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Immunology and Infection

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/59174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Summary

Wir beschreiben ein in vivo Immunisierungs-, translationales Hepatitis-Modell bei BALB / c-Mäusen, das verwendet werden kann, um die Pathogenese der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis einschließlich der bei dieser Krankheit beobachteten Geschlechtsunterschiede zu untersuchen. Wir werden beschreiben, wie dieses Modell reproduzierbare Analysen mit experimentellen In-vivo- und In-vitro-Techniken demonstriert.

Abstract

Die medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Geschlechtsunterschiede in der Prävalenz sind unklar, da Tiermodelle, die menschliche Krankheiten nachahmen, fehlen. Dennoch wird allgemein angenommen, dass zugrunde liegende Mechanismen mit menschlichen Leukozyten-Antigen-Haplotypen und Sexualhormonen in Verbindung gebracht werden. Im Gegensatz dazu haben wir mit einem DIH-Mausmodell herausgefunden, dass IL-4-initiierte CD4 + T-Zellen, die gegen ein Epitop von Cytochrom P450 2E1 gerichtet sind, den Zustrom von Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen in die Lebern weiblicher BALB / c-Mäuse induzieren. Mit diesem Modell haben wir auch gezeigt, dass IL-33-induzierte FoxP3+regulatorische T-Zellen Schutz gegen DIH bei weiblichen und männlichen Mäusen bieten. Dieses DIH-Modell wird durch die Immunisierung von Mäusen mit einem Epitop von CYP2E1 induziert, das kovalent mit einem Arzneimittelmetaboliten verändert wurde, der mit DIH assoziiert wurde. Dieses Epitop wird von Patienten mit DIH erkannt. Unsere Methode induziert robuste und reproduzierbare Hepatitis- und Autoantikörper, die zur Untersuchung der Pathogenese von DIH verwendet werden können. Während In-vivo-Studien bei Mäusen übermäßige Schmerzen und Leiden verursachen können, wenn sie unsachgemäß durchgeführt werden, besteht der Vorteil eines In-vivo-Modells in der Fähigkeit, die Krankheitserregung bei einer großen Anzahl von Mäusen zu bewerten. Zusätzlich können biologische Effekte der veränderten Leberproteine mit invasiven Verfahren untersucht werden. Die Ergänzung des experimentellen Designs um In-vitro-Studien ermöglicht eine schnelle Wiederholung und mechanistische Analyse auf zellulärer Ebene. So werden wir unser Modellprotokoll demonstrieren und wie es verwendet werden kann, um In-vivo- und In-vitro-Mechanismen von DIH zu untersuchen.

Introduction

Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mausmodell der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis zu beschreiben, das sich in vivo entwickelt, und zu zeigen, wie es verwendet werden kann, um die molekularen, immunologischen und genetischen Grundlagen dieser Krankheit zu untersuchen. Das langfristige Ziel unserer Studien ist es, Mechanismen aufzudecken, die für die Entstehung chronischer Leberentzündungen und -verletzungen verantwortlich sind, indem wir DIH bei anfälligen Patienten untersuchen. Lebererkrankungen und Zirrhose stellen die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren dar. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten. DIH ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis1 beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen 2,3,4. Eine Art von DIH entwickelt sich bei anfälligen Personen nach Verabreichung von halogenierten flüchtigen Anästhetika wie Isofluran, Sevofluran, Desfluran oder Halothan. Diese Anästhetika binden kovalent an Leberproteine mit reaktiven Produkten ihres Stoffwechsels und erzeugen so neuartige Autoantigene, die allergische oder Autoimmunreaktionen hervorrufenkönnen 5.

Die Untersuchung pathogener Mechanismen, die an der Entwicklung von Anästhetika und jeder Form von DIH beteiligt sind, wurde zuvor durch das Fehlen eines Tiermodells behindert, das die Induktion menschlicher Krankheiten genau nachahmt. Wir haben ein experimentelles murines Modell von DIH mit Merkmalen entwickelt, die immunvermitteltem DILI bei Patienten ähneln. Hepatitis wird durch Immunisierung mit einem von zwei Autoantigenen induziert, die kovalent durch den Trifluoracetylchlorid (TFA)-Metaboliten modifiziert wurden, der nach oxidativem Metabolismus des Anästhetikums durch das Enzym Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)5 gebildet wird. Ein Autoantigen ist die hepatische zytosolische S100-Leberfraktion, die eine Mischung aus mehreren Proteinen6 ist, und das zweite Autoantigen ist ein Epitop von CYP2E1, das von Seren bei Patienten mit immunvermitteltem Anästhesie-DILI7 erkannt wird. Durch die Verwendung von BALB/c-Mäusen, die relativ resistent gegen experimentelle Autoimmunhepatitis sind, unterscheiden wir unser Modell vom S100-induzierten Immunisierungsmodell der Autoimmunhepatitis bei C57Bl/6J-Mäusen8.

Aufgrund seiner vielfältigen klinischen Präsentationen ist das DIH bei Patienten schwer zu untersuchen. Translationale experimentelle Modelle bieten die Möglichkeit, die Pathogenese der Krankheit in vivo und in vitro zu bewerten. Derzeit gibt es keine anderen alternativen Methoden zur Induktion von DIH, die in vivo oder in vitro adaptive oder angeborene Immunantworten ohne den Einsatz von Tieren vollständig untersuchen. Da die Trifluoracetylierung von S-100 oder dem CYP2E1-Epitop kein irritierendes Immunogen zu produzieren scheint und wir DIH durch Immunisierung mit TFA-veränderten Proteinen induzieren, erhalten diese Tiere vor der Immunisierung oder anderen Verfahren keinen Ether, halogenierte Anästhetika, Barbiturat oder Alkohol, da diese Mittel die von uns untersuchten Parameter verändern können. Trotzdem haben wir unseren Mausverbrauch reduziert, indem wir Computersimulationen verwendet haben, um die Bindungspräferenzen unseres entdeckten CYP2E1-Epitops 9 zu bestätigen, und haben menschliches DIH gespiegelt, das weibliches Geschlecht impliziert, indem wir gezeigt haben, dass weibliche BALB / c-Mäuse einen schwereren DIH10 entwickeln.

Trotz vielfältiger Darstellungen von DIH bei Patienten und Herausforderungen bei der Erforschung klinischer Erkrankungen ist die posttranslationale Modifikation nativer Proteine durch reaktive Wirkstoffmetaboliten ein anerkannter Schlüsselmechanismus in der Pathogenese DIH, die auf halogenierte Anästhetika folgt11. Die Forscher akzeptieren auch, dass CYP2E1 ein wichtiges Autoantigen in diesem Prozessist 12,13. Die Rolle von Interleukin (IL)-4-upregulierten CD4+T-Zellen, die ein posttranslational modifiziertes CYP2E1 und andere Leberproteine erkennen, ist ein akzeptierter Initiator von anästhetischem DIH, indem sie Neutrophile, Eosinophile und Mastzellen in die Leber 14 lockt, und dieser Mechanismus wurde in vielen Formen von DIH 15,16 bestätigt. Induzierte FoxP3-exprimierende CD4+CD25+T-Zellen (Tregs) reduzieren den Schweregrad von DIH, und relative Mängel dieser Zellen in der Milz verschlimmern DIH 10,7. So wurden die meisten Fortschritte beim Verständnis von DIH durch die Verwendung von In-vivo-Mausmodellen ermöglicht, um die genetischen, metabolischen und immunologischen Mechanismen von DIH sowohl in vivo als auch in vitro zu bewerten.

Da wir und andere Forscher Rollen für IL-4, Neutrophile und Eosinophile bei der Initiierung von DIH mit verschiedenen Mausmodellen aufgedeckt haben, glauben wir, dass diese Beobachtung unsere Behauptung stützt, dass unabhängig vom verwendeten DIH-Modell Hepatitis und Verletzung durch IL-4 induziert werden. Die Stärke unseres Protokolls liegt in der Anwendung der In-vivo-Methodik, sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse, und der Wiederholung von Histologie, CD4+ T-Zell-Proliferationsassays und Zytokinen. Die Stärke unserer Verwendung von In-vitro-Studien besteht darin, dass sie die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren und gleichzeitig die Methodik zur Isolierung zellulärer Interaktionen bereitstellen, die DIH antreiben. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen und weiblichen Mäusen, da dies die Möglichkeit einer unbewussten Verzerrung bei der Interpretation der Ergebnisse verringert und das Übersetzungspotenzial unserer Studien stärkt, da die Inzidenz, Prävalenz und Schwere von DIH bei Frauen17 höher ist. Wir empfehlen, dass Mäuse von einem einzigen Anbieter bezogen werden; Wenn dies jedoch nicht möglich ist, besorgen Sie sich Wurfpartnerkontrollen oder Wildtyp-Mäuse vom selben Anbieter wie die genetisch veränderten Mäuse.

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Protocol

Alle Verfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -verwendung genehmigt.

1. Trifluoracetylierung hepatischer S-100-Zytosolproteine oder eines CYP2E1-Epitops

HINWEIS: Bereiten Sie zunächst das trifluoracetylierte S100 (TFA-S100) und das trifluoracetylierte CYP2E1-Epitop (TFA-JHDN5) vor. Weil syngene S100-Proteine für Impfungen benötigt werden und BALB / c-Mäuse benötigt werden, um das Immunogen zu produzieren. Das Präparat liefert eine große Menge an Immunogen; Also, erwarten Sie, diesen Teil etwa viermal im Jahr durchzuführen. Eine identische Methode wird verwendet, um den TFA-JHDN5 herzustellen. Das CYP2E1-Epitop (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, kann sequenziert oder gekauft werden.

  1. Isolierung der S100-Fraktion der Leber.
    1. Nach der Sedierung von 5 – 10 BALB/c-Mäusen mit 40-60 mg/kg Ketamin gemischt mit 4 - 6 mg/kg Xylazin bestätigen Sie die richtige Anästhesietiefe, indem Sie eine Verringerung des Muskeltonus und keine Reaktion auf schmerzhafte Reize, wie z. B. ein Zehenkneifen (Entzugsreflex), zusätzlich zum Verlust von Aufrichtreflexen und dem Verlust von Palpebralreflexen beobachten.
    2. Legen Sie mit einer mikrochirurgischen Schere den intraabdominalen Inhalt mit einem Mittellinienschnitt frei und machen Sie einen kleinen Schnitt in die untere Hohlvene, um das Blut zu entfernen.
    3. Legen Sie einen 24-Gauge-Angiokatheter in die Pfortader und durchbluten Sie die Leber 10 ml / min mit 40 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 in einem Wasserbad bei 4 ° C. Entfernen und wiegen Sie die gepoolten Lebern und schneiden Sie sie in kleine Stücke (10 – 15 mm).
      HINWEIS: Euthanasie wird durch intraperitoneale Injektion von zusätzlichem Ketamin / Xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) induziert, gefolgt von zervikaler Dislokation und Öffnung der Brusthöhle, um die Lunge zu kollabieren. Diese Methode bietet den Tieren die geringsten Schmerzen und Unannehmlichkeiten. Diese Methode steht im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie der American Veterinary Medical Association.
    4. Fügen Sie das 4-fache Gewicht von Saccharose (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) Homogenisierungspuffer (pH 7,4) hinzu, ergänzt mit Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In einem 15-ml-Polypropylenröhrchen mit einem allgemeinen Laborgewebehomogenisator auf mittlerer Geschwindigkeit auf Eis homogenisieren, bis es glatt ist. Auf Eis homogenisieren, um zu verhindern, dass sich das Gewebe während der Homogenisierung erwärmt.
    5. Die Leber homogenisiert 10 min lang bei 1500 x g und gießt dann den Überstand ab. Zentrifugieren Sie den Überstand für 1 h bei 100.000 x g. Snap den Überstand einfrieren und bei -80 °C lagern. Der Überstand ist zytosolische S-100.
  2. Trifluoracetylierung von S100 und JHDN5
    HINWEIS: Die Trifluoracetylierung der ε-Aminogruppen von Lysinresten von S-100 wird nach dem Verfahren von Satoh18 durchgeführt. Alle Teile dieses Experiments mit Ausnahme der letzten Tage der Dialyse werden im Abzug durchgeführt.
    1. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des zytosolischen S-100 mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay)7. Verdünnen Sie 20 mg BALB/c Maus S100 oder JHDN5 auf 10 ml mit dH2O in einem 50 ml Erlenmeyerkolben. Stellen Sie den pH-Wert mit 1N KOH auf 10 ein.
    2. 4,7 mmol S-Ethyltrifluorothioacetat (S-ETFA) in die Lösung geben. Halten Sie den pH-Wert zwischen 9,9 und 10,0 mit 1N KOH aufrecht, indem Sie KOH in Tröpfchenform für ca. 1 h verabreichen. Zeichnen Sie das Gesamtvolumen von KOH für jede Reaktion auf.
    3. Überführen Sie die Lösungen in separate Dialysekassetten (Nicht überfüllen). Dialysieren Sie die Kassetten für72h gegen 4 L dH 2 O mit drei Wechseln pro Tag. Nach der Dialyse das endgültige Volumen von TFA-S100 oder TFA-JHDN5 aufzeichnen und dann Aliquot in beschriftete Röhrchen geben. Einfrieren und bei –80 °C lagern.
    4. Eine geschätzte Konzentration wird bestimmt, indem die Anfangsmenge an S100 oder JHDN5 (in mg) durch das Endvolumen nach der Dialyse (ml) dividiert wird. Um die prozentuale Modifikation des nativen Proteins19 zu bestimmen, verdünnen Sie 1,0 mg jedes nativen und TFA-veränderten Proteins (wenn die Endkonzentration größer als 1,0 mg ist) auf 1,0 mlmit dH 2 O in separaten Bullet-Röhrchen und bereiten Sie einen Rohling mit 1,0 ml dH2O vor. Wenn die Konzentration des TFA-veränderten Proteins weniger als 1,0 mg beträgt, nicht verdünnen
      1. Um Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu trennen, fügen Sie 50 μL der leeren, nativen und veränderten Proteine hinzu. 50 μL 4%NaHCO 3 gefolgt von 50 μL 0,1% 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure in jede Vertiefung geben.
      2. Inkubieren Sie die Platte bei 40 °C für 2 h. Nach der Inkubation 50 μL 10 % SDS zu jeder Vertiefung hinzufügen, gefolgt von 25 μL 1N HCl.
      3. Lesen Sie bei einer OD von 334 nm und zeichnen Sie dann die Absorption jeder Verbindung von 200 – 600 nm auf, um den charakteristischen Rückgang der Absorption bei 334 nm zu bestätigen. Berechnen Sie die prozentuale Modifikation von Lysinresten durch TFA mit der folgenden Formel:
        Equation 1

2. Immunisierung von Mäusen zur Induktion von Hepatitis

HINWEIS: DIH wird in BALB/c-Mäusen durch Immunisierungen mit Leberzytosolproteinen modelliert, die kovalent durch Trifluoracetylchlorid (TFA), einen Modell-Arzneimittelmetaboliten, TFA-S100 6 oder ein Epitop von CYP2E1, kovalent verändert durch TFA9, TFA-JHDN5, das Hepatitis, autoreaktive T-Zellen und CYP2E1-Autoantikörper induziert, verändert wurden. Mäuse zeigen 2 Wochen nach der Erstimmunisierung eine Milzaktivierungsphase und 3 Wochen lang eine Leberphase, die durch eine granulozytäre Entzündung gekennzeichnet ist. Weibliche BALB / c-Mäuse sind in diesem Modell anfälliger für Hepatitis als Männer.

  1. Immunisieren Sie am Tag 0 6–8 Wochen alte BALB/c-Mäuse subkutan an der Halsbasis mit 200 μg TFA-S100 oder 100 μg TFA-JHDN5, die in gleichen Mengen vollständigem Freund's Adjuvans (CFA) emulgiert werden. Immunisieren Sie am Tag 0 die Mäuse mit 50 ng Pertussistoxin intramuskulär in einem der Hinterbeine. Immunisieren Sie die Mäuse am Tag 7 subkutan an der Basis des Schwanzes mit entweder 200 μg TFA-S100 oder 100 μg TFA-JHDN5, die in gleichen Mengen CFA emulgiert werden, um sicherzustellen, dass jede Maus zwei Injektionen desselben Immunogens erhält.
    HINWEIS: Die Mäuse werden in den ersten 6 Stunden nach der Immunisierung stündlich und dann mindestens zweimal täglich für eine Woche überwacht. Wenn die Mäuse Anzeichen von Schmerzen oder Stress zeigen, wie z. B. eine gebeugte Haltung oder ein gerüschtes Fell, sollten Analgetika in Übereinstimmung mit dem örtlichen ACUC verabreicht werden. Wenn erhebliche Schmerzen oder Leiden festgestellt werden, sollten die Mäuse von einem Tierarzt untersucht werden, um festzustellen, ob Euthanasie notwendig ist.
  2. Bestimmung von CD4+ T-Zell-Immunantworten auf ganze Selbstproteine, Epitope von Selbstproteinen oder das TFA-Hapten mittels Durchflusszytometrie
    1. Nach der Sedierung von Mäusen mit 40-60 mg/kg Ketamin gemischt mit 4-6 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion ist die richtige Anästhesietiefe, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben, zu bestätigen und dann die Milz zu identifizieren, nachdem die intraabdominale Höhle mit einer mikrochirurgischen Schere freigelegt wurde. Die Milz am Stiel abschneiden und in eine Petrischale mit PBS/2% fetalem Kälberserum (FCS) geben.
      HINWEIS: Euthanasie wird bei den Mäusen durch intraperitoneale Injektion von zusätzlichem Ketamin / Xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) induziert, gefolgt von zervikaler Dislokation und Öffnung der Brusthöhle, um die Lunge zu kollabieren. Diese Methode bietet den Tieren die geringsten Schmerzen und Unannehmlichkeiten. Diese Methode steht im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie der American Veterinary Medical Association.
    2. Lassen Sie die Zellen mit Milchglasobjektträgern los und übertragen Sie sie auf ein konisches 50-ml-Polypropylenrohr. Waschen Sie mit PBS/2% FCS, indem Sie das Volumen auf 50 ml erhöhen und mit einer gekühlten Tischzentrifuge auf 335 x g zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie diesen Schritt.
    3. Entfernen Sie rote Blutkörperchen mit 1 ml ACK Lysing Puffer für 1 min und bringen Sie das Volumen auf bis zu 50 ml mit PBS / 2% FCS. Bei 335 x g zentrifugieren und den Überstand abgießen.
    4. Zählen Sie die Zellen. Beschriften Sie die Zellen mit CFSE für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Suspensionen einzelner Zellen in 6 Vertiefungsplatten von 3x106 Zellen / ml pro Vertiefung in PBS / 2% FCS.
    5. Stimulieren Sie markierte Zellen entweder mit CYP2E1, JHDN5 oder TFA-OVA (10 μg/ml) für 72 h bei 37 °C in 5% CO2, 95% Luft (befeuchtet). Nach der Inkubation die Zellen mit CD4-APC (1:100) für 30 min auf Eis färben und innerhalb von 3 Tagen mittels Durchflusszytometrie analysieren.
    6. Verwenden Sie die folgende Gating-Strategie, um CD4 + CFSE + -Zellen zu identifizieren: CD4 + CFSE + -Zellen werden aus den gated lebenden Zellen identifiziert und als Histogramme von proliferierenden Zellen angezeigt.
  3. Isolierung von infiltrierenden Immunzellen aus immunisierten Mäusen.
    1. Um infiltrierende Immunzellen in der Leber am Tag 14 oder Tag 21 zu isolieren, betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit 40-60 mg/kg Ketamin gemischt mit 4-6 mg/kg Xylazin und bestätigen Sie die richtige Tiefe der Anästhesie, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Nach der Laparotomie mit einem Mittellinienschnitt, der mit einer mikrochirurgischen Schere wie in 1.1.2 beschrieben gemacht wurde, kann die Pfortader mit einer 25-Gauge-Nadel kanülieren und dann die untere Hohlvene unterhalb der Nierenvenen schneiden.
    2. Perfundieren Sie jede Leber mit einer Durchflussrate von 10 ml / min mit 40 ml PBS in einem Wasserbad 37 ° C. Nach der Perfusion schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die Leber am Leberstiel ab, entfernen Sie die Gallenblase und schneiden Sie dann die Leber am Hilum.
    3. Stören Sie die Leber auf einem Mesh-Edelstahlsieb mit einem 20 ml sterilen Spritzenstößel und kaltem PBS. Filtern Sie die resultierende Zellsuspension in 50 ml vorsterilisierte Zentrifugenröhrchen mit einem 300-Mesh-Sieb. Bringen Sie jede Suspension mit kaltem PBS auf 50 ml und waschen Sie die Suspension dann durch Zentrifugation für 10 min bei 370 x g.
    4. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie dann jedes Pellet durch Behandlung in neue 50-ml-Röhrchen zusammen (Ein Röhrchen pro Maus wird empfohlen; wenn jedoch Proben gepoolt werden, werden 2-4 Pellets / Röhrchen empfohlen). Suspendieren Sie die gepoolten Pellets in 45 ml Percoll 35% (in PBS) und 100 IE / ml Heparin.
    5. Drehen Sie jedes Rohr bei 500 x g für 10 min bei 20 °C. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 5 ml PBS und fügen Sie dann 1 ml ACK-Lysing-Puffer für 10 Minuten auf Eis zu jedem Pellet hinzu.
    6. Bringen Sie jedes Röhrchen mit PBS auf 50 ml und waschen Sie es durch Zentrifugation für 10 min bei 370 x g. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie dann die Zellen mit PBS/2% FCS durch Zentrifugation für 10 min bei 370 x g. Zählen Sie die Zellen.
    7. Analyse des Zelltyps mittels Durchflusszytometrie
      HINWEIS: Hier ist ein Beispiel dafür, wie induzierte Foxp3+Tregs nachgewiesen werden können.
      1. Inkubieren Sie 1x106 Zellen mit FcR-blockierendem Reagenz und färben Sie sie mit 1:100 Verdünnungen von CD4-FITC, CD25-PE und CD45-PerCP für 30 min auf Eis. Als nächstes färben Sie die Zellen intrazellulär mit FoxP3-APC.
      2. Fixieren Sie die Zellen mit 250 μL Fixationspuffer (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie innerhalb von 3 Tagen durch Durchflusszytometrie analysiert werden.
      3. Die folgende Gating-Strategie wird empfohlen, um induzierte Foxp3+Tregs in Einzelzellsuspensionen aus Leber, Milz oder Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie nachzuweisen: Identifizieren Sie lebende Zellen mit dem Lebend/Toten fixierbaren Aqua Dead Cell Färbungskit. Als nächstes Gate auf Leberzellen, die CD45 + (PerCP, Klon RA3-6B2) sind, und Gate CD4 + -Zellen (FITC, cloneGK1.5) aus dem CD45 + -Gate. Identifizieren Sie aus den CD4 + -Zellen die Prozentsätze der CD25 + (PE, Klon 7D4) und FoxP3 + (APC, Klon 3G3) -Zellen.
  4. Histologische Analyse von Lebergewebe auf Hepatitis
    1. Fixieren Sie am 21. Tag die Leberabschnitte (5 μm dick) in 10% neutralem gepuffertem Formalin und färben Sie sie mit Hämatoxylin & Eosin.
    2. Bestimmen Sie die Histologie-Ergebnisse zuerst bei geringer Leistung (40X) in durchschnittlich 2 Ansichten und bestätigen Sie bei 64X. Bewerten Sie die Gewebeabschnitte wie folgt: Grad 0 = keine Entzündung oder Nekrose; Grad 1 = geringfügige lobuläre Entzündung ohne Nekrose; Grad 2 = lobuläre Entzündung, die <50% des Abschnitts betrifft; Grad 3 = lobuläre Entzündung, die ≥ 50% des Abschnitts betrifft; und Grad 4 = Entzündung mit Nekrose.
  5. Bestimmung des Gewebezytokinspiegels in Milz und Leber.
    1. An Tag 14 oder Tag 21 homogenisieren Sie die Leber- oder Milzproben (1 g) jeder Maus in 1 ml RPMI/2% FCS, bis sie mit einem allgemeinen Laborhomogenisator auf mittlerer Stufe glatt sind. Halten Sie die Probe kalt auf Eis.
    2. Zentrifugieren Sie das Homogenat für 15 min bei 1455 x g bei 4 °C mit einer gekühlten Tischzentrifuge. Den Überstand einfrieren und bei -80 °C lagern, bis er einsatzbereit ist. Zytokin- und Chemokinspiegel können mit kommerziellen ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Kits gemessen werden. Standardisieren Sie die Zytokinwerte, indem Sie die Spiegel (in ml oder μL) in pg / g des Gewebes umwandeln.
  6. Nachweis von Serumantikörpern gegen CYP2E1, das CYP2E1-Epitop JHDN5 und den TFA-Wirkstoffmetaboliten.
    1. An den Tagen 14 oder 21 die Mäuse mit 40-60 mg/kg Ketamin gemischt mit 4-6 mg/kg Xylazin beruhigen. Bestätigen Sie die richtige Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Verringerung des Muskeltonus und keine Reaktion auf schmerzhafte Reize, wie z. B. eine Zehenkneifung (Entzugsreflex), zusätzlich zum Verlust von Aufrichtreflexen und dem Verlust von Palpebralreflexen beobachten. Verwenden Sie eine 25-G-Nadel, die an einer Tuberkulinspritze befestigt ist, und nähern Sie sich dem Herzen, indem Sie die Nadel langsam in die Brusthöhle unter den Rippen und unmittelbar seitlich zum Xiphoid-Prozess bewegen. Sammeln Sie Blut mit intrakardialer Punktion.
    2. Sobald Blut gesammelt ist, lassen Sie es bei Raumtemperatur gerinnen. Die Blutproben werden bei 295 x g für 20 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Sera vorsichtig entfernen, die Sera aliquotieren und bei -20 °C einfrieren.
    3. 100 μL CYP2E1-, JHDN5- oder TFA-Ovalbumin (OVA)-Testantigene (5 μg/ml in PBS) über Nacht für mindestens 18 h bei 4 °C auf 96 Well-Platten auftragen. Am nächsten Tag waschen Sie die Platten mit Waschpuffer (PBS / 2% FCS), 2 Zyklen (jeweils 4 Wäschen).
    4. 100 μL Mausseren (1:100) in PBS/2% FCS dreifach auf die Platten auftragen und bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren. Nach 2 h waschen Sie die Platten mit Waschpuffer, wie in Schritt 2.6.2 beschrieben.
    5. Fügen Sie 100 μL alkalische Phosphatase (AKP)-Ziegen-Anti-Maus-IgG, AKP-Ratten-Anti-Maus-IgG1 oder AKP-Ratten-Anti-Maus-IgG2a-Sekundärantikörper (1:1000) für 2 h hinzu, gefolgt von einem Waschschritt von 1 Zyklus mit Waschpuffer und 1 Zyklus mit PBS. Detektieren Sie die Antikörper mit einem AKP-Substrat-Kit und messen Sie bei OD 405 nm alle 15 min mit einem Spektralphotometer. TFA entwickelt sich normalerweise vollständig in 15 Minuten, während sich CYP2E1 und das CYP2E1-Epitop von 30 bis 60 Minuten7 entwickeln können.
  7. Studien zur Entwicklung von JHDN5 IgG-induziertem oxidativem Stress in vitro.
    1. Inkubieren Sie mit 12 Wellplatten 10bis 6 terminaldifferenzierte Leberzellen pro Well auf mit Fibronektin überzogenen Deckgläsern in 1000 μL Williams E-Medien, ergänzt mit Glutamin und allgemeinem Supplement (siehe Materialtabelle) bei 37 °C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit für 7 Tage, wie empfohlen, um die CYP2E1-Aktivität zu maximieren.
    2. Fügen Sie JHDN5 IgG (1:40) oder Maus-IgG (1:1000) hinzu, um Brunnen zu trennen und für 2 h bei 37 °C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit zu inkubieren. Hybridoma sera war sehr verdünnt. Fügen Sie einen tiefroten fluoreszierenden Antikörperdetektor (siehe Materialtabelle) für weitere 30 Minuten zu allen Bohrlöchern hinzu.
    3. Waschen Sie die Brunnen 3x mit 1 ml PBS im Dunkeln. Fixieren Sie die Zellen in 3,7% Formaldehyd für 10 min. Untersuchung durch konfokale Mikroskopie innerhalb von 24 h.
  8. Kolokalisierungsstudien von JHDN5 IgG mit intrazellulären Organellen wie Mitochondrien in vitro.
    1. Um die Co-Lokalisation von JHDN5-IgG mit Mitochondrien nachzuweisen, differenzierte die Leberzellen in spärlicher Kultur (~ 30% Konfluenz) auf Fibronektin-bedeckten Deckgläsern für 7 Tage in farbstofffreiem Williams's media E, ergänzt wie in Schritt 2.7 beschrieben.
    2. Nach der Bestimmung der korrekten Absorptionswellenlängen fügen Sie grün fluoreszierendes, 488 nm -konjugiertes Maus-IgG oder JHDN-5 (1:100) und rot fluoreszierendes, 594-konjugiertes Mito-Tracker Rot (1:100) für 2 h (37 °C), 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit hinzu.
    3. Montieren Sie markierte, mit Fibronectin überzogene Deckscheine mit Anti-Fade-Reagenz mit DAPI und untersuchen Sie sie durch konfokale Mikroskopie.

3. Allgemeine Protokollnotizen

  1. Verwenden Sie nicht-pharmazeutische Werkzeuge, wenn Verbindungen nicht in einer Formulierung für den klinischen Gebrauch verfügbar sind. Beziehen Sie jedoch jedes dieser Werkzeuge von zuverlässigen kommerziellen Lieferanten, die in dieser Methode identifiziert wurden. Verwenden Sie immer Chemikalien, die den vom Committee on Analytical Reagents der American Chemical Society definierten Spezifikationen mindestens dem Reagenziengehalt entsprechen. Verwenden Sie für unsere Methoden nach Möglichkeit Reagenzien auf analytischem Niveau.
  2. Befolgen Sie eine strenge aseptische Technik für die Formulierung der TFA-veränderten Proteine, um eine Kontamination zu vermeiden, die sich nachteilig auf das Tierwohl oder die Interpretation der Daten auswirken könnte.
  3. Lagern und verwenden Sie nicht-pharmazeutische Formulierungen in Dauer, für die die Formulierung gemäß den verfügbaren technischen Informationen wirksam bleibt. Lagern Sie CFA bei Raumtemperatur, CYP2E1 und seine Epitope bei -20 oder -80 °C. TFA-veränderte Proteine bei -80 °C lagern und vor der Emulgierung mit CFA auf 4 °C kommen lassen. Speichern Sie TFA-veränderte Proteine bei -80 °C und speichern Sie sie in Aliquoten, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu verhindern.

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Representative Results

Der in Abbildung 1 gezeigte Impfplan, der zur Induktion von DIH verwendet wird, stellt die beiden Impfungen dar, die an der Basis des Halses (Tag 0) und an der Basis des Schwanzes (Tag 7) erforderlich sind. Abbildung 2 zeigt repräsentative Proliferationsdaten, die am Tag 14 unter Verwendung von CFSE als Reaktion auf CYP2E1, JHDN5, das CYP2E1-Epitop und den Trifluoracetyl (TFA)-Metaboliten der Anästhetika erhalten wurden. Abbildung 3 zeigt die Gating-Strategie und die repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von induzierten CD4+CD25+FoxP3+ Tregs, die an Tag 14 erhalten wurden. Abbildung 4 zeigt repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Objektträger, die die Entwicklung der Hepatitis am Tag 21 bis 6 zeigen. Abbildung 5 zeigt repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Objektträger, die eine schwerere Hepatitis bei weiblichen BALB/c-Mäusen im Vergleich zu Männern an Tag 21 zeigen, zusätzlich zum vergleichenden Zellgehalt in diesen Lebern10. Abbildung 6 zeigt repräsentative konfokale Mikroskopie-Objektträger, die das Fehlen einer Kolokalisation von Maus-IgG mit Mitochondrien zeigen. Abbildung 7 zeigt eine repräsentative konfokale Mikroskopie, die eine Kolokalisation von JHDN5-IgG mit Mitochondrien zeigt.

Figure 1
Abbildung 1: Immunisierung von Mäusen zur Induktion von Hepatitis. DIH kann bei weiblichen BALB/c-Mäusen (als Beispiel) durch Immunisierung mit TFA-JHDN5 (100 μg) induziert werden, das subkutan (s.c.) an der Halsbasis subkutan (s.c.) im gesamten Freund-Adjuvans (CFA) subkutan (s.c.) und 50 ng Pertussistoxin intramuskulär (i.m.) im Hinterbein am 0. Tag emulgiert wird (Schritt 1). Am Tag 7 können BALB/c-Mäuse dann mit TFA-JHDN5 (100μg) immunisiert werden, das in CFA (s.c.) am Bae des Schwanzes emulgiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bestimmung von CD4+ T-Zell-Immunantworten auf ganze Selbstproteine, Epitope von Selbstproteinen oder das TFA-Hasten mittels Durchflusszytometrie. Einzelzellsuspensionen von Splenozyten von 6 – 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen isoliert Tag 14 nach der Erstimmunisierung, markiert mit CFSE, stimuliert mit TFA-OVA, CYP2E1 oder JHDN5 (10 μg/ml) für 72 h bei 37 °C in 5% CO2, 95% Luft (befeuchtet), mit CD4-APC angefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Als Kontrollen wurden Brunnen ohne Antigen (Medien) verwendet. BALB/c-Mäuse entwickelten eine Proliferation als Reaktion auf OVA-TFA und CYP2E1 und nicht JHDN5 im Vergleich zu Medien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Gating-Strategie zur Identifizierung von CD4+CD25+FoxP3+-induzierten Tregs nach der in 2.3.7 beschriebenen Methode. Das erste Tor identifiziert lebende Zellen. Um Immunzellen nachzuweisen, wurden zunächst CD45+-Zellen gegated. Als nächstes wurden CD4 + T-Zellen identifiziert und gated, gefolgt von der Identifizierung von CD25 + FoxP3 + -Zellen innerhalb der CD4 + T-Zellpopulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Histologische Analyse von Lebergewebe auf Hepatitis. CFA-immunisierte Mäuse (obere Blende) wurden als Fahrzeugsteuerung verwendet. S100-immunisierte Mäuse (mittleres Panel) wurden nach Impfungen nach dem gleichen Zeitplan bewertet. Am 21. Tag wurden Mäuse eingeschläfert und die Leber in Formalin fixiert. Abschnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt. Eine minimale Leberentzündung (blaue Zellen) wird nach CFA (oben) und S100 (Mitte) Immunisierungen und großen Mengen an Entzündungen nach Impfungen mit TFA-S100 nachgewiesen. (H&E, Vergrößerung 64X). Diese Abbildung wird mit der Berechtigung6 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Weibliche BALB/c-Mäuse entwickeln im Vergleich zu männlichen BALB/c-Mäusen mehr DIH. (A) Weibliche Mäuse (n = 8) hatten 3 Wochen nach TFA-S100/CFA-Impfungen eine signifikant schwerere Hepatitis als Männer (n = 7/Gruppe). (B) Repräsentative Leberschnitte von weiblichen und männlichen Mäusen (H & E, Vergrößerung 64X). (C) Die Anzahl der hepatischen CD4+-, CD8+-, NK+- und NKT+-Zellen war bei Frauen signifikant höher als bei Männern. Mittelwert ± SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Diese Zahl wird mit der Berechtigung10 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Maus-IgG kolokalisiert nicht mit Mitochondrien. Konfokales Bild von terminaldifferenzierten Leberzellen, die mit grün fluoreszierenden (488nm) markierten Maus-IgG (1:100) (grün) zusätzlich zu rot fluoreszierenden (594) -markierten Mitotracker-Rot (1:100) gefärbt sind. Grün fluoreszierendes (488nm) markiertes Maus-IgG lokalisiert nicht mit Mitotracker Red (63-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: JHDN5-IgG kolokalisiert mit Mitochondrien. Konfokales Bild von terminaldifferenzierten hepatischen Vorläuferzellen, die mit grüner Fluoreszenz (488) gefärbt sind - markiert mit JHDN-5 IgG (1:100) zusätzlich zu rot fluoreszierend (594) - markiert mit Mitotracker Red (1:100). Grün fluoreszierendes (488nm) – markiertes JHDN-5 IgG kolokalisiert mit Mito-Tracker Red, was durch den gelben Farbton auf dem repräsentativen Bild (63-fache Vergrößerung) demonstriert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Reproduzierbarkeit; Daher ist es wichtig, sich an die vorgeschlagenen Schritte zu halten. Die Formulierung des Immunogens kann für einige eine Barriere sein; Wir haben unser Modell jedoch mit dem in unserem Dokument beschriebenen Epitop reproduziert, wodurch die Notwendigkeit, die S100-Fraktion der Leber zu isolieren, entfällt. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Epitope oder Proteine nach Impfungen verändert werden können und Hepatitis induzieren; Wir beschreiben jedoch die Proteine, die wir verwendet haben, mit zuverlässigen Ergebnissen. Es wurde gezeigt, dass mehrere Proteine bei halogenierter Anästhesieexposition trifluoracetyliert wurden. Höchstwahrscheinlich aufgrund der Epitopausbreitung sind einige dieser Proteine auch Ziel von Autoantikörpern in ihrem nativen, nicht trifluoracetylierten Zustand. Beispielsweise trägt die E2-Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDH-E2) Epitope (die Liponsäure-Prothesengruppe) mit struktureller Ähnlichkeit zur TFA-Einheit in TFA-Addukten. Antikörper, die bei Patienten mit Halothan-Hepatitis erzeugt wurden, haben gezeigt, dass sie kreuzreaktiv auf TFA-Proteine und PDH-E2 20,21 reagieren.

Unser DIH-Modell erfordert zwei Impfungen, die in CFA entlang des Rückens der Mäuse emulgiert werden. Wir wissen, dass Fußpolsterinjektionen mit CFA mit Schmerzen und Stress in der Maus in Verbindung gebracht wurden. Daher umfasste die Entwicklung des experimentellen DIH-Modells mehrere experimentelle Studien. Als wir das Modell mit einer Immunisierung mit CFA, mit der zweiten Immunisierung mit unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA) oder IFA in beiden Injektionen mit unserem Immunogen evaluierten, entwickelte sich keine Leberentzündung. In scharfem Kontrast dazu, als wir die Mäuse mit dem Immunogen mit zwei Impfungen mit CFA immunisierten, war eine signifikante Leberentzündung vorhanden. Die ursprüngliche Beschreibung eines anderen Modells der Autoimmunhepatitis umfasste ähnliche Studien wie unsere und erforderte zwei Impfungen mit CFA, um eine signifikante Leberentzündung nachzuweisen8. Trotzdem bewerten wir Adjuvantien mithilfe von Literaturrecherchen ständig neu, um zu versuchen, Entzündungen ohne CFA zu optimieren. Als Beispiel gibt es einen bekannten adjuvanten Titer Max, der B-Zell-Antworten verstärken würde; Obwohl Antikörper ein Bestandteil von DIH sind, haben wir und andere in unserem Modell14 eine entscheidende Rolle für T-Zell-Antworten gezeigt.

Die Entwicklung zuverlässiger Modelle erleichtert die Untersuchung der Pathogenese des DIH. Wir zeigen, dass Leberhistologie und Immunzellen in verschiedenen Stadien dieses Modells zuverlässig ausgewertet werden können. Wir zeigen die Identifizierung von antigenspezifischen T-Zellen, Serumantikörpern und Gewebezytokinen, die zur Untersuchung der Entwicklung von DIH verwendet werden können. Wir demonstrieren die Methoden zur Isolierung von Zellen aus der entzündeten Leber und schlagen die Verwendung von Heparin vor. Wir haben diese Technik jedoch ohne Heparin durchgeführt und die Ergebnisse waren nicht zu unterscheiden. Darüber hinaus können aktuelle Methoden der Gewebezerstörung auch Zellen aus der Leber freisetzen.

In jüngster Zeit haben wir moderne Werkzeuge wie Next-Gen-Sequenzierung und quantitative PCR eingesetzt und reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Wir haben Ergebnisse zu DIH unter Verwendung von IL-4-, IL-4-Rezeptor-, IL-6-, IL-6-Rezeptor-IL-33- und ST2-defizienten Mäusen veröffentlicht, die alle auf einem BALB/c-Hintergrund basieren, so dass wir die BALB/c-Maus als Steuermaus verwenden können. Zukünftige Anwendungen dieses Modells von DIH werden neben der Nutzung der CRISPR-Technologie auch die Entwicklung von Klopfen in Mäusen umfassen, um bisher unerkannte Mechanismen aufzudecken, die für die Pathogenese des DIH verantwortlich sind.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Dr. Njoku möchte Dr. Noel R. Rose, MD PhD, für seine Anleitung und aufschlussreichen Diskussionen danken, die zur Formulierung dieses Modells geführt haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ThermoFisher 28997
AKP Substrate Kit BioRad 172-1063
BALB/c mice Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher C34554
CFA H37Ra Becton Dickinson (Difco Bacto) 231131
FcR Blocking reagent Milteyi 130-092-575
General supplement ThermoFisher HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved ThermoFisher HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit  ThermoFisher L34965
NaHC03 Millipore Sigma S5761
Percoll® Millipore Sigma P1644-1L
Pertussis Toxin List Biologicals 180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free ThermoFisher 88666
Potassium Hydroxide JT Baker 3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) Millipore Sigma 177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) ThermoFisher 66810
UltraPure™ SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
Williams Media E, no phenol red ThermoFisher A1217601

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 159 Hepatitis medikamenteninduziert immunvermittelt Autoimmunität Cytochrom P450 2E Autoantikörper Mitochondrien oxidativer Stress Foxp3+Tregs Sex
Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen
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