Summary
우리는이 질병에서 볼 수있는 성별 차이를 포함하여 약물 유발 자가면역 간염의 발병 기전을 연구하는 데 활용할 수있는 BALB / c 마우스의 생체 내 예방 접종, 번역 형 간염 모델을 설명합니다. 우리는이 모델이 생체 내 및 시험관 내 실험 기술을 사용하여 재현 가능한 분석을 시연하는 방법을 설명 할 것입니다.
Abstract
약물-유도성 자가면역간염(DIH)은 자가면역간염 환자의 약 9~12%에서 관찰되는 가장 흔한 간약물 유도성 과민화 과정이다. DIH 환자의 압도적 인 대다수는 여성입니다. 유병률에서 이러한 성별 차이의 근본적인 메커니즘은 인간의 질병을 모방 한 동물 모델의 소박함 때문에 명확하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 근본적인 메카니즘은 인간 백혈구 항원 일배체형 및 성 호르몬과 관련되는 것으로 널리 믿어지고 있다. 대조적으로, DIH 마우스 모델을 사용하여, 우리는 IL-4 개시 CD4+ T 세포가 시토크롬 P450 2E1의 에피토프에 대해 지시된 것을 밝혀냈고, 이는 여성 BALB/c 마우스의 간으로의 호중구, 대식세포 및 비만 세포의 유입을 유도한다. 이 모델을 사용하여, 우리는 또한 IL-33-유도된 FoxP3+조절 T 세포가 암컷 및 수컷 마우스에서 DIH에 대한 보호를 부여한다는 것을 보여주었다. 이 DIH 모델은 DIH와 관련된 약물 대사 산물과 공유적으로 변경된 CYP2E1의 에피토프로 마우스를 면역화함으로써 유도된다. 이러한 에피토프는 DIH 환자에 의해 인식된다. 우리의 방법은 DIH의 발병 기전을 연구하는 데 활용할 수있는 강력하고 재현 가능한 간염 및 자가항체를 유도합니다. 생체내 연구가 부적절하게 행해질 때 마우스에서 과도한 통증과 고통을 야기할 수 있지만, 생체내 모델의 장점은 다수의 마우스에서 질병의 발병기전을 평가할 수 있다는 것이다. 또한, 변경된 간 단백질의 생물학적 효과는 침습적 인 절차를 사용하여 연구 할 수 있습니다. 시험관 내 연구를 실험 설계에 추가하면 세포 수준에서 신속한 반복 및 기계론적 분석이 가능합니다. 따라서, 우리는 우리의 모델 프로토콜과 DIH의 생체 내 및 시험관 내 메커니즘을 연구하는 데 어떻게 활용 될 수 있는지 입증 할 것입니다.
Introduction
이 방법의 목적은 생체 내에서 발생하는 약물 유도 자가면역 간염의 마우스 모델을 기술하고이 질병의 분자적, 면역 학적 및 유전 적 기초를 조사하는 데 어떻게 활용 될 수 있는지 입증하는 것입니다. 우리 연구의 장기적인 목적은 감수성 환자에서 DIH를 연구함으로써 만성 간 염증 및 부상의 발달을 담당하는 메커니즘을 밝히는 것입니다. 간 질환과 간경변은 25 세에서 64 세 사이의 성인에서 여섯 번째로 흔한 사망 원인을 구성합니다. 약물 유발 자가면역 간염(DIH)이라고도 하는 특발성 DILI는 미국에서 급성 간 기능 부전의 세 번째로 흔한 원인입니다. DIH는 자가면역간염 1형 간염 환자의 약 9~12%에서 관찰되는 가장 흔한 간 약물-유도성 과민증 과정이다. DIH 환자의 압도적 인 대다수는 여성 2,3,4입니다. DIH의 유형은 이소플루란, 세보플루란, 데스플루란 또는 할로탄과 같은 할로겐화 휘발성 마취제를 투여한 후 감수성이 있는 개체에서 발생합니다. 이러한 마취제는 신진 대사의 반응성 산물과 간 단백질에 공유적으로 결합하여 알레르기 또는 자가면역 반응을 유도 할 수있는 새로운 자기 항원을 만듭니다5.
마취제 및 DIH의 모든 형태의 개발에 관련된 병원성 메커니즘에 대한 연구는 이전에 인간 질병의 유도를 밀접하게 모방하는 동물 모델의 부족으로 인해 방해 받았다. 우리는 환자에서 면역 매개 DILI와 유사한 기능을 가진 DIH의 실험적 뮤린 모델을 개발했습니다. 간염은 시토크롬 P450 2E1(CYP2E1)5 효소에 의해 마취제의 산화 대사 후 형성되는 트리플루오로아세틸 클로라이드(TFA) 대사산물에 의해 공유적으로 변형된 두 개의 자가항원 중 하나로 면역화에 의해 유도된다. 하나의 자가항원은 여러 단백질6의 혼합물인 간 세포질 S100 간 분획이고, 두 번째 자가항원은 마취성 면역 매개 DILI7을 갖는 환자로부터 혈청에 의해 인식되는 CYP2E1의 에피토프이다. 실험적 자가면역간염에 비교적 내성이 있는 BALB/c 마우스를 사용하여 C57Bl/6J 마우스8의 자가면역간염의 S100 유도 면역화 모델과 모델을 구별합니다.
다양한 임상 프리젠 테이션 때문에 DIH는 환자에서 연구하기가 어렵습니다. 번역 실험 모델은 생체내 및 시험관 내에서 질병의 발병기전을 평가하는 능력을 제공한다. 현재, DIH를 유도하기 위한 다른 대안적인 방법은 동물의 사용 없이 생체내 또는 시험관내 적응성 또는 선천적 면역 반응을 완전히 검사하는 것이 아니다. 더욱이, S-100 또는 CYP2E1 에피토프의 트리플루오로아세틸화는 자극성 면역원을 생성하는 것으로 보이지 않으며, 우리는 TFA 변경된 단백질로 면역화함으로써 DIH를 유도하고 있기 때문에, 이들 동물은 면역화 또는 다른 절차 전에 에테르, 할로겐화 마취제, 바르비투레이트 또는 알코올을 투여받지 않을 것이며, 이러한 제제가 우리가 연구하고있는 파라미터를 바꿀 수 있다는 점을 고려한다. 그럼에도 불구하고, 우리는 컴퓨터 시뮬레이션을 활용하여 발견 된 CYP2E1 에피토프9 의 결합 선호도를 확인하고 여성 BALB / c 마우스가 더 심한 DIH10을 개발한다는 것을 보여줌으로써 여성의 성별을 암시하는 인간 DIH를 미러링함으로써 마우스 사용을 줄였습니다.
환자에서 DIH의 다양한 제시와 임상 질환 연구의 도전에도 불구하고, 반응성 약물 대사 산물에 의한 천연 단백질의 번역 후 변형은 할로겐화 마취제11을 따르는 DIH 병인에서 받아 들여지는 핵심 메커니즘입니다. 조사관들은 또한 CYP2E1이 이 과정12,13에서 주요 자가항원이라는 것을 받아들인다. 번역 후 변형된 CYP2E1 및 기타 간 단백질을 인식하는 인터루킨(IL)-4-상향조절된 CD4+T 세포의 역할은 호중구, 호산구 및 비만 세포를 간(14)으로 유인함으로써 마취 DIH의 수용된 개시제이며, 이 기전은 DIH15,16의 여러 형태에서 확인되었다. 유도된 FoxP3-발현 CD4+CD25+T 세포 (Tregs)는 DIH의 중증도를 감소시키고, 비장에서 이들 세포의 상대적 결핍은 DIH 10,7을 악화시킨다. 따라서, DIH를 이해하는 진보의 대부분은 생체내 및 시험관내 DIH의 유전적, 대사적 및 면역학적 메카니즘을 평가하기 위해 생체내 마우스 모델을 활용함으로써 가능하게 되었다.
우리와 다른 연구자들이 다른 마우스 모델을 사용하여 DIH를 개시하는 과정에서 IL-4, 호중구 및 호산구에 대한 역할을 밝혀 냈기 때문에이 관찰은 사용 된 DIH 모델에 관계없이 간염 및 부상이 IL-4에 의해 유도된다는 우리의 주장을 뒷받침한다고 믿습니다. 우리의 프로토콜의 강점은 수컷 및 암컷 마우스 모두의 생체 내 방법론의 활용과 조직학, CD4+ T 세포 증식 분석 및 사이토카인의 반복에 있습니다. 시험관 내 연구의 우리의 사용의 강점은 DIH를 유도하는 세포 상호 작용을 분리하는 방법론을 제공하면서 필요한 생쥐의 수를 줄인다는 것입니다. 우리는 수컷과 암컷 마우스의 사용을 권장하는데, 이는 결과의 해석에서 무의식적 편향의 가능성을 줄이고 DIH의 발생률, 유병률 및 중증도가 여성17에서 더 높기 때문에 우리 연구의 번역 잠재력을 강화하기 때문입니다. 마우스는 단일 공급 업체에서 얻는 것이 좋습니다. 그러나 이것이 가능하지 않다면 유전자 변형 마우스와 동일한 공급 업체로부터 깔짚 메이트 대조군 또는 야생형 마우스를 얻으십시오.
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Protocol
모든 절차는 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
1. 간 S-100 세포질 단백질 또는 CYP2E1 에피토프의 트리플루오로아세틸화
참고: 먼저, 트리플루오로아세틸화 S100(TFA-S100) 및 트리플루오로아세틸화 CYP2E1 에피토프(TFA-JHDN5)를 준비한다. 면역화에는 syngeneic S100 단백질이 필요하고 BALB / c 마우스는 면역 원을 생산해야합니다. 제제는 다량의 면역원을 산출한다; 따라서이 부분을 일년에 네 번 정도 수행 할 것으로 예상됩니다. TFA-JHDN5를 만드는 데 동일한 방법이 사용됩니다. 상기 CYP2E1 에피토프 (JHDN5), GII/FNN/GPT/WKD/IRR/FSL/TTL, 시퀀싱 또는 구매될 수 있다.
- 간장의 S100 분획의 단리.
- 4 - 6 mg / kg 크실라진과 혼합 된 40-60 mg / kg 케타민을 함유 한 5 - 10 BALB / c 마우스를 진정시킨 후, 오른쪽 반사의 상실과 팔페브랄 반사의 상실 외에도 근육 긴장의 감소와 발가락 꼬집음 (금단 반사)과 같은 고통스러운 자극에 대한 반응이 없음을 관찰하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.
- 미세 외과 용 가위를 사용하여 중간 선 절개를 사용하여 복강 내 내용물을 노출시키고 열등한 정맥 카바에 작은 절단을 만들어 혈액을 제거하십시오.
- 24게이지 혈관 카테터를 문맥 정맥에 넣고 4°C의 수조에서 40mL의 인산완충식염수(PBS) pH 7.4와 함께 간 10mL/min을 관류시킨다. 풀링 된 간을 제거하고 무게를 측정하고 작은 조각 (10 - 15mm)으로 자릅니다.
참고 : 안락사는 추가 케타민 / 자일라진 (80 mg / kg : 8 mg / kg)의 복강 내 주사에 의해 유도되며, 자궁 경부 탈구와 흉강을 열어 폐를 붕괴시킵니다. 이 방법은 동물에게 최소한의 통증과 불편 함을 제공합니다. 이 방법은 미국 수의학 협회 안락사 패널의 권고와 일치합니다. - 제조업체 권장 사항에 따라 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (표 참조)로 보충 된 EDTA (1 mM) 균질화 완충액 (pH 7.4)의 4 배 중량 의 4 배를 추가하십시오. 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서 균질화하고, 일반 실험실 조직 균질기를 사용하여 얼음 상에서 중간 속도로 매끄럽게 할 때까지 균질화한다. 균질화 중에 조직이 따뜻해지는 것을 방지하기 위해 얼음 위에서 균질화하십시오.
- 간 균질물을 1500 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 부어낸다. 상층액을 100,000 x g에서 1 h 동안 원심분리한다. 스냅 상청액을 동결시키고 -80°C에서 저장한다. 상청액은 세포질 S-100이다.
- S100 및 JHDN5의 트리플루오로아세틸화
참고: S-100의 라이신 잔기의 ε아미노기의 트리플루오로아세틸화는 사토우18의 절차에 따라 수행될 것이다. 투석의 후기를 제외하고이 실험의 모든 부분은 흄 후드에서 수행됩니다.- 비친코닌산 분석법(BCA assay)7을 사용하여 세포질 S-100의 총 단백질 농도를 결정한다. 50mL 삼각플라스크에 dH2O로 BALB/c 마우스 S100 또는 JHDN520mg을 10mL로 희석한다. 1N KOH로 pH를 10으로 조정한다.
- 4.7 mmole의 S-에틸트리플루오로티오아세테이트 (S-ETFA)를 용액에 첨가한다. 약 1 시간 동안 액적 방식으로 KOH를 투여하여 1N KOH로 9.9 - 10.0 사이의 pH를 유지하십시오. 각 반응에 대한 KOH의 총 부피를 기록한다.
- 용액을 별도의 투석 카세트로 옮기십시오 (과도하게 채우지 마십시오). 하루에 세 번 변경하여 dH2O의 4L에 대해72시간 동안 카세트를 투석한다. 투석 후, TFA-S100 또는 TFA-JHDN5의 최종 부피를 기록한 다음, 분취량을 라벨이 붙은 튜브에 넣는다. 스냅 동결 및 -80 °C에서 보관하십시오.
- 추정된 농도는 S100 또는 JHDN5의 초기 양(mg)을 투석 후 최종 부피(mL)로 나눔으로써 결정된다. 천연 단백질19의 변형 퍼센트를 결정하기 위해, 각각의 천연 및 TFA 변경된 단백질 1.0 mg(최종 농도가 1.0 mg을 초과하는 경우)을 별도의 탄환 튜브에서 dH2O로 1.0 mL로 희석하고, 1.0 mLdH2O를 사용하여 블랭크를 제조하였다. TFA 변경 단백질의 농도가 1.0mg 미만이면 희석하지 마십시오.
- 96 웰 플레이트의 웰을 분리하려면 50 μL의 블랭크, 네이티브 및 변경된 단백질을 첨가하십시오. 50 μL의 4% NaHCO3를 첨가하고, 이어서 50 μL의 0.1%2,4,6 -트리니트로벤젠술폰산을 각 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 40°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션에 이어서, 50 μL의 10% SDS를 각 웰에 첨가한 다음, 25 μL의 1N HCl을 첨가하였다.
- 334nm의 OD에서 읽은 다음 200 – 600nm에서 각 화합물의 흡광도를 기록하여 334nm에서 흡광도의 특성 강하를 확인하십시오. 다음 공식을 사용하여 TFA에 의한 리신 잔기의 변형률을 계산하십시오.
2. 간염을 유발하는 마우스의 면역화
참고: DIH는 BALB/c 마우스에서 삼불소아세틸 클로라이드(TFA), 모델 약물-대사산물, TFA-S1006 또는 간염, 자가반응성 T 세포 및 CYP2E1 자가항체를 유도하는 TFA-JHDN5에 의해 공유적으로 변경된 CYP2E1의 에피토프에 의해 공유적으로 변경된 간 세포질 단백질로 면역화함으로써 모델링됩니다. 마우스는 초기 면역화 후 2주 후에 비장 활성화 단계를 나타내고 3주째에는 간장성 염증을 나타내므로 과립성 염증을 특징으로 한다. 암컷 BALB / c 마우스는이 모델에서 남성보다 간염에 더 취약합니다.
- 0일째에, 6-8주령의 BALB/c 마우스를 200μg의 TFA-S100 또는 100μg의 TFA-JHDN5로 목 기저부에서 피하 면역시키면서 동일한 부피의 완전한 프로인트 보조제(CFA)로 면역시킨다. 0 일째에 백일해 독소 50 ng으로 쥐를 뒷다리 중 하나에서 근육 내로 면역하십시오. 7일째에, 꼬리 기저부에서 200μg의 TFA-S100 또는 100μg의 TFA-JHDN5를 동일한 부피의 CFA로 유화하여 각 마우스가 동일한 면역원의 두 번의 주사를 받도록 한다.
참고 : 마우스는 예방 접종 후 처음 6 시간 동안 매시간 모니터링 한 다음 일주일 동안 매일 두 번 이상 모니터링합니다. 마우스가 구부러진 자세 또는 주름진 모피와 같은 통증이나 고통의 징후를 보이는 경우, 진통제는 국소 ACUC에 따라 투여되어야합니다. 심각한 통증이나 고통이 지적되면 안락사가 필요한지 여부를 결정하기 위해 수의사가 쥐를 평가해야합니다. - 유세포 분석기를 사용하여 전체 자가단백질, 자가단백질의 에피토프 또는 TFA 합텐에 대한 CD4+ T 세포 면역 반응의 결정
- 복강 내 주사를 통해 4-6 mg / kg 자일라진과 혼합 된 40-60 mg / kg 케타민으로 마우스를 진정시킨 후 1.1.1 단계에서 설명한 바와 같이 마취의 적절한 깊이를 확인한 다음 미세 외과 가위를 사용하여 복강 내 노출 후 비장을 확인하십시오. 페디클에서 비장을 자르고 PBS / 2 % 태아 송아지 혈청 (FCS)이있는 페트리 접시에 넣으십시오.
참고 : 안락사는 추가 케타민 / 자일라진 (80 mg / kg : 8 mg / kg)의 복강 내 주사에 의해 마우스에서 유도되며, 자궁 경부 탈구와 흉강을 열어 폐를 붕괴시킵니다. 이 방법은 동물에게 최소한의 통증과 불편 함을 제공합니다. 이 방법은 미국 수의학 협회 안락사 패널의 권고와 일치합니다. - 서리가 내린 유리 슬라이드를 사용하여 세포를 풀어주고 50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다. 부피를 최대 50 mL로 가져오고 벤치탑 냉장 원심분리기를 사용하여 335 x g 에서 원심분리하여 PBS/2% FCS로 세척한다. 상청액을 붓고이 단계를 반복하십시오.
- 1 분 동안 ACK 용해 완충액 1 mL를 사용하여 적혈구를 제거하고 PBS / 2 % FCS로 최대 50 mL의 부피를 가져옵니다. 335 x g 에서 원심분리하고 상층액을 붓는다.
- 셀 수를 계산합니다. 제조업체의 지침에 따라 어둠 속에서 얼음 위에서 30 분 동안 CFSE로 세포에 라벨을 붙입니다. 단일 세포 현탁액을 PBS/2% FCS 중의 웰당 3x10 6 세포/mL의6 웰 플레이트 내로 현탁시킨다.
- 표지된 세포를 CYP2E1, JHDN5 또는 TFA-OVA(10 μg/mL)로 5% CO2, 95% 공기(가습)에서 37°C에서72시간 동안 자극하십시오. 배양 후, 세포를 얼음 상에서 30분 동안 CD4-APC(1:100)로 염색하고 3일 이내에 유세포 분석기로 분석하였다.
- CD4+CFSE+ 세포를 확인하기 위해 다음의 게이팅 전략을 활용하십시오: CD4+CFSE+ 세포는 게이팅된 살아있는 세포로부터 확인되고 증식하는 세포의 히스토그램으로 표시됩니다.
- 복강 내 주사를 통해 4-6 mg / kg 자일라진과 혼합 된 40-60 mg / kg 케타민으로 마우스를 진정시킨 후 1.1.1 단계에서 설명한 바와 같이 마취의 적절한 깊이를 확인한 다음 미세 외과 가위를 사용하여 복강 내 노출 후 비장을 확인하십시오. 페디클에서 비장을 자르고 PBS / 2 % 태아 송아지 혈청 (FCS)이있는 페트리 접시에 넣으십시오.
- 면역화된 마우스로부터 침윤하는 면역 세포의 분리.
- 14 일째 또는 21 일째에 간에서 침윤 된 면역 세포를 분리하려면 4-6 mg / kg 자일라진과 혼합 된 40-60 mg / kg 케타민을 복강 주사하여 마우스를 마취시키고 1.1.1 단계에 설명 된대로 마취의 적절한 깊이를 확인하십시오. 개복술 후 1.1.2에 기재된 바와 같이 미세 외과 가위로 만든 중간 선 절개를 사용하여, 25 게이지 바늘로 문맥 정맥을 캐뉼레이트한 다음 신장 정맥 아래의 열등한 정맥 카바를 절단한다.
- 37°C 수조에서 PBS 40mL와 함께 10mL/min의 유속으로 각 간을 관류시킨다. 관류 후, 마이크로 외과 용 가위를 사용하여 간 페디클에서 간을 자르고 담즙 방광을 제거한 다음 hilum에서 간을 자릅니다.
- 20 mL 멸균 주사기 페슬 및 차가운 PBS를 사용하여 메쉬 스테인레스 스틸 체에서 간을 파괴하십시오. 생성된 세포 현탁액을 300 메쉬 스크린을 사용하여 미리 멸균된 원심분리 튜브 50 mL로 여과한다. 차가운 PBS를 사용하여 각 현탁액을 50 mL로 가져온 다음, 370 x g에서 10분 동안 원심분리하여 현탁액을 세척하였다.
- 상층액을 버리고 새로운 50mL 튜브로 처리하여 각 펠렛을 풀링합니다 (마우스 당 하나의 튜브가 권장되지만 샘플을 풀링하는 경우 2-4 펠릿 / 튜브가 권장됩니다). 풀링된 펠렛을 45 mL Percoll 35% (PBS 중) 및 100 IU/mL 헤파린에 현탁시킨다.
- 각 튜브를 20°C에서 10분 동안 500 x g로 회전시킨다. 상청액을 버리고 펠렛을 5 mL의 PBS에 현탁시킨 다음, ACK 용해 완충액 1 mL를 얼음 상에서 10분 동안 각 펠렛에 첨가한다.
- 각 튜브를 PBS로 50 mL로 가져오고 370 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 버리고 세포를 PBS/2% FCS로 세척한 후 370 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척한다. 셀 수를 계산합니다.
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유세포 분석기를 이용한 세포 유형 분석
참고: 다음은 Foxp3+Tregs가 어떻게 유도되는지를 보여주는 예입니다.- 1x106 세포를 FcR 차단 시약으로 인큐베이션하고, 얼음 상에서 30분 동안 CD4-FITC, CD25-PE 및 CD45-PerCP의 1:100 희석물로 염색한다. 다음으로, 세포를 FoxP3-APC로 세포내 염색한다.
- 세포를 250 μL의 고정 완충액 ( 표 물질 참조)으로 고정하고, 3일 이내에 유세포 분석기로 분석될 때까지 4°C에서 보관한다.
- 유세포 분석기를 사용하여 간, 비장 또는 림프절의 단일 세포 현탁액에서 유도 Foxp3 + Tregs를 검출하기 위해 다음 게이팅 전략이 권장됩니다 : 라이브 / 데드 픽서블 아쿠아 데드 셀 염색 키트를 사용하여 살아있는 세포를 식별하십시오. 다음에, CD45+ 게이트로부터의 CD45+ (PerCP, 클론 RA3-6B2) 및 게이트 CD4+ 세포 (FITC, cloneGK1.5)인 간 세포 상에 게이트한다. CD4+ 세포로부터, CD25+(PE, 클론 7D4) 및 FoxP3+(APC, 클론 3G3) 세포의 백분율을 동정한다.
- 간염에 대한 간 조직의 조직학적 분석
- 21일째에, 간 절편(두께 5μm)을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고 헤마톡실린 &에오신으로 염색한다.
- 저전력(40X)에서 조직학 점수를 평균 2뷰로 먼저 결정하고 64X에서 확인합니다. 조직 절편을 다음과 같이 점수화하십시오 : 등급 0 = 염증 또는 괴사 없음; 등급 1 = 괴사가없는 경미한 소엽 염증; 등급 2 = 절편의 <50 %를 포함하는 소엽 염증; 등급 3 = 섹션의 50 %≥ 포함하는 소엽 염증; 및 4 학년 = 괴사가있는 염증.
- 비장과 간에서 조직 사이토 카인 수준의 결정.
- 14일째 또는 21일째에, 배지 설정에서 일반 실험실 균질기를 사용하여 매끄럽게 될 때까지 RPMI/2% FCS 1 mL에 각 마우스로부터의 간 또는 비장 샘플(1 g)을 균질화한다. 샘플을 얼음 위에 차갑게 유지하십시오.
- 균질액을 냉장 데스크탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 1455 x g에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 스냅 동결시키고 사용 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관한다. 사이토카인 및 케모카인 수준은 키트 지침에 따라 상업용 ELISA 키트로 측정할 수 있습니다. 세포 수준 (mL 또는 μL)을 조직의 pg / g로 변환하여 사이토 카인의 수준을 표준화하십시오.
- CYP2E1, CYP2E1 에피토프 JHDN5 및 TFA 약물 대사산물에 대한 혈청 항체의 검출.
- 14 일 또는 21 일에 4-6 mg / kg 크실라진과 혼합 된 40-60 mg / kg 케타민으로 마우스를 진정시킵니다. 오른쪽 반사의 상실과 palpebral 반사의 손실 이외에 발가락 꼬집음 (금단 반사)과 같은 고통스러운 자극에 대한 반응이없는 근육 톤의 감소와 고통스러운 자극에 대한 반응을 관찰하여 마취의 적절한 깊이를 확인하십시오. 투베르쿨린 주사기에 부착 된 25G 바늘을 활용하고 바늘을 갈비뼈 아래의 흉강으로 천천히 전진시키고 xiphoid 과정에 즉시 옆으로 이동하여 심장에 접근하십시오. 심장 내 천자를 사용하여 혈액을 수집하십시오.
- 일단 혈액이 수집되면 실온에서 응고되도록하십시오. 혈액 샘플을 실온에서 20분 동안 295 x g 에서 원심분리한다. 조심스럽게 혈청을 제거하고, 혈청을 분취하고, -20°C에서 스냅 동결시킨다.
- 100 μL의 CYP2E1, JHDN5 또는 TFA-ovalbumin (OVA) 시험 항원 (PBS 중 5 μg/mL)을 96 웰 플레이트에 하룻밤 동안 4°C에서 18시간 이상 동안 도포한다. 다음날 플레이트를 세척 완충액 (PBS / 2 % FCS)으로 씻고 2 사이클 (각각 4 회 세척)하십시오.
- 100 μL의 마우스 혈청 (1:100)을 PBS/2% FCS에 플레이트 상에 3배로 도포하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 2시간 후, 단계 2.6.2에 기재된 바와 같이 플레이트를 세척 완충액으로 세척한다.
- 100 μL의 알칼리성 포스파타제 (AKP)-염소 항-마우스 IgG, AKP-래트 항-마우스 IgG1, 또는 AKP-래트 항-마우스 IgG2a 이차 항체 (1:1000)를 2시간 동안 첨가하고, 세척 완충액으로 1 사이클 및 PBS로 1 사이클의 세척 단계를 수행하였다. AKP 기질 키트를 사용하여 항체를 검출하고 분광 광도계로 15분마다 OD 405nm에서 측정합니다. TFA는 보통 15분 안에 완전히 발달하는 반면, CYP2E1 및 CYP2E1 에피토프는 30분에서 60분까지7분 안에 발달할 수 있다.
- 시험관내에서 JHDN5 IgG 유도 산화 스트레스의 발달에 관한 연구.
- 12개의 웰 플레이트를 사용하여, CYP2E1 활성을 최대화하기 위해 권장되는 바와 같이 37°C, 5%CO2, 95% 습도에서 글루타민 및 일반 보충제가 보충된 윌리엄스 E 배지 1000 μL의 피브로넥틴 커버 슬립 상에서 웰당 10개의 최종 분화된 간 세포를 7일 동안 배양한다(표 참조).
- JHDN5 IgG (1:40) 또는 마우스 IgG (1:1000)를 첨가하여 웰을 분리하고 37°C, 5% CO2, 95% 습도에서2시간 동안 인큐베이션한다. 하이브리도마 혈청은 매우 희석되었다. 진한 적색 형광 항체 검출기 ( 물질 표 참조)를 모든 웰에 추가로 30분 동안 첨가한다.
- 웰을 어둠 속에서 PBS 1 mL로 3x 세척한다. 세포를 10분 동안 3.7% 포름알데히드에 고정시킨다. 24 시간 이내에 공초점 현미경으로 검사하십시오.
- 시험관 내에서 미토콘드리아와 같은 세포 내 소기관을 가진 JHDN5 IgG의 공동 국소화 연구.
- JHDN5 IgG와 미토콘드리아의 공동-국소화를 입증하기 위해, 단계 2.7에 기술된 바와 같이 염료-프리 윌리엄스의 배지 E에서 7일 동안 피브로넥틴-커버 커버 슬립 상에서 말단 분화된 간 세포를 희소하게 배양(∼30% 합류)하였다.
- 정확한 흡수 파장을 결정한 후, 녹색 형광, 488 nm-접합된 마우스 IgG 또는 JHDN-5 (1:100) 및 적색 형광, 594-공액 미토-트래커 레드 (1:100)를 2 h (37°C), 5%CO2, 95% 습도 동안 첨가한다.
- DAPI로 안티페이드 시약으로 표지된 피브로넥틴-커버 슬립을 마운트하고, 공초점 현미경으로 검사한다.
3. 일반 프로토콜 노트
- 임상 사용 제형에서 화합물을 사용할 수 없는 경우 비제약 등급 도구를 활용하십시오. 그러나이 방법에서 확인 된 신뢰할 수있는 상업 공급 업체로부터 이러한 각 도구를 얻으십시오. 항상 적어도 시약 등급 수준의 미국 화학 학회 분석 시약위원회가 정의한 사양을 준수하는 화학 물질을 사용하십시오. 우리의 방법을 위해, 가능할 때마다 분석 등급 수준 시약을 활용하십시오.
- 동물 복지 또는 데이터 해석에 악영향을 미칠 수 있는 오염을 방지하기 위해 TFA 변형 단백질의 제형에 대한 엄격한 무균 기술을 따르십시오.
- 사용 가능한 기술 정보에 따라 제형이 유력을 유지할 기간에 비 제약 등급 제형을 저장하고 사용하십시오. CFA를 실온에서 저장하고, CYP2E1 및 그의 에피토프를 -20 또는 -80°C에서 저장한다. TFA 변형된 단백질을 -80°C에서 저장하고, CFA로 유화하기 전에 4°C로 오도록 하였다. TFA 변경된 단백질을 -80°C에서 저장하고 반복적인 동결-해동 사이클을 방지하기 위해 분취량으로 저장한다.
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Representative Results
도 1에 도시된 DIH를 유도하기 위해 활용된 면역화 스케쥴은 목의 기저부(제0일제)와 꼬리의 기저부(제7일제)에서 요구되는 두 개의 면역화를 나타낸다. 도 2는 마취제의 CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 에피토프 및 트리플루오로아세틸(TFA) 대사산물에 반응하여 CFSE를 사용하여 14일째에 수득된 대표적인 증식 데이터를 보여준다. 도 3은 14일째에 수득된 유도된 CD4+CD25+FoxP3+ Tregs의 게이팅 전략 및 대표적인 유세포 분석 분석을 보여준다. 도 4는 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 슬라이드를 나타내며 21일째 6일째에 간염의 진화를 입증한다. 도 5는 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 슬라이드가 이들 간10에서 비교 세포 함량 이외에 21일째 수컷과 비교했을 때 암컷 BALB/c 마우스에서 더 심한 간염을 입증하는 것을 보여준다. 도 6은 마우스 IgG와 미토콘드리아의 공동-국소화의 부재를 입증하는 대표적인 공초점 현미경 슬라이드를 보여준다. 도 7은 JHDN5 IgG와 미토콘드리아의 공동-국소화를 입증하는 대표적인 공초점 현미경을 보여준다.
도 1: 간염을 유발하는 마우스의 면역화. DIH는 암컷 BALB/c 마우스(예로서)에서 완전한 프로인트 보조제(CFA)에서 유화된 TFA-JHDN5(100 μg)를 목 기저부의 피하(s.c.) 및 0일째에 뒷다리에서 근육내(즉)로 백일해 독소 50ng으로 면역화함으로써 유도될 수 있다(단계 1). 7일째에, BALB/c 마우스는 꼬리의 배에서 CFA(s.c.)로 유화된 TFA-JHDN5(100μg)로 면역화될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 유세포 분석기를 사용하여 전체 자가단백질, 자가단백질의 에피토프 또는 TFA 합텐에 대한 CD4+ T 세포 면역 반응의 결정. 초기 면역화 후 14일째에 단리된 6 – 8주령의 BALB/c 마우스로부터의 비장세포의 단일 세포 현탁액을 CFSE로 표지하고, TFA-OVA, CYP2E1 또는 JHDN5 (10 μg/mL)로 자극하여 5% CO2, 95% 공기 (가습)에서 37°C에서72시간 동안 자극하고, CD4-APC로 염색하고, 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 항원(media)이 없는 웰을 대조군으로 사용하였다. BALB/c 마우스는 배지와 비교했을 때 JHDN5가 아닌 OVA-TFA 및 CYP2E1에 반응하여 증식을 일으켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 2.3.7에 기재된 방법을 사용하여 CD4+CD25+FoxP3+ 유도 Tregs의 확인을 위한 게이팅 전략. 첫 번째 게이트는 살아있는 세포를 식별합니다. 면역 세포를 검출하기 위해, CD45+ 세포를 초기에 게이팅하였다. 다음에, CD4+ T 세포를 동정하고, 게이팅하고, 이어서 CD4+ T 세포 집단 내의 CD25+FoxP3+ 세포를 동정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 간염에 대한 간 조직의 조직학적 분석. CFA 면역화된 마우스(상부 패널)를 비히클 대조군으로 사용하였다. S100-면역화된 마우스(중간 패널)는 동일한 스케줄로 면역화된 후 평가하였다. 21일째에, 마우스를 안락사시키고, 간을 포르말린에 고정시켰다. 5 μm 두께의 절편을 만들고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 최소 간 염증 (청색 세포)은 CFA (상단) 및 S100 (중간) 예방 접종 및 TFA-S100으로 예방 접종 한 후 다량의 염증에 따라 입증됩니다. (H&E, 배율 64X). 이 그림은 권한6과 함께 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 암컷 BALB/c 마우스는 수컷 BALB/c 마우스와 비교했을 때 더 많은 DIH를 발달시킨다. (A) 암컷 마우스(n=8)는 TFA-S100/CFA 면역화 후 3주 후에 수컷(n=7/군)보다 유의하게 더 심한 간염을 앓았다. (B) 암컷과 수컷 마우스로부터의 대표적인 간 절편(H&E, 배율 64X). (C) 간 CD4+, CD8+, NK+ 및 NKT+ 세포의 수는 남성에서보다 암컷에서 유의하게 더 높았다. 평균 ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 이 그림은 권한10과 함께 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 마우스 IgG는 미토콘드리아와 공동-국소화하지 않는다. 녹색 형광 (488nm) 표지 된 마우스 IgG (1 : 100) (녹색) 이외에 적색 형광 (594) - 표지 된 Mitotracker Red (1 : 100)으로 염색 된 말단 분화 된 간 세포의 공초점 이미지. 녹색 형광 (488nm)-표지된 마우스 IgG는 미토트래커 레드 (63X 배율)와 공동-국소화되지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: JHDN5 IgG는 미토콘드리아와 공동-국소화한다. 녹색 형광 (488)-표지 된 JHDN-5 IgG (1 : 100) 이외에 적색 형광 (594) - 표지 된 Mitotracker Red (1 : 100)으로 염색 된 말단 분화 된 간 전구 세포의 공초점 이미지. 녹색 형광 (488nm) - 표지 된 JHDN-5 IgG는 Mito-tracker Red와 공동 국소화되며, 대표 이미지 (63X 배율)에서 노란색 색조로 입증됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 강점은 재현성에 있습니다. 따라서 제안 된 단계를 준수하는 것이 중요합니다. 면역원의 제형은 일부에 대한 장벽이 될 수 있고; 그러나 우리는 문서에 설명 된 에피토프를 사용하여 모델을 재현하여 간장의 S100 분획을 분리 할 필요가 없습니다. 추가적인 에피토프 또는 단백질이 변경되어 면역화 후 간염을 유발할 수 있을 가능성이 높습니다. 그러나 우리는 신뢰할 수있는 결과와 함께 사용한 단백질을 설명합니다. 몇몇 단백질은 할로겐화 마취제 노출시 트리플루오로아세틸화되는 것으로 입증되었다. 에피토프 확산으로 인해 가장 가능성이 높으며, 이들 단백질 중 일부는 또한 그들의 천연, 비트리플루오로아세틸화 상태에서 자가항체의 표적이 된다. 일례로서, 피루베이트 데하이드로게나제 복합체 (PDH-E2)의 E2 서브유닛은 TFA-부가물 내의 TFA-모이어티에 대한 구조적 유사성을 갖는 에피토프 (리포산 보철 그룹)를 운반한다. 할로탄 간염 환자에서 생성된 항체는 TFA-단백질 및 PDH-E2 20,21에 교차 반응성인 것으로 입증되었다.
우리의 DIH 모델은 마우스의 뒤쪽을 따라 CFA에서 유화되는 두 가지 예방 접종이 필요합니다. 우리는 CFA를 사용한 풋패드 주사가 마우스의 통증과 고통과 관련이 있다는 것을 알고 있습니다. 따라서 실험 DIH 모델의 개발에는 몇 가지 실험 시험이 포함되었습니다. CFA를 사용하여 하나의 면역화를 사용하여 모델을 평가했을 때, 두 번째 면역원과 함께 불완전한 프로인트의 보조제 (IFA) 또는 IFA를 사용하여 두 번째 면역화로 두 번째 면역화했을 때, 간 염증은 발생하지 않았다. 대조적으로, 우리가 CFA로 두 번의 면역화를 사용하여 면역원으로 마우스를 면역화했을 때, 상당한 간 염증이 존재하였다. 자가 면역 간염의 또 다른 모델에 대한 원래의 설명에는 우리와 유사한 연구가 포함되었으며 상당한 간 염증을 입증하기 위해 CFA로 두 번의 예방 접종이 필요했습니다 8. 그럼에도 불구하고, 우리는 CFA없이 염증을 최적화하려고 시도하기 위해 문헌 검색을 사용하여 보조제를 지속적으로 재평가합니다. 예로서, B 세포 반응을 증강시킬 수 있는 잘 알려진 아쥬번트 타이터맥스가 있다; 그러나 항체가 DIH의 구성 요소이지만, 우리와 다른 사람들은 모델14에서 T 세포 반응에 중요한 역할을 입증했습니다.
신뢰할 수있는 모델의 개발은 DIH의 병인에 대한 조사를 용이하게합니다. 우리는 간 조직학 및 면역 세포가이 모델의 다양한 단계에서 안정적으로 평가 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 DIH의 개발을 연구하는 데 활용 될 수있는 항원 특이적 T 세포, 혈청 항체 및 조직 사이토 카인의 확인을 입증합니다. 우리는 염증이있는 간에서 세포를 분리하는 방법을 시연하고 헤파린의 사용을 제안합니다. 그러나 우리는 헤파린없이이 기술을 수행했으며 결과는 구별 할 수 없었습니다. 추가적으로, 조직 파괴의 현재 방법은 또한 간에서 세포를 방출 할 수있다.
최근에는 차세대 시퀀싱 및 정량적 PCR과 같은 현대적인 도구를 활용하고 재현 가능한 결과를 경험했습니다. 우리는 ILLB/c 마우스를 대조군 마우스로 활용할 수 있도록 ILLB/c 배경에서 모두 파생된 IL-4, IL-4 수용체, IL-6, IL-6 수용체 IL-33 및 ST2 결핍 마우스를 사용한 DIH에 관한 결과를 발표했습니다. DIH의 이러한 모델의 향후 응용은 DIH의 병인에 대한 책임이 있는 이전에 인식되지 않았던 메카니즘을 밝히기 위해 CRISPR 기술의 활용 이외에 마우스에서 노크의 개발을 포함할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Njoku 박사는이 모델의 공식화를 초래 한 그의 지침과 통찰력있는 토론에 대해 Dr. Noel R. Rose, MD PhD를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J.
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V.
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
