning i reumatologi (FOREUM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
| Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
| Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
| Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
| Penicillin/streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
| Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
| PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
| Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
| RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
| Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
| 96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |
References
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
- Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
- Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
- Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
- Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
- Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
- Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
- Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).
