Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İlaca bağlı otoimmün hepatit (DIH), otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en sık görülen hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Prevalansındaki bu cinsiyet farklılıklarının altında yatan mekanizmalar, insan hastalığını taklit eden hayvan modellerinin azlığı nedeniyle belirsizdir. Buna rağmen, altta yatan mekanizmaların insan lökosit antijen haplotipleri ve cinsiyet hormonları ile ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Buna karşılık, bir DIH fare modeli kullanarak, IL-4'ün bir sitokrom P450 2E1 epitopuna karşı yönlendirilmiş CD4 + T hücrelerini başlattığını, nötrofillerin, makrofajların ve mast hücrelerinin dişi BALB / c farelerinin karaciğerlerine akışını indüklediğini ortaya çıkardık. Bu modeli kullanarak, IL-33 ile indüklenen FoxP3 + düzenleyici T hücrelerinin dişi ve erkek farelerde DIH'ye karşı koruma sağladığını da gösterdik. Bu DIH modeli, farelerin DIH ile ilişkili bir ilaç metaboliti ile kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu ile aşılanması ile indüklenir. Bu epitop DIH'li hastalar tarafından tanınır. Yöntemimiz, DIH'nin patogenezini incelemek için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir hepatit ve otoantikorları indüklemektedir. İn vivo çalışmalar, yanlış yapıldığında farelerde aşırı ağrı ve sıkıntıya neden olabilirken, in vivo bir modelin avantajı, çok sayıda farede hastalığın patogenezini değerlendirme yeteneğidir. Ek olarak, değiştirilmiş karaciğer proteinlerinin biyolojik etkileri, invaziv prosedürler kullanılarak incelenebilir. Deneysel tasarıma in vitro çalışmaların eklenmesi, hücresel düzeyde hızlı tekrarlama ve mekanik analize izin verir. Bu nedenle, model protokolümüzü ve DIH'nin in vivo ve in vitro mekanizmalarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.
Giriş
Bu yöntemin amacı, in vivo gelişen ilaca bağlı otoimmün hepatitin fare modelini tanımlamak ve bu hastalığın moleküler, immünolojik ve genetik temelini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Çalışmalarımızın uzun vadeli amacı, duyarlı hastalarda DİH'yi inceleyerek kronik karaciğer inflamasyonu ve hasarının gelişiminden sorumlu mekanizmaları ortaya çıkarmaktır. Karaciğer hastalığı ve siroz, 25-64 yaş arası erişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı otoimmün hepatit (DIH) olarak adlandırılan idiosyncratic DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin üçüncü en yaygın nedenidir. DIH, otoimmün hepatit
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
1. Hepatik S-100 sitozolik proteinlerinin veya bir CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu
NOT: İlk olarak, trifloroasetillenmiş S100 (TFA-S100) ve trifloroasetillenmiş CYP2E1 epitopunu (TFA-JHDN5) hazırlayın. Çünkü bağışıklamalar için sinjenik S100 proteinlerine ihtiyaç vardır ve immünojeni üretmek için BALB / c fareleri gereklidir. Preparat büyük miktarda immünojen verir; Bu nedenle, bu bölümü yılda yaklaşık dört kez gerçekleştirmeyi bekleyin. TFA-JHDN5'i yapmak için aynı yöntem kullanılacaktır. CYP2E1 epitopu (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1'de gösterilen DIH'yi indüklemek için kullanılan bağışıklama programı, boynun tabanında (gün 0) ve kuyruğun tabanında (gün 7) gerekli olan iki bağışıklamayı temsil eder. Şekil 2, CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 epitopu ve anesteziklerin trifloroasetil (TFA) metabolitine yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edilen temsili proliferasyon verilerini göstermektedir. Şekil 3, 14. günde elde edilen indüklenmiş CD4 + CD25 + FoxP3 + Tr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün gücü, tekrarlanabilirliğine dayanır; Bu nedenle, önerilen adımlara uymak çok önemlidir. İmmünojenin formülasyonu bazıları için bir bariyer olabilir; Bununla birlikte, belgemizde açıklanan epitopu kullanarak modelimizi yeniden ürettik, bu da karaciğerin S100 fraksiyonunu izole etme ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Ek epitopların veya proteinlerin modifiye edilmesi ve bağışıklamaları takiben hepatiti indüklemesi muhtemeldir; ancak, kullandığımız proteinleri güvenilir sonuçlarla tanımlıyoruz. Halojenli anestezik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Dr. Njoku, bu modelin formülasyonuyla sonuçlanan rehberliği ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Noel R. Rose, MD PhD'ye teşekkür etmek istiyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0,1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrat Kiti | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c fareler | Jackson | ||
| CellTrace ™ CFSE Hücre Proliferasyon Kiti | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Bloke edici reaktif | Milteyi | 130-092-575 | |
| Genel ek | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG ve ticaret; hücreler dondurularak saklanmış | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Canlı/Ölü Sabitlenebilir Aqua Dead Cell leke kiti | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Kırlangıç Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Boğmaca Toksin Listesi | Biyolojikler | 180 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su pH 7.4 | Çeşitli | ||
| Pierce & Trade; Proteaz İnhibitörü Mini Tabletler, EDTA İçermeyen | ThermoFisher | 88666 | |
| Potasyum Hidroksit | JT Baker | 3140-01 | |
| S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer diyaliz kasetleri (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure ve ticaret; SDS Solüsyonu, %10 | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, fenol kırmızısı içermeyen | ThermoFisher | A1217601 |
Kaynaklar
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
