Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/59174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Summary

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Abstract

İlaca bağlı otoimmün hepatit (DIH), otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en sık görülen hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Prevalansındaki bu cinsiyet farklılıklarının altında yatan mekanizmalar, insan hastalığını taklit eden hayvan modellerinin azlığı nedeniyle belirsizdir. Buna rağmen, altta yatan mekanizmaların insan lökosit antijen haplotipleri ve cinsiyet hormonları ile ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Buna karşılık, bir DIH fare modeli kullanarak, IL-4'ün bir sitokrom P450 2E1 epitopuna karşı yönlendirilmiş CD4 + T hücrelerini başlattığını, nötrofillerin, makrofajların ve mast hücrelerinin dişi BALB / c farelerinin karaciğerlerine akışını indüklediğini ortaya çıkardık. Bu modeli kullanarak, IL-33 ile indüklenen FoxP3 + düzenleyici T hücrelerinin dişi ve erkek farelerde DIH'ye karşı koruma sağladığını da gösterdik. Bu DIH modeli, farelerin DIH ile ilişkili bir ilaç metaboliti ile kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu ile aşılanması ile indüklenir. Bu epitop DIH'li hastalar tarafından tanınır. Yöntemimiz, DIH'nin patogenezini incelemek için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir hepatit ve otoantikorları indüklemektedir. İn vivo çalışmalar, yanlış yapıldığında farelerde aşırı ağrı ve sıkıntıya neden olabilirken, in vivo bir modelin avantajı, çok sayıda farede hastalığın patogenezini değerlendirme yeteneğidir. Ek olarak, değiştirilmiş karaciğer proteinlerinin biyolojik etkileri, invaziv prosedürler kullanılarak incelenebilir. Deneysel tasarıma in vitro çalışmaların eklenmesi, hücresel düzeyde hızlı tekrarlama ve mekanik analize izin verir. Bu nedenle, model protokolümüzü ve DIH'nin in vivo ve in vitro mekanizmalarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.

Introduction

Bu yöntemin amacı, in vivo gelişen ilaca bağlı otoimmün hepatitin fare modelini tanımlamak ve bu hastalığın moleküler, immünolojik ve genetik temelini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Çalışmalarımızın uzun vadeli amacı, duyarlı hastalarda DİH'yi inceleyerek kronik karaciğer inflamasyonu ve hasarının gelişiminden sorumlu mekanizmaları ortaya çıkarmaktır. Karaciğer hastalığı ve siroz, 25-64 yaş arası erişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı otoimmün hepatit (DIH) olarak adlandırılan idiosyncratic DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin üçüncü en yaygın nedenidir. DIH, otoimmün hepatit1'li hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en yaygın hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadın 2,3,4'tür. İzofluran, sevofluran, desfluran veya halotan gibi halojenli uçucu anesteziklerin uygulanmasını takiben duyarlı bireylerde bir tür DIH gelişir. Bu anestezikler, metabolizmalarının reaktif ürünleri ile karaciğer proteinlerine kovalent olarak bağlanır, böylece alerjik veya otoimmün yanıtları ortaya çıkarabilen yeni otoantijenler oluşturur5.

Anestezik ve herhangi bir DIH formunun gelişiminde rol oynayan patojenik mekanizmaların incelenmesi, daha önce insan hastalığının indüksiyonunu yakından taklit eden bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Hastalarda immün aracılı DILI'ye benzeyen özelliklere sahip deneysel bir DIH murin modeli geliştirdik. Hepatit, sitokrom P450 2E1 (CYP2E1)5 enzimi tarafından anestezinin oksidatif metabolizmasını takiben oluşan trifloroasetil klorür (TFA) metaboliti tarafından kovalent olarak modifiye edilmiş iki otoantijenden biri ile immünizasyon ile indüklenir. Bir otoantijen, birkaç proteinin karışımı olan hepatik sitozolik S100 karaciğer fraksiyonudur6 ve ikinci otoantijen, anestezik immün aracılı DILI7'li hastalardan serumlar tarafından tanınan bir CYP2E1 epitopudur. Deneysel otoimmün hepatite nispeten dirençli olan BALB / c farelerini kullanarak, modelimizi C57Bl / 6J farelerde otoimmün hepatitin S100 kaynaklı immünizasyon modelinden ayırıyoruz8.

Çeşitli klinik prezentasyonları nedeniyle, DIH'nin hastalarda incelenmesi zordur. Translasyonel deneysel modeller, hastalığın patogenezini in vivo ve in vitro olarak değerlendirme olanağı sunmaktadır. Şu anda, DİH'yi indüklemek için, hayvan kullanmadan in vivo veya in vitro adaptif veya doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tam olarak inceleyen başka alternatif yöntemler yoktur. Dahası, S-100 veya CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu tahriş edici bir immünojen üretmediğinden ve TFA ile değiştirilmiş proteinlerle bağışıklama yoluyla DIH'yi indüklediğimizden, bu hayvanlara bağışıklama veya diğer prosedürlerden önce eter, herhangi bir halojenli anestezik, barbitürat veya alkol almayacaktır. Buna rağmen, keşfedilen CYP2E1 epitopu9'un bağlanma tercihlerini doğrulamak için bilgisayar simülasyonunu kullanarak fare kullanımımızı azalttık ve dişi BALB / c farelerinin daha şiddetli bir DIH10 geliştirdiğini göstererek kadın cinsiyetini içeren insan DIH'sini yansıttık.

Hastalarda DİH'nin çeşitli sunumlarına ve klinik hastalık çalışmalarındaki zorluklara rağmen, reaktif ilaç metabolitleri tarafından doğal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonu, halojenli anestezikleri takip eden patogenez DİH'de kabul edilen anahtar bir mekanizmadır11. Araştırmacılar ayrıca CYP2E1'in bu süreçte12,13 majör bir otoantijen olduğunu kabul etmektedir. Translasyonel olarak modifiye edilmiş bir CYP2E1 ve diğer karaciğer proteinlerini tanıyan interlökin (IL)-4-yukarı regüle CD4 + T hücrelerinin rolü, nötrofilleri, eozinofilleri ve mast hücrelerini karaciğer14'e çekerek anestezik DIH'nin kabul edilen bir başlatıcısıdır ve bu mekanizma DIH 15,16'nın birçok formunda doğrulanmıştır. İndüklenen FoxP3 eksprese eden CD4 + CD25 + T hücreleri (Tregs) DIH'nin şiddetini azaltır ve bu hücrelerin dalaktaki göreceli eksiklikleri DIH 10,7'yi kötüleştirir. Bu nedenle, DIH'yi anlamadaki ilerlemelerin çoğu, DIH'nin genetik, metabolik ve immünolojik mekanizmalarını hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için in vivo fare modellerinin kullanılmasıyla mümkün olmuştur.

Biz ve diğer araştırmacılar, farklı fare modelleri kullanarak DIH'nin başlatılmasında IL-4, nötrofiller ve eozinofiller için rolleri ortaya çıkardığımız için, bu gözlemin, kullanılan DIH modelinden bağımsız olarak, hepatit ve yaralanmanın IL-4 tarafından indüklendiği iddiamızı desteklediğine inanıyoruz. Protokolümüzün gücü, hem erkek hem de dişi fareler olmak üzere in vivo metodolojinin kullanılmasında ve histolojinin, CD4 + T hücre proliferasyon tahlillerinin ve sitokinlerin tekrarlanmasında yatmaktadır. İn vitro çalışmaları kullanmamızın gücü, DIH'yi yönlendiren hücresel etkileşimleri izole etmek için metodoloji sağlarken ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltmalarıdır. Erkek ve dişi farelerin kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, sonuçların yorumlanmasında bilinçsiz önyargı olasılığını azaltır ve DIH insidansı, prevalansı ve şiddeti kadınlarda daha yüksek olduğu için çalışmalarımızın çeviri potansiyelini güçlendirir17. Farelerin tek bir satıcıdan elde edilmesini öneririz; Bununla birlikte, bu mümkün değilse, genetiği değiştirilmiş farelerle aynı satıcıdan çöp eşi kontrolleri veya vahşi tip fareler edinin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.

1. Hepatik S-100 sitozolik proteinlerinin veya bir CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu

NOT: İlk olarak, trifloroasetillenmiş S100 (TFA-S100) ve trifloroasetillenmiş CYP2E1 epitopunu (TFA-JHDN5) hazırlayın. Çünkü bağışıklamalar için sinjenik S100 proteinlerine ihtiyaç vardır ve immünojeni üretmek için BALB / c fareleri gereklidir. Preparat büyük miktarda immünojen verir; Bu nedenle, bu bölümü yılda yaklaşık dört kez gerçekleştirmeyi bekleyin. TFA-JHDN5'i yapmak için aynı yöntem kullanılacaktır. CYP2E1 epitopu (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, sıralanabilir veya satın alınabilir.

  1. Karaciğerin S100 fraksiyonunun izolasyonu.
    1. 4 - 6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile 5-10 BALB / c farenin sedasyonunu takiben, kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın.
    2. Mikrocerrahi makas kullanarak, orta hat kesisi kullanarak karın içi içeriği açığa çıkarın ve kanı çıkarmak için inferior vena kavada küçük bir kesim yapın.
    3. Portal ven içine 24 gauge anjiyokateter yerleştirin ve karaciğeri 4 ° C'de bir su banyosunda 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile 10 mL / dak perfüze edin. Biriken karaciğerleri çıkarın ve tartın ve küçük parçalara (10 – 15 mm) kesin.
      NOT: Ötenazi, intraperitoneal ilave ketamin / ksilazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) enjeksiyonu, ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.
    4. Üreticilerin tavsiyelerine göre Komple Proteaz inhibitörü Kokteyl tabletleri ile desteklenmiş sakkaroz (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homojenizasyon tamponunun (pH 7.4) ağırlığının 4 katı ekleyin (bkz. 15 mL'lik bir polipropilen tüpte, genel bir laboratuvar doku homojenizatörü kullanarak, pürüzsüz olana kadar buz üzerinde orta hızda homojenize edin. Homojenizasyon sırasında dokunun ısınmasını önlemek için buz üzerinde homojenize edin.
    5. Karaciğeri 10 dakika boyunca 1500 x g'de homojenize eden santrifüj yapın ve ardından süpernatanı dökün. Süpernatantı 100.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj edin. Süpernatantı çıtçıtlayın ve -80 ° C'de saklayın. Süpernatant sitozolik S-100'dür.
  2. S100 ve JHDN5'in trifloroasetilasyonu
    NOT: S-100'ün lizin kalıntılarının ε-amino gruplarının trifloroasetilasyonu, Satoh18 prosedürüne göre gerçekleştirilecektir. Bu deneyin diyalizin son günleri hariç tüm bölümleri duman davlumbazında gerçekleştirilir.
    1. Bisinkoninik asit tahlili (BCA testi)7 kullanarak sitozolik S-100'ün toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. 20 mg BALB/c fare S100 veya JHDN5 ila 10 mL'yi 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde dH2O ile seyreltin. 1N KOH ile pH'ı 10'a ayarlayın.
    2. Çözeltiye 4.7 mmol S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA) ekleyin. KOH'u damlacık şeklinde yaklaşık 1 saat uygulayarak pH'ı 1N KOH ile 9.9 – 10.0 arasında tutun. Her reaksiyon için toplam KOH hacmini kaydedin.
    3. Çözeltileri ayrı diyaliz kasetlerine aktarın (Aşırı doldurmayın). Kasetleri günde üç değişiklikle 4 L dH 2 O'ya karşı72saat boyunca diyalize edin. Diyalizden sonra, TFA-S100 veya TFA-JHDN5'in son hacmini kaydedin ve ardından etiketli tüplere aliquot yapın. Dondurun ve –80 °C'de saklayın.
    4. Tahmini konsantrasyon, S100 veya JHDN5'in (mg cinsinden) başlangıç miktarının diyaliz sonrası son hacme (mL) bölünmesiyle belirlenir. Doğal protein19'un yüzde modifikasyonunu belirlemek için, her bir doğal ve TFA ile değiştirilmiş proteinin 1.0 mg'ını (son konsantrasyon 1.0 mg'dan büyükse) ayrı mermi tüplerinde dH 2 O ile 1.0 mL'yeseyreltin ve 1.0 mL dH2O kullanarak bir boşluk hazırlayın. TFA ile değiştirilmiş proteinin konsantrasyonu 1.0 mg'dan azsa, seyreltmeyin.
      1. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyularını ayırmak için, boş, doğal ve değiştirilmiş proteinlerden 50 μL ekleyin. Her bir oyuğa 50 μL% 4 NaHCO3 ve ardından 50 μL% 0.1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit ekleyin.
      2. Plakayı 2 saat boyunca 40 ° C'de inkübe edin. Kuluçkayı takiben, her bir kuyucuğa 50 μL% 10 SDS ekleyin ve ardından 25 μL 1N HCl ekleyin.
      3. 334 nm'lik OD'de okuyun ve daha sonra 334 nm'de absorbanstaki karakteristik düşüşü doğrulamak için her bir bileşiğin 200 – 600 nm arasındaki absorbansını kaydedin. Aşağıdaki formülü kullanarak lizin kalıntılarının TFA tarafından yüzde modifikasyonunu hesaplayın:
        Equation 1

2. Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması

NOT: DIH, BALB / c farelerinde, triflorasetil klorür (TFA), bir model ilaç-metabolit, TFA-S1006 veya TFA9, hepatit, otoreaktif T hücreleri ve CYP2E1 otoantikorlarını indükleyen TFA-JHDN5 tarafından kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu tarafından kovalent olarak değiştirilmiş karaciğer sitozolik proteinleri ile yapılan bağışıklamalarla modellenmiştir. Fareler, ilk immünizasyondan 2 hafta sonra dalak aktivasyon fazı ve granülositik inflamasyon ile karakterize 3 hafta boyunca hepatik bir faz sergiler. Dişi BALB / c fareleri bu modelde hepatite karşı erkeklerden daha hassastır.

  1. 0. günde, 6-8 haftalık BALB / c farelerini, boynun tabanında, eşit hacimlerde tam Freund adjuvanı (CFA) olarak emülsifiye edilmiş 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile deri altından bağışıklayın. 0. günde, fareleri arka ayaklardan birinde kas içinden 50 ng boğmaca toksini ile bağışıklayın. 7. günde, her farenin aynı immünojenin iki enjeksiyonunu almasını sağlamak için fareleri kuyruğun tabanında deri altından 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile eşit hacimlerde emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 ile bağışıklayın.
    NOT: Fareler, aşılamayı takip eden ilk 6 saat boyunca saatlik olarak ve daha sonra bir hafta boyunca günde en az iki kez izlenir. Fareler kambur duruş veya karıştırılmış kürk gibi ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, lokal ACUC'ye uygun olarak analjezikler uygulanmalıdır. Önemli ağrı veya sıkıntı kaydedilirse, ötanazi gerekli olup olmadığını belirlemek için fareler bir veteriner tarafından değerlendirilmelidir.
  2. Akış sitometrisi kullanılarak tüm öz-proteinlere, öz-proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine CD4 + T hücresi immün yanıtlarının belirlenmesi
    1. Farelerin intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sedasyonunu takiben, adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın ve ardından mikrocerrahi makas kullanarak karın içi boşluğu açığa çıkardıktan sonra dalağı tanımlayın. Dalağı pedikülde kesin ve PBS / % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Ötenazi, farelerde intraperitoneal ek ketamin / ksilazin enjeksiyonu (80 mg / kg: 8 mg / kg), ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenecektir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.
    2. Buzlu cam slaytlar kullanarak hücreleri serbest bırakın ve 50 mL'lik konik polipropilen tüpe aktarın. PBS/%2 FCS ile hacmi 50 mL'ye çıkararak ve tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak 335 x g'de santrifüj yaparak yıkayın. Süpernatantı dökün ve bu adımı tekrarlayın.
    3. 1 dakika boyunca 1 mL ACK Lysing arabelleği kullanarak kırmızı hücreleri çıkarın ve PBS/%2 FCS ile 50 mL'ye kadar ses getirin. 335 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı dökün.
    4. Hücreleri sayın. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca CFSE ile etiketleyin. Tek hücreli süspansiyonları, PBS / % 2 FCS'de kuyu başına 3x10 6 hücre / mL'lik6 kuyucuk plakasına askıya alın.
    5. Etiketli hücreleri CYP2E1, JHDN5 veya TFA-OVA (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 havada (nemlendirilmiş) uyarın. Kuluçkadan sonra, hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-APC (1:100) ile boyayın ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analiz edin.
    6. CD4 + CFSE + hücrelerini tanımlamak için aşağıdaki geçit stratejisini kullanın: CD4 + CFSE + hücreleri, kapılı canlı hücrelerden tanımlanacak ve çoğalan hücrelerin histogramları olarak görüntülenecektir.
  3. Bağışıklık sistemi hücrelerine sızan bağışıklık hücrelerinin immünize farelerden izolasyonu.
    1. 14. günde veya 21. günde karaciğerlere sızan bağışıklık hücrelerini izole etmek için, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile intraperitoneal enjeksiyonla anestezi yapın ve adım 1.1.1'de açıklandığı gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın. 1.1.2'de tarif edildiği gibi mikro cerrahi makasla yapılan bir orta hat insizyonu kullanılarak laparotomi yapıldıktan sonra, portal veni 25 gauge iğne ile kanüle edin ve daha sonra böbrek damarlarının altındaki inferior vena kavayı kesin.
    2. Her karaciğeri 37 °C'lik bir su banyosunda 40 mL PBS ile 10 mL / dak akış hızında perfüze edin. Perfüzyondan sonra, mikro cerrahi makas kullanarak, karaciğeri hepatik pedikülde kesin, safra kesesini çıkarın ve ardından karaciğeri hilumda kesin.
    3. 20 mL steril şırınga havanesi ve soğuk PBS kullanarak karaciğeri bir ağ paslanmaz çelik elek üzerinde bozun. Elde edilen hücre süspansiyonunu, 300 mesh elek kullanarak 50 mL önceden sterilize edilmiş santrifüj tüplerine filtreleyin. Soğuk PBS kullanarak her süspansiyonu 50 mL'ye getirin ve ardından süspansiyonu 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın.
    4. Süpernatantı atın ve daha sonra her peleti tedavi yoluyla yeni 50 mL tüplere havuzlayın (fare başına bir tüp önerilir; ancak, numuneler bir araya getirilirse, 2-4 pelet / tüp önerilir). Havuzlanmış peletleri 45 mL Percoll% 35 (PBS'de) ve 100 IU / mL heparin içinde askıya alın.
    5. Her tüpü 20 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 5 mL PBS'de askıya alın ve daha sonra buz üzerinde 10 dakika boyunca her pelete 1 mL ACK lizing tamponu ekleyin.
    6. Her tüpü PBS ile 50 mL'ye getirin ve 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatantı atın ve daha sonra hücreleri PBS / 2% FCS ile 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Hücreleri sayın.
    7. Akış sitometrisi kullanılarak hücre tipinin analizi
      NOT: İşte indüklenmiş Foxp3+Treg'lerin nasıl algılanabileceğine dair bir örnek.
      1. 1x106 hücreyi FcR bloke edici reaktif ile inkübe edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-FITC, CD25-PE ve CD45-PerCP'nin 1:100 seyreltilmesiyle lekeleyin. Daha sonra, hücreleri hücre içi olarak FoxP3-APC ile lekeleyin.
      2. Hücreleri 250 μL fiksasyon tamponu ile sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analize kadar 4 ° C'de saklayın.
      3. Akış sitometrisi kullanarak karaciğer, dalak veya lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlarda indüklenen Foxp3 + Treg'leri tespit etmek için aşağıdaki geçit stratejisi önerilir: Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre leke kitini kullanarak canlı hücreleri tanımlayın. Daha sonra, CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2) olan karaciğer hücrelerine kapı ve CD45 + kapısından kapı CD4 + hücreleri (FITC, klonGK1.5). CD4 + hücrelerinden, CD25 + (PE, klon 7D4) ve FoxP3 + (APC, klon 3G3) hücrelerinin yüzdelerini tanımlayın.
  4. Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi
    1. 21. günde, karaciğer bölümlerini (5 μm kalınlığında) % 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin ve Hematoksilin ve Eosin ile lekeleyin.
    2. Histoloji puanlarını önce düşük güçte (40X) ortalama 2 görüntülemede belirleyin ve 64X'te onaylayın. Doku bölümlerini aşağıdaki gibi puanlayın: Derece 0 = iltihap veya nekroz yok; Derece 1 = nekroz olmadan minör lobüler inflamasyon; Derece 2= kesitin %<50'sini tutan lobüler inflamasyon; Derece 3 = kesitin ≥% 50'sini içeren lobüler inflamasyon; ve Grade 4 = nekroz ile iltihaplanma.
  5. Dalak ve karaciğerlerde doku sitokin düzeylerinin belirlenmesi.
    1. 14. gün veya 21. günde, her fareden alınan karaciğer veya dalak örneklerini (1 g) 1 mL RPMI/%2 FCS içinde, orta ayarda genel bir laboratuvar homojenizatörü kullanılarak pürüzsüz hale getirilene kadar homojenize edin. Numuneyi buz üzerinde soğuk tutun.
    2. Soğutulmuş bir masaüstü santrifüj kullanarak homojenatı 4 °C'de 1455 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çırpın ve kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Sitokin ve kemokin seviyeleri, kit talimatlarına göre ticari ELISA kitleri ile ölçülebilir. Seviyeleri (mL veya μL cinsinden) dokunun pg / g'sine dönüştürerek sitokin seviyelerini standartlaştırın.
  6. CYP2E1, CYP2E1 epitopu JHDN5 ve TFA ilaç metabolitine karşı serum antikorlarının saptanması.
    1. 14 veya 21. günlerde, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sakinleştirin. Kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak, ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın. Bir tüberkülin şırıngasına bağlı 25 G'lik bir iğne kullanın ve iğneyi yavaşça kaburgaların altındaki göğüs boşluğuna ve hemen ksifoid sürece yanal olarak ilerlederek kalbe yaklaşın. İntrakardiyak ponksiyon kullanarak kan toplayın.
    2. Kan toplandıktan sonra, oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verin. Kan örneklerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 295 x g'de santrifüj yapın. Serumları dikkatlice çıkarın, serumları aliquot edin ve -20 ° C'de dondurun.
    3. 100 μL CYP2E1, JHDN5 veya TFA-ovalbümin (OVA) test antijenlerini (PBS'de 5 μg / mL) 96 kuyucuk plakasına gece boyunca 4 ° C'de en az 18 saat boyunca uygulayın. Ertesi gün, plakaları yıkama tamponu (PBS / % 2 FCS), 2 döngü (her biri 4 yıkama) ile yıkayın.
    4. PBS/%2 FCS'de 100 μL fare serumu (1:100) uygulayın ve plakalara üçlü olarak uygulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. 2 saat sonra, plakaları adım 2.6.2'de açıklandığı gibi yıkama tamponu ile yıkayın.
    5. 2 saat boyunca 100 μL Alkalen fosfataz (AKP)-keçi anti-fare IgG, AKP-sıçan anti-fare IgG1 veya AKP-sıçan anti-fare IgG2a sekonder antikorları (1:1000) ekleyin, ardından yıkama tamponu ile 1 döngü ve PBS ile 1 döngü yıkama adımı. Bir AKP substrat kiti kullanarak antikorları tespit edin ve bir spektrofotometre ile her 15 dakikada bir OD 405 nm'de ölçüm yapın. TFA genellikle 15 dakika içinde tamamen gelişirken, CYP2E1 ve CYP2E1 epitopu 30 ila 60 dakika7 arasında gelişebilir.
  7. JHDN5 IgG ile indüklenen oksidatif stresin in vitro gelişimi üzerine çalışmalar.
    1. 12 kuyucuk plakası kullanarak, CYP2E1 aktivitesini en üst düzeye çıkarmak için önerildiği gibi, 37 ° C'de, 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde glutamin ve genel takviye ile desteklenmiş 1000 μL Williams E ortamındaki fibronektin kaplı kapak kaymalarında kuyu başına 106 terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreyi inkübe edin.
    2. Kuyuları ayırmak ve 37 °C, %5 CO2, %95 nemde 2 saat kuluçkaya yatırmak için JHDN5 IgG (1:40) veya fare IgG (1:1000) ekleyin. Hibridoma serumları çok seyreltikti. Tüm kuyucuklara 30 dakika daha koyu kırmızı floresan antikor dedektörü ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. Kuyucukları karanlıkta 1 mL PBS ile 3 kat yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat içinde konfokal mikroskopi ile inceleyin.
  8. JHDN5 IgG'nin in vitro mitokondri gibi hücre içi organellerle birlikte lokalizasyon çalışmaları.
    1. JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu göstermek için, seyrek kültür (~% 30 birleşim), fibronektin kaplı kapak üzerindeki terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreler, adım 2.7'de açıklandığı gibi boyasız Williams'ın media E'sinde 7 gün boyunca kaymaktadır.
    2. Doğru absorpsiyon dalga boylarını belirledikten sonra, 2 saat (37 °C), %5 CO2, %95 nem için yeşil floresan, 488 nm konjuge fare IgG veya JHDN-5 (1:100) ve Kırmızı floresan, 594 konjuge Mito-tracker Kırmızı (1:100) ekleyin.
    3. Etiketli fibronektin kaplı kapak kaymalarını DAPI ile Anti-solma Reaktifi ile monte edin ve konfokal mikroskopi ile inceleyin.

3. Genel protokol notları

  1. Bileşikler klinik kullanım formülasyonunda mevcut olmadığında farmasötik olmayan sınıf araçları kullanın. Ancak, bu araçların her birini bu yöntemde tanımlanan güvenilir ticari tedarikçilerden edinin. Her zaman Amerikan Kimya Derneği Analitik Reaktifler Komitesi tarafından tanımlanan ve en azından reaktif sınıf seviyesine uygun kimyasallar kullanın. Yöntemlerimiz için, mümkün olduğunda analitik sınıf düzeyinde reaktifler kullanın.
  2. Hayvan refahını veya verilerin yorumlanmasını olumsuz yönde etkileyebilecek kontaminasyonu önlemek için TFA ile değiştirilmiş proteinlerin formülasyonu için katı aseptik tekniği izleyin.
  3. Farmasötik olmayan sınıf formülasyonları, mevcut teknik bilgilere göre, formülasyonun güçlü kalacağı sürelerde saklayın ve kullanın. CFA'yı oda sıcaklığında, CYP2E1 ve epitoplarını -20 veya -80 °C'de saklayın. TFA ile değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve CFA ile emülsifikasyondan önce 4 ° C'ye gelmesine izin verin. TFA değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için alikotlarda saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1'de gösterilen DIH'yi indüklemek için kullanılan bağışıklama programı, boynun tabanında (gün 0) ve kuyruğun tabanında (gün 7) gerekli olan iki bağışıklamayı temsil eder. Şekil 2, CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 epitopu ve anesteziklerin trifloroasetil (TFA) metabolitine yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edilen temsili proliferasyon verilerini göstermektedir. Şekil 3, 14. günde elde edilen indüklenmiş CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg'lerin geçit stratejisi ve temsili akış sitometri analizini göstermektedir. Şekil 4, 21. günde hepatitin evrimini gösteren temsili hematoksilin ve eozin boyalı slaytları göstermektedir. Şekil 5, bu karaciğerlerdeki karşılaştırmalı hücresel içeriğe ek olarak, 21. günde erkeklere kıyasla dişi BALB / c farelerinde daha şiddetli hepatit gösteren temsili hematoksilin ve eozin boyalı slaytları göstermektedir10. Şekil 6, fare IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunun olmadığını gösteren temsili konfokal mikroskopi slaytlarını göstermektedir. Şekil 7, JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu gösteren temsili konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması. DİH, dişi BALB/c farelerde (örnek olarak), 0. günde (Adım 1) arka bacakta deri altından (SC) tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilen TFA-JHDN5 (100 μg) ile bağışıklama ile indüklenebilir (Adım 1). 7. günde, BALB / c fareleri daha sonra kuyruğun baesinde CFA'da (s.c.) emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 (100μg) ile aşılanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CD4 + T hücresinin tüm öz proteinlere, öz proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine karşı immün yanıtlarının akış sitometrisi kullanılarak belirlenmesi. Dalinositlerin ilk bağışıklamadan sonraki 14. günde izole edilen, CFSE ile etiketlenmiş, TFA-OVA, CYP2E1 veya JHDN5 (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 hava (nemlendirilmiş), CD4-APC ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiş 6-8 haftalık BALB / c farelerden tek hücreli süspansiyonları. Kontrol olarak antijensiz (media) kuyular kullanıldı. BALB / c fareleri, medyaya kıyasla JHDN5'e değil, OVA-TFA ve CYP2E1'e yanıt olarak proliferasyon geliştirdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CD4+CD25+FoxP3+ kaynaklı Treg'lerin 2.3.7'de açıklanan yöntemi kullanarak tanımlanması için geçiş stratejisi. İlk kapı canlı hücreleri tanımlar. Bağışıklık hücrelerini tespit etmek için, CD45 + hücreleri başlangıçta kapılıydı. Daha sonra, CD4 + T hücreleri tanımlandı ve kapılandı, ardından CD4 + T hücre popülasyonu içindeki CD25 + FoxP3 + hücrelerinin tanımlanması izledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi. CFA bağışıklı fareler (üst panel) araç kontrolleri olarak kullanıldı. S100 bağışıklanmış fareler (orta panel) aynı programdaki bağışıklamaları takiben değerlendirildi. 21. günde, fareler ötenazi yapıldı ve karaciğer formalin ile sabitlendi. 5 μm kalınlığında kesitler hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanarak boyandı. CFA (üst) ve S100 (orta) bağışıklamalarını takiben minimal hepatik inflamasyon (mavi hücreler) ve TFA-S100 ile yapılan bağışıklamaları takiben büyük miktarda inflamasyon gösterilmiştir. (H&E, büyütme 64X). Bu şekilizin 6 ile kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Dişi BALB / c fareleri, erkek BALB / c farelere kıyasla daha fazla DIH geliştirir. (A) Dişi farelerde (n = 8), TFA-S100 / CFA aşılarından 3 hafta sonra erkeklerden (n = 7 / grup) anlamlı derecede daha şiddetli hepatit vardı. (B) Dişi ve erkek farelerden temsili karaciğer kesitleri (H&E, büyütme 64X). (C) Hepatik CD4+, CD8+, NK + ve NK + hücrelerinin sayısı kadınlarda erkeklerden anlamlı olarak daha yüksekti. Ortalama ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Bu şekil10 izinle kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Fare IgG, mitokondri ile birlikte lokalize olmaz. Kırmızı floresan (594) ile ek olarak yeşil floresan (488nm) etiketli fare IgG (1:100) (yeşil) ile boyanmış terminal olarak farklılaşmış hepatik hücrelerin konfokal görüntüsü - Mitotracker Red (1: 100) etiketli. Yeşil floresan (488nm) etiketli Fare IgG, Mitotracker Red (63X büyütme) ile birlikte lokalize olmaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: JHDN5 IgG, mitokondri ile birlikte lokalize olur. Yeşil floresan (488) ile boyanmış terminal olarak farklılaşmış hepatik progenitör hücrelerin konfokal görüntüsü - kırmızı floresana (594) ek olarak JHDN-5 IgG (1: 100) etiketli - Mitotracker Kırmızı (1: 100). Yeşil floresan (488nm) etiketli JHDN-5 IgG, temsili görüntüdeki sarı renk tonu (63X Büyütme) ile gösterilen Mito-tracker Red ile birlikte lokalize olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolün gücü, tekrarlanabilirliğine dayanır; Bu nedenle, önerilen adımlara uymak çok önemlidir. İmmünojenin formülasyonu bazıları için bir bariyer olabilir; Bununla birlikte, belgemizde açıklanan epitopu kullanarak modelimizi yeniden ürettik, bu da karaciğerin S100 fraksiyonunu izole etme ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Ek epitopların veya proteinlerin modifiye edilmesi ve bağışıklamaları takiben hepatiti indüklemesi muhtemeldir; ancak, kullandığımız proteinleri güvenilir sonuçlarla tanımlıyoruz. Halojenli anestezik maruziyet üzerine trifloroasetilat yapılan çeşitli proteinler gösterilmiştir. Büyük olasılıkla epitop yayılması nedeniyle, bu proteinlerin bazıları aynı zamanda yerli, trifloroasetillenmemiş durumlarında otoantikorların hedefidir. Örnek olarak, piruvat dehidrogenaz kompleksinin (PDH-E2) E2 alt birimi, TFA-addüktörlerindeki TFA-moiety ile yapısal benzerliği olan epitopları (lipoik asit protez grubu) taşır. Halotan hepatitli hastalarda üretilen antikorların TFA-proteinlerine ve PDH-E2 20,21'e çapraz reaktif olduğu gösterilmiştir.

DIH modelimiz, farelerin arkası boyunca CFA'da emülsifiye edilen iki bağışıklama gerektirir. CFA'lı ayak yastığı enjeksiyonlarının farede ağrı ve sıkıntı ile ilişkili olduğunu biliyoruz. Bu nedenle, deneysel DIH modelinin geliştirilmesi birkaç deneysel çalışmayı içeriyordu. Modeli CFA kullanarak bir bağışıklama kullanarak değerlendirdiğimizde, ikinci bağışıklama immünojenimizle her iki enjeksiyonda da eksik Freund adjuvanı (IFA) veya IFA kullanarak, hepatik inflamasyon gelişmedi. Keskin bir tezat olarak, CFA ile iki bağışıklama kullanarak fareleri immünojen ile bağışıkladığımızda, önemli hepatik inflamasyon mevcuttu. Başka bir otoimmün hepatit modelinin orijinal tanımı, bizimkine benzer çalışmaları içeriyordu ve önemli karaciğer iltihabını göstermek için CFA ile iki bağışıklamagerektiriyordu 8. Buna rağmen, CFA olmadan inflamasyonu optimize etmeye çalışmak için literatür taramalarını kullanarak adjuvanları sürekli olarak yeniden değerlendiriyoruz. Örnek olarak, B hücresi yanıtlarını artıracak iyi bilinen bir adjuvan Titer Max vardır; Bununla birlikte, antikorlar DIH'nin bir bileşeni olmasına rağmen, biz ve diğerleri model14'ümüzde T hücresi yanıtları için kritik bir rol oynadığımızı gösterdik.

Güvenilir modellerin geliştirilmesi, DIH'nin patogenezinin araştırılmasını kolaylaştırmaktadır. Bu modelde karaciğer histolojisi ve bağışıklık hücrelerinin çeşitli aşamalarda güvenilir bir şekilde değerlendirilebileceğini gösteriyoruz. DIH'nin gelişimini incelemek için kullanılabilecek antijene özgü T hücrelerinin, serum antikorlarının ve doku sitokinlerinin tanımlandığını gösteriyoruz. İltihaplı karaciğerden hücreleri izole etme yöntemlerini gösteriyoruz ve heparin kullanımını öneriyoruz. Ancak bu tekniği heparin olmadan uyguladık ve sonuçlar ayırt edilemezdi. Ek olarak, mevcut doku bozulma yöntemleri de karaciğerden hücreleri serbest bırakabilir.

Son zamanlarda, yeni nesil dizileme ve kantitatif PCR gibi modern araçları kullandık ve tekrarlanabilir sonuçlar elde ettik. IL-4, IL-4 reseptörü, IL-6, IL-6 reseptörü IL-33 ve ST2 eksikliği olan fareleri kullanarak DIH ile ilgili sonuçları yayınladık, böylece BALB / c faresini kontrol faremiz olarak kullanabiliriz. Bu DIH modelinin gelecekteki uygulamaları, DIH'nin patogenezinden sorumlu daha önce tanınmayan mekanizmaları ortaya çıkarmak için CRISPR teknolojisinin kullanılmasına ek olarak farelerde vuruntu geliştirilmesini de içerecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Dr. Njoku, bu modelin formülasyonuyla sonuçlanan rehberliği ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Noel R. Rose, MD PhD'ye teşekkür etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ThermoFisher 28997
AKP Substrate Kit BioRad 172-1063
BALB/c mice Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher C34554
CFA H37Ra Becton Dickinson (Difco Bacto) 231131
FcR Blocking reagent Milteyi 130-092-575
General supplement ThermoFisher HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved ThermoFisher HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit  ThermoFisher L34965
NaHC03 Millipore Sigma S5761
Percoll® Millipore Sigma P1644-1L
Pertussis Toxin List Biologicals 180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free ThermoFisher 88666
Potassium Hydroxide JT Baker 3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) Millipore Sigma 177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) ThermoFisher 66810
UltraPure™ SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
Williams Media E, no phenol red ThermoFisher A1217601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 159 hepatit ilaca bağlı bağışıklık aracılı Otoimmünite sitokrom P450 2E otoantikor mitokondri oksidatif stres Foxp3+Tregs seks
Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Wu, T. Y., Cottagiri,… More

Thomas, D., Wu, T. Y., Cottagiri, M., Nyandjo, M., Njoku, D. B. Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms. J. Vis. Exp. (159), e59174, doi:10.3791/59174 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter