Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Induktion af lægemiddelinduceret, autoimmun hepatitis i BALB / c-mus til undersøgelse af dets patogene mekanismer

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/59174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Summary

Vi beskriver en in vivo immunisering, translationel hepatitis model i BALB / c mus, der kan bruges til at studere patogenesen af lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis, herunder kønsforskelle set i denne sygdom. Vi vil beskrive, hvordan denne model demonstrerer reproducerbare analyser ved hjælp af in vivo og in vitro eksperimentelle teknikker.

Abstract

Lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis (DIH) er den mest almindelige leverlægemiddelinducerede hypersensibiliseringsproces observeret hos ca. 9 til 12% af patienterne med autoimmun hepatitis. Det overvældende flertal af patienter med DIH er kvinder. De underliggende mekanismer for disse kønsforskelle i prævalens er uklare på grund af manglen på dyremodeller, der efterligner menneskelig sygdom. Alligevel menes underliggende mekanismer bredt at være forbundet med humane leukocytantigenhagapityper og kønshormoner. I modsætning hertil har vi ved hjælp af en DIH-musemodel afdækket, at IL-4-initierede CD4 + T-celler rettet mod en epitop af cytokrom P450 2E1 inducerer tilstrømning af neutrofiler, makrofager og mastceller i leveren hos kvindelige BALB / c-mus. Ved hjælp af denne model har vi også vist, at IL-33-inducerede FoxP3+regulatoriske T-celler giver beskyttelse mod DIH hos hun- og hanmus. Denne DIH-model induceres ved immunisering af mus med en epitop af CYP2E1, der er blevet kovalent ændret med en lægemiddelmetabolit, der har været forbundet med DIH. Denne epitop genkendes af patienter med DIH. Vores metode inducerer robust og reproducerbar hepatitis og autoantistoffer, der kan bruges til at studere patogenesen af DIH. Mens in vivo-undersøgelser kan forårsage unødig smerte og angst hos mus, når de udføres forkert, er fordelen ved en in vivo-model evnen til at evaluere patogenesen af sygdom hos et stort antal mus. Derudover kan biologiske virkninger af de ændrede leverproteiner undersøges ved hjælp af invasive procedurer. Tilføjelsen af in vitro-undersøgelser til det eksperimentelle design muliggør hurtig gentagelse og mekanistisk analyse på celleniveau. Således vil vi demonstrere vores modelprotokol, og hvordan den kan bruges til at studere in vivo og in vitro mekanismer af DIH.

Introduction

Formålet med denne metode er at beskrive en musemodel af lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis, der udvikler sig in vivo og demonstrere, hvordan den kan bruges til at undersøge det molekylære, immunologiske og genetiske grundlag for denne sygdom. Det langsigtede mål med vores studier er at afdække mekanismer, der er ansvarlige for udviklingen af kronisk leverbetændelse og skade ved at studere DIH hos modtagelige patienter. Leversygdom og skrumpelever udgør den sjette mest almindelige dødsårsag hos voksne mellem 25 og 64 år. Idiosynkratisk DILI, undertiden benævnt lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis (DIH) er den tredje mest almindelige årsag til akut leversvigt i USA. DIH er den mest almindelige leverlægemiddelinducerede hypersensibiliseringsproces observeret hos ca. 9 til 12% af patienterne med autoimmun hepatitis1. Det overvældende flertal af patienter med DIH er kvinder 2,3,4. En type DIH udvikler sig hos modtagelige individer efter administration af halogenerede flygtige anæstetika såsom isofluran, sevofluran, desfluran eller halothan. Disse anæstetika binder kovalent til leverproteiner med reaktive produkter af deres metabolisme, hvilket skaber nye autoantigener, der er i stand til at fremkalde allergiske eller autoimmune reaktioner5.

Undersøgelsen af patogene mekanismer involveret i udviklingen af bedøvelsesmiddel og enhver form for DIH har tidligere været hæmmet af manglen på en dyremodel, der nøje efterligner induktionen af menneskelig sygdom. Vi har udviklet en eksperimentel murinmodel af DIH med funktioner, der ligner immunmedieret DILI hos patienter. Hepatitis induceres ved immunisering med et af to autoantigener, der er blevet kovalent modificeret af trifluoracetylchlorid (TFA) metabolitten, der dannes efter oxidativ metabolisme af bedøvelsesmidlet af enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Et autoantigen er leverfraktionen af hepatisk cytosolisk S100, som er en blanding af flere proteiner6, og det andet autoantigen er en epitop af CYP2E1, der genkendes af sera fra patienter med bedøvelsesmiddel immunmedieret DILI7. Ved at bruge BALB/c-mus, som er relativt resistente over for eksperimentel autoimmun hepatitis, skelner vi vores model fra den S100-inducerede immuniseringsmodel for autoimmun hepatitis i C57Bl/6J-mus8.

På grund af sine forskellige kliniske præsentationer er DIH vanskelig at studere hos patienter. Translationelle eksperimentelle modeller giver mulighed for at evaluere patogenesen af sygdom in vivo og in vitro. På nuværende tidspunkt er der ingen andre alternative metoder til at inducere DIH, der fuldt ud undersøger in vivo eller in vitro adaptive eller medfødte immunresponser uden brug af dyr. Da trifluoracetylation af S-100 eller CYP2E1-epitopen ikke ser ud til at producere et irriterende immunogen, og vi inducerer DIH ved immunisering med TFA-ændrede proteiner, vil disse dyr ikke modtage ether, halogeneret bedøvelsesmiddel, barbiturat eller alkohol før immunisering eller andre procedurer, i betragtning af at disse midler kan ændre de parametre, vi studerer. Alligevel har vi reduceret vores musebrug ved at bruge computersimulering til at bekræfte bindingspræferencerne for vores opdagede CYP2E1 epitop9 og har spejlet menneskelig DIH, der implicerer kvindelig køn ved at demonstrere, at kvindelige BALB / c-mus udvikler en mere alvorlig DIH10.

På trods af forskellige præsentationer af DIH hos patienter og udfordringer i studiet af klinisk sygdom er posttranslationel modifikation af native proteiner ved reaktive lægemiddelmetabolitter en accepteret nøglemekanisme i patogenesen DIH, der følger halogenerede anæstetika11. Efterforskere accepterer også, at CYP2E1 er et vigtigt autoantigen i denne proces12,13. Rollen af interleukin (IL) -4-opregulerede CD4 + T-celler, der genkender en posttranslationelt modificeret CYP2E1 og andre leverproteiner, er en accepteret initiativtager til bedøvelses-DIH ved at tiltrække neutrofiler, eosinofiler og mastceller i leveren14, og denne mekanisme er blevet bekræftet i mange former for DIH15,16. Inducerede FoxP3-ekspressive CD4 + CD25 + T-celler (Tregs) reducerer sværhedsgraden af DIH, og relative mangler af disse celler i milten forværrer DIH 10,7. Således er de fleste fremskridt inden for forståelse af DIH blevet muliggjort ved at bruge in vivo-musemodeller til at evaluere de genetiske, metaboliske og immunologiske mekanismer i DIH både in vivo og in vitro.

Fordi vi og andre efterforskere har afdækket roller for IL-4, neutrofiler og eosinofiler i initieringen af DIH ved hjælp af forskellige musemodeller, mener vi, at denne observation understøtter vores påstand om, at uanset den anvendte DIH-model induceres hepatitis og skade af IL-4. Styrken i vores protokol ligger i brugen af in vivo-metodologi, både han- og hunmus, og gentagelse af histologi, CD4+ T-celleproliferationsassays og cytokiner. Styrken ved vores brug af in vitro-undersøgelser er, at de reducerer antallet af mus, der er nødvendige, samtidig med at de giver metoden til at isolere cellulære interaktioner, der driver DIH. Vi anbefaler brug af han- og hunmus, fordi dette reducerer muligheden for ubevidst bias i fortolkningen af resultater og styrker oversættelsespotentialet i vores undersøgelser, da forekomsten, prævalensen og sværhedsgraden af DIH er højere hos kvinder17 år. Vi anbefaler, at mus fås fra en enkelt leverandør; Men hvis dette ikke er muligt, skal du få kuldkammeratkontroller eller vildtypemus fra samme leverandør som de genetisk ændrede mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af dyrepleje- og brugsudvalget.

1. Trifluoracetylation af lever S-100 cytosoliske proteiner eller en CYP2E1 epitop

BEMÆRK: Forbered først den trifluoracetylede S100 (TFA-S100) og trifluoracetyllerede CYP2E1-epitop (TFA-JHDN5). Fordi syngeneiske S100 proteiner er nødvendige for immuniseringer, og BALB / c mus er forpligtet til at producere immunogen. Præparatet giver en stor mængde immunogen; så forvent at udføre denne del omkring fire gange om året. En identisk metode vil blive brugt til at fremstille TFA-JHDN5. CYP2E1 epitopen (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, kan sekventeres eller købes.

  1. Isolering af S100-fraktionen af leveren.
    1. Efter sedation af 5 - 10 BALB / c mus med 40-60 mg / kg ketamin blandet med 4 - 6 mg / kg xylazin, bekræfte korrekt dybde af anæstesi ved at observere en reduktion i muskeltonus og ingen reaktion på smertefulde stimuli, såsom en tåklemme (tilbagetrækningsrefleks), ud over tabet af rettende reflekser og tabet af palpebrale reflekser.
    2. Brug mikrokirurgisk saks, udsæt intra-abdominalindholdet ved hjælp af et midterlinjesnit og lav et lille snit i den ringere vena cava for at fjerne blodet.
    3. Angiokateter med 24 gauge anbringes i portalvenen, og leveren tilføres 10 ml/min med 40 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) pH 7,4 i et vandbad ved 4 °C. Fjern og vej de samlede lever og skær det i små stykker (10 - 15 mm).
      BEMÆRK: Eutanasi induceres ved intraperitoneal injektion af yderligere ketamin / xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) efterfulgt af cervikal dislokation og åbning af brysthulen for at kollapse lungerne. Denne metode giver mindst smerte og ubehag for dyrene. Denne metode er i overensstemmelse med anbefalingerne fra panelet om eutanasi fra American Veterinary Medical Association.
    4. Tilsæt 4 gange vægten af saccharose (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homogeniseringsbuffer (pH 7,4) suppleret med komplet proteasehæmmer Cocktailtabletter (se materialetabel) i henhold til producentens anbefalinger. Homogeniseres i et 15 ml polypropylenrør ved hjælp af en generel laboratorievævshomogenisator på medium hastighed på is, indtil den er glat. Homogeniser på is for at forhindre vævet i at blive varmt under homogenisering.
    5. Leverhomogenaterne centrifugeres ved 1500 x g i 10 minutter, og supernatanten hældes derefter af. Supernatanten centrifugeres i 1 time ved 100.000 x g. Snap frys supernatanten og opbevar ved -80 ° C. Supernatanten er cytosolisk S-100.
  2. Trifluoracetylation af S100 og JHDN5
    BEMÆRK: Trifluoracetylation af de ε-aminogrupper af lysinrester af S-100 udføres i henhold til proceduren for Satoh18. Alle dele af dette forsøg med undtagelse af de sidste dage af dialyse udføres i røghætten.
    1. Den samlede proteinkoncentration af det cytosoliske S-100 bestemmes ved anvendelse af bicinchoninsyreassayet (BCA-assay)7. 20 mg BALB/c mus S100 eller JHDN5 fortyndes til 10 ml med dH2O i en 50 ml Erlenmeyer kolbe. Juster pH til 10 med 1N KOH.
    2. Der tilsættes 4,7 mmol S-ethyltrifluorthioacetat (S-ETFA) til opløsningen. Vedligehold pH mellem 9,9 - 10,0 med 1N KOH ved at administrere KOH i dråbemode i ca. 1 time. Optag det samlede volumen KOH for hver reaktion.
    3. Opløsningerne overføres til separate dialysekassetter (Må ikke fyldes for meget). Dialyser kassetterne i 72 timer mod 4 L dH2O med tre skift om dagen. Efter dialyse registreres det endelige volumen af TFA-S100 eller TFA-JHDN5 og derefter aliquot i mærkede rør. Snap frys og opbevar ved –80 °C.
    4. En estimeret koncentration bestemmes ved at dividere den oprindelige mængde S100 eller JHDN5 (i mg) med det endelige volumen efter dialyse (ml). For at bestemme procentændringen af det oprindelige protein19 fortyndes 1,0 mg af hvert naturligt og TFA-ændret protein (hvis den endelige koncentration er større end 1,0 mg) til 1,0 ml med dH2O i separate kuglerør og forberedes et emne med 1,0 ml dH2O. Hvis koncentrationen af det TFA-ændrede protein er mindre end 1,0 mg, må det ikke fortyndes
      1. For at adskille brønde af en 96 brøndplade tilsættes 50 μL af de blanke, indfødte og ændrede proteiner. Der tilsættes 50 μL 4% NaHCO3 efterfulgt af 50 μL 0,1% 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre til hver brønd.
      2. Pladen inkuberes ved 40 °C i 2 timer. Efter inkubationen tilsættes 50 μL 10 % SDS til hver brønd efterfulgt af 25 μL 1N HCI.
      3. Aflæs ved OD på 334 nm, og registrer derefter absorbansen for hver forbindelse fra 200 - 600 nm for at bekræfte det karakteristiske fald i absorbans ved 334 nm. Beregn den procentvise modifikation af lysinrester ved hjælp af TFA ved hjælp af følgende formel:
        Equation 1

2. Immunisering af mus for at inducere hepatitis

BEMÆRK: DIH modelleres i BALB /c-mus ved immuniseringer med levercytosoliske proteiner, der er blevet kovalent ændret af trifluoracetylchlorid (TFA), en model lægemiddelmetabolit, TFA-S1006 eller en epitop af CYP2E1 kovalent ændret af TFA9, TFA-JHDN5, der inducerer hepatitis, autoreaktive T-celler og CYP2E1 autoantistoffer. Mus udviser en miltaktiveringsfase 2 uger efter den indledende immunisering og en leverfase med 3 uger, der er karakteriseret ved granulocytisk inflammation. Kvindelige BALB / c-mus er mere modtagelige end mænd for hepatitis i denne model.

  1. På dag 0 immuniseres 6-8 uger gamle BALB/c mus subkutant i bunden af halsen med 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgeret i lige store mængder komplet Freunds adjuvans (CFA). På dag 0 immunisere musene med 50 ng kighostetoksin, intramuskulært i et af bagbenene. På dag 7 immuniseres musene subkutant i bunden af halen med enten 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgeret i lige store mængder CFA for at sikre, at hver mus modtager to injektioner af det samme immunogen.
    BEMÆRK: Musene overvåges hver time i de første 6 timer efter immuniseringen og derefter mindst to gange dagligt i en uge. Hvis musene viser tegn på smerte eller angst, såsom bøjet kropsholdning eller flæset pels, skal analgetika administreres i overensstemmelse med den lokale ACUC. Hvis der konstateres betydelig smerte eller nød, skal musene evalueres af en dyrlæge for at afgøre, om eutanasi er nødvendig.
  2. Bestemmelse af CD4 + T-celleimmunresponser på hele selvproteiner, epitoper af selvproteiner eller TFA hapten ved hjælp af flowcytometri
    1. Efter sedation af mus med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion skal den korrekte anæstesidybde som beskrevet i trin 1.1.1 bekræftes, og milten identificeres derefter efter eksponering af det intra-abdominale hulrum ved hjælp af en mikrokirurgisk saks. Skær milten ved pedicle og læg den i en petriskål med PBS/2% føtal kalveserum (FCS).
      BEMÆRK: Eutanasi vil blive induceret i musene ved intraperitoneal injektion af yderligere ketamin / xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg), efterfulgt af cervikal dislokation og åbning af brysthulen for at kollapse lungerne. Denne metode giver mindst smerte og ubehag for dyrene. Denne metode er i overensstemmelse med anbefalingerne fra panelet om eutanasi fra American Veterinary Medical Association.
    2. Slip cellerne ved hjælp af frostede glasglas og overfør til et 50 ml konisk polypropylenrør. Vask med PBS/2% FCS ved at bringe volumen op til 50 ml og centrifugere ved 335 x g ved hjælp af en stationær kølecentrifuge. Hæld supernatanten af og gentag dette trin.
    3. Fjern røde blodlegemer ved hjælp af 1 ml ACK Lysing-buffer i 1 minut, og bring volumen op til 50 ml med PBS / 2% FCS. Centrifuger ved 335 x g og hæld supernatanten af.
    4. Tæl cellerne. Mærk cellerne med CFSE i 30 minutter på is i mørke i henhold til producentens anvisninger. Suspender enkeltcellesuspensioner i 6 brøndplader med 3x106 celler / ml pr. Brønd i PBS / 2% FCS.
    5. Stimuler mærkede celler med enten CYP2E1, JHDN5 eller TFA-OVA (10 μg / ml) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2, 95% luft (befugtet). Efter inkubation skal du plette cellerne med CD4-APC (1:100) i 30 minutter på is og analysere ved flowcytometri inden for 3 dage.
    6. Brug følgende gating-strategi til at identificere CD4 + CFSE + -celler: CD4 + CFSE + -celler identificeres fra de lukkede levende celler og vises som histogrammer af prolifererende celler.
  3. Isolering af infiltrerende immunceller fra immuniserede mus.
    1. For at isolere infiltrerende immunceller i leveren på dag 14 eller dag 21 bedøves musene ved intraperitoneal injektion med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin og den korrekte dybde af anæstesi som beskrevet i trin 1.1.1. Efter laparotomi ved hjælp af et midterlinjesnit fremstillet med mikrokirurgisk saks som beskrevet i punkt 1.1.2 kan du knudre portalvenen med en 25 gauge nål og derefter skære den ringere vena cava under nyrevenerne.
    2. Perfuse hver lever med en strømningshastighed på 10 ml / min med 40 ml PBS i et vandbad 37 ° C. Efter perfusion, ved hjælp af mikrokirurgisk saks, skær leveren ved leverpedicle, fjern galdeblæren og skær derefter leveren ved hilum.
    3. Forstyr leveren på en maskesigte i rustfrit stål ved hjælp af en 20 ml steril sprøjtepestle og kold PBS. Den resulterende cellesuspension filtreres i 50 ml præsteriliserede centrifugerør ved hjælp af en 300-maskeskærm. Hver suspension bringes op på 50 ml ved hjælp af kold PBS, og suspensionen vaskes derefter ved centrifugering i 10 minutter ved 370 x g.
    4. Kassér supernatanten, og saml derefter hver pille ved behandling i nye 50 ml rør (Et rør pr. mus anbefales, men hvis prøver samles, anbefales 2-4 pellets / rør). Suspender de poolede pellets i 45 ml Percoll 35% (i PBS) og 100 IE / ml heparin.
    5. Drej hvert rør ved 500 x g i 10 minutter ved 20 °C. Kassér supernatanten, og ophæng pelleten i 5 ml PBS, og tilsæt derefter 1 ml ACK-lysbuffer til hver pellet i 10 minutter på is.
    6. Hvert rør bringes op på 50 ml med PBS, og det vaskes ved centrifugering i 10 min. ved 370 x g. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes derefter med PBS/2 % FCS ved centrifugering i 10 minutter ved 370 x g. Tæl cellerne.
    7. Analyse af celletype ved hjælp af flowcytometri
      BEMÆRK: Her er et eksempel på, hvordan induceret Foxp3 + Tregs kan detekteres.
      1. Inkuber 1x106 celler med FcR-blokerende reagens og plet med 1:100 fortyndinger af CD4-FITC, CD25-PE og CD45-PerCP i 30 minutter på is. Derefter pletter cellerne intracellulært med FoxP3-APC.
      2. Cellerne fikseres med 250 μL fikseringsbuffer (se materialetabel), og opbevares ved 4 °C indtil analyse ved flowcytometri inden for 3 dage.
      3. Følgende gatingstrategi anbefales for at detektere induceret Foxp3 + Tregs i enkeltcellesuspensioner fra lever, milt eller lymfeknuder ved hjælp af flowcytometri: Identificer levende celler ved hjælp af Live / Dead Fixable Aqua Dead Cell-pletsæt. Dernæst gate på leverceller, der er CD45+ (PerCP, klon RA3-6B2), og gate CD4+ celler (FITC, cloneGK1.5) fra CD45+ gaten. Fra CD4+ cellerne skal du identificere procentdelene af CD25+ (PE, klon 7D4) og FoxP3+ (APC, klon 3G3) celler.
  4. Histologisk analyse af levervæv for hepatitis
    1. På dag 21 skal du fastgøre leversektionerne (5 μm tykke) i 10% neutralt bufferet formalin og plet med hæmatoxylin &eosin.
    2. Bestem histologiscorer først ved lav effekt (40X) i gennemsnit 2 visninger og bekræft ved 64X. Score vævssektionerne som følger: Grad 0 = ingen betændelse eller nekrose; Grad 1= mindre lobulær betændelse uden nekrose; Grad 2= lobulær betændelse, der involverer <50% af sektionen; Grad 3 = lobulær betændelse, der involverer ≥ 50% af sektionen; og grad 4 = betændelse med nekrose.
  5. Bestemmelse af vævscytokinniveauer i milt og lever.
    1. På dag 14 eller dag 21 homogeniseres lever- eller miltprøverne (1 g) fra hver mus i 1 ml RPMI/2% FCS, indtil de er glatte ved hjælp af en generel laboratoriehomogenisator på medium indstilling. Hold prøven kold på is.
    2. Homogenatet centrifugeres i 15 minutter ved 1455 x g ved 4 °C ved hjælp af en kølecentrifuge. Snap frys supernatanten og opbevar ved -80 ° C, indtil den er klar til brug. Cytokin- og kemokinniveauer kan måles med kommercielle ELISA-sæt i henhold til kitinstruktioner. Standardisere niveauerne af cytokiner ved at konvertere niveauerne (i ml eller μL) til pg / g væv.
  6. Påvisning af serumantistoffer mod CYP2E1, CYP2E1-epitopen JHDN5 og TFA-lægemiddelmetabolitten.
    1. På dag 14 eller 21 bedøves musene med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin. Bekræft korrekt dybde af anæstesi ved at observere en reduktion i muskeltonen og intet svar på smertefulde stimuli, såsom en tåklemme (tilbagetrækningsrefleks), ud over tabet af rettende reflekser og tabet af palpebrale reflekser. Brug en 25 G nål fastgjort til en tuberkulinsprøjte og nærme sig hjertet ved langsomt at føre nålen ind i brysthulen under ribbenene og umiddelbart lateralt til xiphoid-processen. Saml blod ved hjælp af intrakardiøs punktering.
    2. Når blodet er opsamlet, lad det størkne ved stuetemperatur. Blodprøverne centrifugeres ved 295 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt seraen, aliquot seraen og klik frys ved -20 °C.
    3. Der anbringes 100 μL CYP2E1-, JHDN5- eller TFA-ovalbumin(OVA)-testantigener (5 μg/ml i PBS) på 96 brøndplader i mindst 18 timer ved 4 °C natten over. Den næste dag vaskes pladerne med vaskebuffer (PBS/2%FCS), 2 cyklusser (4 vaske hver).
    4. Påfør 100 μL musesera (1:100) i PBS/2% FCS i tre eksemplarer på pladerne og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer. Efter 2 timer vaskes pladerne med vaskebuffer som beskrevet i trin 2.6.2.
    5. Tilsæt 100 μL alkalisk fosfatase (AKP)-gede-antimus IgG, AKP-rotte-antimus IgG1 eller AKP-rotte antimus IgG2a sekundære antistoffer (1:1000) i 2 timer efterfulgt af et vasketrin på 1 cyklus med vaskebuffer og 1 cyklus med PBS. Deteter antistofferne ved hjælp af et AKP-substratsæt og mål ved OD 405 nm hvert 15. minut med et spektrofotometer. TFA udvikler sig normalt fuldstændigt på 15 min, mens CYP2E1 og CYP2E1 epitopen kan udvikle sig fra 30 til 60 min7.
  7. Undersøgelser af udviklingen af JHDN5 IgG-induceret oxidativ stress in vitro.
    1. Brug 12 brøndplader til at inkubere 106 terminalt differentierede leverceller pr. brønd på fibronektindækkede dækslips i 1000 μL Williams E-medier suppleret med glutamin og generelt supplement (se materialetabel) ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed i 7 dage som anbefalet for at maksimere CYP2E1-aktivitet.
    2. Tilsæt JHDN5 IgG (1:40) eller mus IgG (1:1000) for at adskille brønde og inkubere i 2 timer ved 37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed. Hybridoma sera var meget fortyndet. Tilsæt dybrød fluorescerende antistofdetektor (se materialetabel) i yderligere 30 minutter til alle brønde.
    3. Vask brøndene 3x med 1 ml PBS i mørke. Cellerne anbringes i 3,7% formaldehyd i 10 min. Undersøg ved konfokal mikroskopi inden for 24 timer.
  8. Co-lokaliseringsundersøgelser af JHDN5 IgG med intracellulære organeller såsom mitokondrier in vitro.
    1. For at demonstrere co-lokalisering af JHDN5 IgG med mitokondrier, sparsom kultur (~ 30% sammenløb) terminalt differentierede leverceller på fibronectin-dækkede dæksedler i 7 dage i farvestoffri Williams medie E suppleret som beskrevet i trin 2.7.
    2. Efter bestemmelse af de korrekte absorptionsbølgelængder tilsættes grønt fluorescerende, 488 nm -konjugeret mus IgG eller JHDN-5 (1:100) og rødt fluorescerende, 594-konjugeret Mito-tracker Rød (1:100) i 2 timer (37 °C), 5% CO2, 95% fugtighed.
    3. Monter mærkede fibronectin-dækkede dækslips med Anti-fade Reagens med DAPI, og undersøg ved konfokal mikroskopi.

3. Generelle protokolbemærkninger

  1. Brug ikke-farmaceutiske kvalitetsværktøjer, når forbindelser ikke er tilgængelige i en formulering til klinisk brug. Få dog hvert af disse værktøjer fra pålidelige kommercielle leverandører, der er identificeret i denne metode. Brug altid kemikalier, der er i overensstemmelse med specifikationerne defineret af Udvalget for Analytiske Reagenser fra American Chemical Society på mindst reagenskvalitetsniveauet. Til vores metoder skal du bruge reagenser på analytisk kvalitetsniveau, når det er muligt.
  2. Følg streng aseptisk teknik til formulering af de TFA-ændrede proteiner for at forhindre forurening, der kan påvirke dyrevelfærden eller fortolkningen af data negativt.
  3. Opbevar og brug ikke-farmaceutiske formuleringer i varigheder, hvor formuleringen forbliver potent, i henhold til tilgængelige tekniske oplysninger. CFA opbevares ved stuetemperatur, CYP2E1 og dens epitoper ved -20 eller -80 °C. Opbevar TFA-ændrede proteiner ved -80 °C og fik lov til at komme til 4 °C før emulgering med CFA. TFA-ændrede proteiner opbevares ved -80 °C, og opbevares i alikvoter for at forhindre gentagne fryse-optøningscyklusser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immuniseringsplanen, der anvendes til at inducere DIH vist i figur 1 , repræsenterer de to immuniseringer, der kræves i bunden af nakken (dag 0) og bunden af halen (dag 7). Figur 2 viser repræsentative proliferationsdata opnået på dag 14 ved anvendelse af CFSE som respons på CYP2E1, JHDN5, CYP2E1-epitopen og trifluoracetyl (TFA) metabolitten af bedøvelsesmidlerne. Figur 3 viser gatingstrategien og repræsentativ flowcytometrianalyse af induceret CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs opnået på dag 14. Figur 4 viser repræsentative hæmatoxylin- og eosinfarvede dias, der viser udviklingen af hepatitis på dag 21 6. Figur 5 viser repræsentative hæmatoxylin- og eosinfarvede dias, der viser mere alvorlig hepatitis hos hun-BALB/c-mus sammenlignet med hanner på dag 21 ud over det sammenlignende celleindhold i disse lever10. Figur 6 viser repræsentative konfokale mikroskopi-dias, der viser fraværet af samlokalisering af muse-IgG med mitokondrier. Figur 7 viser repræsentativ konfokal mikroskopi, der viser co-lokalisering af JHDN5 IgG med mitokondrier.

Figure 1
Figur 1: Immunisering af mus for at inducere hepatitis. DIH kan induceres hos hun-BALB/c-mus (som et eksempel) ved immunisering med TFA-JHDN5 (100 μg) emulgeret i komplet Freunds adjuvans (CFA) subkutant (s.c.) i bunden af nakken og 50 ng kighostetoksin intramuskulært (i.m.) i bagbenet på dag 0 (trin 1). På dag 7 kan BALB/c-mus derefter immuniseres med TFA-JHDN5 (100 μg) emulgeret i CFA (s.c.) ved halefoden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Bestemmelse af CD4+ T-cellers immunrespons på hele selvproteiner, epitoper af selvproteiner eller TFA hapten ved hjælp af flowcytometri. Enkeltcellesuspensioner af splenocytter fra 6 - 8 uger gamle BALB / c-mus isoleret dag 14 efter den indledende immunisering, mærket med CFSE, stimuleret med TFA-OVA, CYP2E1 eller JHDN5 (10 μg / ml) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2, 95% luft (befugtet), farvet med CD4-APC og analyseret ved flowcytometri. Brønde uden antigen (medier) blev brugt som kontroller. BALB/c-mus udviklede proliferation som reaktion på OVA-TFA og CYP2E1 og ikke JHDN5 sammenlignet med medier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Gating-strategi til identifikation af CD4+CD25+FoxP3+-inducerede tregs ved hjælp af metoden beskrevet i 2.3.7. Den første port identificerer levende celler. For at detektere immunceller blev CD45+ celler oprindeligt gated. Derefter blev CD4 + T-celler identificeret og gated, efterfulgt af identifikation af CD25 + FoxP3 + celler inden for CD4 + T-cellepopulationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Histologisk analyse af levervæv for hepatitis. CFA-immuniserede mus (toppanel) blev brugt som køretøjskontroller. S100-immuniserede mus (mellempanel) blev evalueret efter immuniseringer efter samme tidsplan. På dag 21 blev mus aflivet, og leveren fikseret i formalin. Sektioner 5 μm tykke blev lavet og farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E). Minimal leverbetændelse (blå celler) demonstreres efter CFA (top) og S100 (mellem) immuniseringer og store mængder inflammation efter immuniseringer med TFA-S100. (H&E, forstørrelse 64X). Denne figur bruges med tilladelse6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Hun-BALB/c-mus udvikler mere DIH sammenlignet med BALB/c-hanmus. (A) Hunmus (n = 8) havde signifikant mere alvorlig hepatitis 3 uger efter TFA-S100 / CFA-immuniseringer end mænd (n = 7 / gruppe). (B) Repræsentative leverafsnit fra hun- og hanmus (H&E, forstørrelse 64X). (C) Antallet af lever-CD4+-, CD8+-, NK+- og NKT+-celler var signifikant højere hos kvinder end hos mænd. Middel ± SEM. *s<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Denne figur bruges med tilladelse10. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Mouse IgG lokaliserer ikke med mitokondrier. Konfokalt billede af terminalt differentierede leverceller farvet med grønt fluorescerende (488 nm) -mærket mus IgG (1:100) (grøn) ud over rødt fluorescerende (594) - mærket Mitotracker Red (1: 100). Grønt fluorescerende (488 nm)-mærket Mouse IgG lokaliserer ikke sammen med Mitotracker Red (63X forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: JHDN5 IgG lokaliserer med mitokondrier. Konfokalt billede af terminalt differentierede hepatiske stamceller farvet med grønt fluorescerende (488) - mærket JHDN-5 IgG (1: 100) ud over rødt fluorescerende (594) - mærket Mitotracker Red (1: 100). Grøn fluorescerende (488 nm) – mærket JHDN-5 IgG co-lokaliserer med Mito-tracker Red, demonstreret af den gule nuance på det repræsentative billede (63X forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Styrken af denne protokol hviler i dens reproducerbarhed; så det er vigtigt at overholde de foreslåede trin. Formulering af immunogen kan være en barriere for nogle; Vi har dog gengivet vores model ved hjælp af epitopen beskrevet i vores dokument, hvilket fjerner behovet for at isolere S100-fraktionen af leveren. Det er sandsynligt, at yderligere epitoper eller proteiner kan ændres og fremkalde hepatitis efter immuniseringer; Vi beskriver dog de proteiner, som vi har brugt med pålidelige resultater. Flere proteiner har vist sig at være trifluoracetyler ved halogeneret bedøvelseseksponering. Mest sandsynligt på grund af epitopspredning er nogle af disse proteiner også mål for autoantistoffer i deres oprindelige, ikke-trifluoracetyllerede tilstand. Som et eksempel bærer E2-underenheden af pyruvatdehydrogenasekomplekset (PDH-E2) epitoper (liponsyreprotesegruppen) med en strukturel lighed med TFA-delen i TFA-addukter. Antistoffer genereret hos patienter med halothan hepatitis har vist sig at være krydsreaktive over for TFA-proteiner og PDH-E2 20,21.

Vores DIH-model kræver to immuniseringer, der emulgeres i CFA langs musenes bagside. Vi ved, at fodpudeinjektioner med CFA har været forbundet med smerte og angst i musen. Derfor omfattede udviklingen af den eksperimentelle DIH-model flere eksperimentelle forsøg. Da vi evaluerede modellen ved hjælp af en immunisering ved hjælp af CFA, med den anden immunisering ved hjælp af ufuldstændig Freunds adjuvans (IFA) eller IFA i begge injektioner med vores immunogen, udviklede leverbetændelse sig ikke. I skarp kontrast, da vi immuniserede musene med immunogen ved hjælp af to immuniseringer med CFA, var der signifikant leverbetændelse til stede. Den oprindelige beskrivelse af en anden model af autoimmun hepatitis omfattede undersøgelser svarende til vores og krævede to immuniseringer med CFA for at demonstrere signifikant leverbetændelse8. Alligevel revurderer vi løbende adjuvanser ved hjælp af litteratursøgninger for at forsøge at optimere inflammation uden CFA. Som et eksempel er der en velkendt adjuvans Titer Max, der ville forstærke B-celleresponser; Men selvom antistoffer er en bestanddel af DIH, har vi og andre vist en kritisk rolle for T-celleresponser i vores model14.

Udviklingen af pålidelige modeller letter undersøgelserne af patogenesen af DIH. Vi demonstrerer, at leverhistologi og immunceller kan evalueres pålideligt på forskellige stadier i denne model. Vi demonstrerer identifikation af antigenspecifikke T-celler, serumantistoffer og vævscytokiner, der kan bruges til at studere udviklingen af DIH. Vi demonstrerer metoderne til isolering af celler fra den betændte lever og foreslår brugen af heparin. Vi har dog udført denne teknik uden heparin, og resultaterne var ikke til at skelne fra hinanden. Derudover kan nuværende metoder til vævsforstyrrelse også frigive celler fra leveren.

For nylig har vi brugt moderne værktøjer som næste generations sekventering og kvantitativ PCR og har oplevet reproducerbare resultater. Vi har offentliggjort resultater vedrørende DIH ved hjælp af IL-4, IL-4 receptor, IL-6, IL-6 receptor IL-33 og ST2 mangelfulde mus, der alle blev afledt på en BALB / c baggrund, så vi kan bruge BALB / c mus som vores kontrolmus. Fremtidige anvendelser af denne model af DIH vil omfatte udvikling af banke i mus ud over brugen af CRISPR-teknologi for at afdække tidligere ukendte mekanismer, der er ansvarlige for patogenesen af DIH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dr. Njoku vil gerne anerkende Dr. Noel R. Rose, MD PhD, for hans vejledning og indsigtsfulde diskussioner, der resulterede i formuleringen af denne model.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ThermoFisher 28997
AKP Substrate Kit BioRad 172-1063
BALB/c mice Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher C34554
CFA H37Ra Becton Dickinson (Difco Bacto) 231131
FcR Blocking reagent Milteyi 130-092-575
General supplement ThermoFisher HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved ThermoFisher HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit  ThermoFisher L34965
NaHC03 Millipore Sigma S5761
Percoll® Millipore Sigma P1644-1L
Pertussis Toxin List Biologicals 180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free ThermoFisher 88666
Potassium Hydroxide JT Baker 3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) Millipore Sigma 177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) ThermoFisher 66810
UltraPure™ SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
Williams Media E, no phenol red ThermoFisher A1217601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Tags

Immunologi og infektion udgave 159 hepatitis lægemiddelinduceret immunmedieret autoimmunitet cytokrom P450 2E autoantistof mitokondrier oxidativ stress Foxp3 +Tregs sex
Induktion af lægemiddelinduceret, autoimmun hepatitis i BALB / c-mus til undersøgelse af dets patogene mekanismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Wu, T. Y., Cottagiri,… More

Thomas, D., Wu, T. Y., Cottagiri, M., Nyandjo, M., Njoku, D. B. Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms. J. Vis. Exp. (159), e59174, doi:10.3791/59174 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter