Summary
BALB/cマウスにおけるin vivo免疫型翻訳型肝炎モデルについて、本疾患に見られる性差を含む薬剤性自己免疫性肝炎の病態解明に利用することができる。このモデルが、in vivoおよびin vitro実験技術を使用して再現可能な分析をどのように実証するかを説明します。
Abstract
薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)は、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝性薬物誘発性過敏症プロセスである。DIH患者の圧倒的多数は女性です。有病率におけるこれらの性差の根底にあるメカニズムは、ヒトの疾患を模倣する動物モデルの不足のために不明である。それでも、根底にあるメカニズムは、ヒト白血球抗原ハプロタイプおよび性ホルモンと関連していると広く考えられている。対照的に、DIHマウスモデルを用いて、我々は、シトクロムP450 2E1のエピトープに対するIL-4開始CD4+ T細胞が、好中球、マクロファージおよび肥満細胞の雌BALB/cマウスの肝臓への流入を誘導することを明らかにした。このモデルを用いて、我々はまた、IL-33誘導性FoxP3+制御性T細胞が雌および雄マウスにおいてDIHに対する保護を付与することも示した。このDIHモデルは、DIHに関連する薬物代謝産物と共有結合で改変されたCYP2E1のエピトープでマウスを免疫することによって誘導される。このエピトープは、DIHを有する患者によって認識される。我々の方法は、DIHの病因を研究するために利用することができる堅牢で再現性のある肝炎および自己抗体を誘導する。インビボ研究は不適切に行われるとマウスに過度の痛みや苦痛を引き起こす可能性がありますが、インビボモデルの利点は、多数のマウスにおける疾患の病因を評価する能力です。さらに、改変された肝臓タンパク質の生物学的効果は、侵襲的手順を用いて研究することができる。実験計画にin vitro研究を追加することで、細胞レベルでの迅速な反復と機械解析が可能になります。したがって、我々は、我々のモデルプロトコルと、DIHのインビボおよびインビトロメカニズムを研究するためにそれをどのように利用することができるかを示す。
Introduction
この方法の目的は、生体内で発症する薬物誘発性自己免疫性肝炎のマウスモデルを記述し、この疾患の分子的、免疫学的および遺伝的基盤を調査するためにどのように利用できるかを実証することである。私たちの研究の長期的な目的は、感受性のある患者のDIHを研究することによって、慢性肝臓の炎症および傷害の発症に関与するメカニズムを明らかにすることです。肝疾患および肝硬変は、25〜64歳の成人における6番目に多い死因を構成する。薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)と呼ばれることもある特異なDILIは、米国における急性肝不全の3番目に一般的な原因である。DIHは、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝薬剤誘発性過感作プロセスである1。DIH患者の圧倒的多数は女性2,3,4である。DIHの一種は、イソフルラン、セボフルラン、デスフルランまたはハロタンなどのハロゲン化揮発性麻酔薬の投与後に感受性の高い個体に発症する。これらの麻酔薬は、代謝の反応性産物とともに肝臓タンパク質に共有結合し、アレルギー応答または自己免疫応答を惹起することができる新規自己抗原を創り出す5。
麻酔薬およびあらゆる形態のDIHの発達に関与する病原性メカニズムの研究は、ヒト疾患の誘発を密接に模倣する動物モデルの欠如によって以前に妨げられてきた。我々は、患者における免疫媒介性DILIに似た特徴を有するDIHの実験的マウスモデルを開発した。肝炎は、酵素シトクロムP450 2E1(CYP2E1)5による麻酔薬の酸化的代謝に続いて形成されるトリフルオロアセチルクロリド(TFA)代謝産物によって共有結合的に修飾された2つの自己抗原のうちの1つによる免疫によって誘導される。1つの自己抗原は、いくつかのタンパク質6の混合物である肝細胞質S100肝臓画分であり、第2の自己抗原は、麻酔免疫媒介性DILI7を有する患者からの血清によって認識されるCYP2E1のエピトープである。実験的自己免疫性肝炎に比較的耐性のあるBALB/cマウスを用いることで、C57Bl/6Jマウスの自己免疫性肝炎のS100誘導免疫モデルと我々のモデルを区別した8.
その多様な臨床プレゼンテーションのために、DIHは患者で研究することは困難です。翻訳実験モデルは、インビボおよびインビトロで疾患の病因を評価する能力を提供する。現在のところ、動物を使用せずにインビボまたはインビトロの適応免疫応答または自然免疫応答を完全に調べるDIHを誘導するための他の代替方法はありません。さらに、S-100またはCYP2E1エピトープのトリフルオロアセチル化は刺激性免疫原を産生するようには見えず、TFA改変タンパク質による免疫化によってDIHを誘導しているため、これらの動物は、免疫化または他の処置の前にエーテル、ハロゲン化麻酔薬、バルビツール酸またはアルコールを投与されない。それでも、我々は、発見したCYP2E1エピトープ9 の結合嗜好を確認するためにコンピュータシミュレーションを利用してマウスの使用を減らし、雌のBALB/cマウスがより重篤なDIH10を発症することを実証することによって、女性の性別に関与するヒトDIHを反映した。
患者におけるDIHの多様な提示および臨床疾患の研究における課題にもかかわらず、反応性薬物代謝産物による天然タンパク質の翻訳後修飾は、ハロゲン化麻酔薬に続く病因DIHにおいて受け入れられている重要なメカニズムである11。研究者らはまた、CYP2E1がこのプロセスにおける主要な自己抗原であることを認める12,13。翻訳後修飾CYP2E1および他の肝臓タンパク質を認識するインターロイキン(IL)-4-アップレギュレートCD4+T細胞の役割は、好中球、好酸球および肥満細胞を肝臓に引き込むことによって麻酔DIHの受け入れられた開始剤であり14、このメカニズムはDIH15,16の多くの形態で確認されている。誘導されたFoxP3発現CD4+CD25+T細胞(Tregs)はDIHの重症度を低下させ、脾臓におけるこれらの細胞の相対的欠損はDIHを悪化させる10,7。したがって、DIHの理解における進歩の大部分は、in vivoマウスモデルを利用して、in vivoおよびin vitroの両方でDIHの遺伝的、代謝的および免疫学的メカニズムを評価することによって可能になった。
我々と他の研究者は、異なるマウスモデルを用いたDIHの開始におけるIL-4、好中球、好酸球の役割を明らかにしたので、この観察は、利用されたDIHモデルにかかわらず、肝炎および傷害はIL-4によって誘発されるという我々の主張を支持すると信じている。私たちのプロトコルの強みは、雄と雌の両方のマウスのin vivo方法論の利用、および組織学、CD4+ T細胞増殖アッセイ、サイトカインの繰り返しにあります。インビトロ研究の強みは、DIHを駆動する細胞相互作用を単離するための方法論を提供しながら、必要なマウスの数を減らすことです。これは、DIHの発生率、有病率、および重症度が女性でより高いため、結果の解釈における無意識の偏りの可能性を低減し、研究の翻訳の可能性を強化するため、雄および雌マウスの使用をお勧めします17。マウスは単一のベンダーから入手することをお勧めします。ただし、これが不可能な場合は、遺伝子組み換えマウスと同じベンダーから同腹仔対照または野生型マウスを入手してください。
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Protocol
すべての手順は、動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 肝臓S-100細胞質ゾルタンパク質またはCYP2E1エピトープのトリフルオロアセチル化
注:まず、トリフルオロアセチル化S100(TFA-S100)およびトリフルオロアセチル化CYP2E1エピトープ(TFA-JHDN5)を調製する。同系S100タンパク質が免疫化に必要であり、BALB/cマウスが免疫原を産生するために必要であるためである。調製物は、大量の免疫原を生じる。したがって、この部分を年に4回程度実行する予定です。TFA-JHDN5 の作成には、同じ方法が使用されます。CYP2E1エピトープ(JHDN5)、GII/FNN/GPT/WKD/IRR/FSL/TTLは、配列決定または購入することができる。
- 肝臓のS100画分の単離。
- 40-60mg/kgのケタミンと4~6mg/kgキシラジンを混合した5~10匹のBALB/cマウスを鎮静した後、右心反射の喪失および眼瞼反射の喪失に加えて、筋緊張の低下およびつま先のピンチ(離脱反射)などの痛みを伴う刺激に対する応答がないことを観察することによって、適切な麻酔の深さを確認する。
- 顕微手術用はさみを使用して、正中線切開を用いて腹腔内内容物を露出させ、下大静脈に小さな切り込みを入れて血液を除去する。
- 門脈に24ゲージの血管カテーテルを置き、4°Cの水浴中で40mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4で肝臓10mL/分を灌流する。 プールされた肝臓を取り外して秤量し、それを小片(10〜15mm)に切断する。
注:安楽死は、追加のケタミン/キシラジン(80mg / kg:8mg / kg)の腹腔内注射、続いて子宮頸部脱臼および胸腔を開いて肺を崩壊させることによって誘発される。この方法は、動物に最小限の痛みと不快感を提供します。この方法は、米国獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。 - スクロース(250 mM)-TRIS(10 mM)-EDTA(1 mM)ホモジナイズバッファー(pH 7.4)の重量の4倍を加え、メーカーの推奨に従って完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤( 材料表を参照)を添加します。15mLポリプロピレンチューブ中で均質化し、一般的な実験室組織ホモジナイザーを用いて、氷上で中速で滑らかになるまで。均質化中に組織が暖かくなるのを防ぐために、氷上で均質化します。
- 肝臓ホモジネートを1500 x g で10分間遠心分離し、上清を流し出す。上清を100,000 x gで1時間遠心分離する。上清をスナップ凍結し、-80°Cで保存する。 上清は細胞質ゾルS-100である。
- S100およびJHDN5のトリフルオロアセチル化
注:S−100のリジン残基のε−アミノ基のトリフルオロアセチル化は、Satoh18の手順に従って行われる。透析の末日を除いて、この実験のすべての部分はヒュームフードで行われます。- 細胞質ゾルS-100の総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ(BCAアッセイ)7を用いて決定する。BALB/c マウス S100 または JHDN5 20 mg を dH2O で 10 mL に希釈し、50 mL 三角フラスコに入れます。1N KOHでpHを10に調整します。
- 4.7mmolのS-エチルトリフルオロチオ酢酸(S-ETFA)を溶液に加える。約1時間、液滴状にKOHを投与することにより、1N KOHでpHを9.9〜10.0に維持する。各反応のKOHの総体積を記録する。
- 溶液を別々の透析カセットに移す(過剰充填しないでください)。カセットを4LのdH2Oに対して72時間透析し、1日3回交換する。透析後、TFA-S100またはTFA-JHDN5の最終容量を記録し、標識されたチューブにアリコートします。スナップ凍結し、–80 °Cで保存します。
- 推定濃度は、S100またはJHDN5の初期量(mg単位)を透析後の最終容量(mL)で割ることによって決定される。天然タンパク質19の改変率を決定するために、各天然およびTFA改変タンパク質の1.0mg(最終濃度が1.0mgを超える場合)を別々の弾丸チューブ中でdH2Oと共に1.0mLに希釈し、1.0mLdH2Oを用いてブランクを調製する。TFA改変タンパク質の濃度が1.0mg未満の場合は、希釈しないでください
- 96ウェルプレートのウェルを分離するには、ブランクタンパク質、天然タンパク質、および改変タンパク質を50μL加えます。50 μL の 4% NaHCO 3 を、 続いて 50 μL の 0.1% 2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸を各ウェルに加えます。
- プレートを40°Cで2時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、50 μL の 10 % SDS を各ウェルに加え、続いて 25 μL の 1N HCl を加えます。
- 334nmのODで読み取り、334nmでの吸光度の特徴的な低下を確認するために、200〜600nmの各化合物の吸光度を記録します。TFAによるリジン残基の修飾パーセントを計算し、以下の式を用いて:
2. 肝炎を誘導するマウスの免疫
注:DIHは、トリフルオールアセチルクロリド(TFA)、モデル薬物代謝産物、TFA-S1006 、またはTFA9、肝炎を誘導するTFA-JHDN5、自己反応性T細胞、およびCYP2E1自己抗体によって共有結合的に変化したCYP2E1のエピトープによって共有結合的に変化した肝細胞質ゾルタンパク質による免疫化によって、BALB/cマウスにおいてモデル化される。マウスは、初期免疫の2週間後に脾臓活性化期を呈し、顆粒球性炎症を特徴とする3週間後には肝期を示す。このモデルでは、雌のBALB/cマウスは雄よりも肝炎の影響を受けやすい。
- 0日目に、6~8週齢のBALB/cマウスを首の付け根の皮下に、200μgのTFA-S100または100μgのTFA-JHDN5を等量の完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化させた状態で免疫する。0日目に、マウスを50ngの百日咳毒素で、後肢の1つに筋肉内に免疫する。7日目に、200μgのTFA-S100または100μgのTFA-JHDN5を等量のCFAに乳化させて、各マウスが同じ免疫原の注射を2回受けられるようにして、尾の基部でマウスを皮下免疫する。
注:マウスは、免疫後最初の6時間は1時間ごとに監視され、その後、少なくとも1日2回、1週間監視されます。マウスが、むしゃぶりついた姿勢や毛皮のフリルなど、痛みや苦痛の兆候を示す場合、鎮痛薬は局所ACUCに従って投与する必要があります。重大な痛みや苦痛が認められた場合は、獣医師によってマウスを評価して、安楽死が必要かどうかを判断する必要があります。 - フローサイトメトリーを用いた自己タンパク質全体、自己タンパク質のエピトープまたはTFAハプテンに対するCD4+ T細胞免疫応答の決定
- 腹腔内注射により40-60mg/kgケタミンと4-6mg/kgキシラジンを混合したマウスを鎮静した後、ステップ1.1.1に記載のように適切な麻酔深さを確認し、顕微手術用はさみを用いて腹腔内を露出させた後に脾臓を同定する。椎弓根で脾臓を切って、PBS / 2%ウシ胎児血清(FCS)を入れたペトリ皿に入れます。
注:安楽死は、追加のケタミン/キシラジン(80mg / kg:8mg / kg)の腹腔内注射、続いて子宮頸部脱臼および肺を崩壊させるために胸腔を開くことによってマウスにおいて誘発される。この方法は、動物に最小限の痛みと不快感を提供します。この方法は、米国獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。 - すりガラススライドを使用してセルを解放し、50mLの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。PBS/2% FCS で洗浄するには、容量を最大 50 mL にし、ベンチトップ冷蔵遠心分離機を使用して 335 x g で遠心分離します。上清を注ぎ、このステップを繰り返します。
- 1 mL の ACK ライシングバッファーを使用して赤血球を 1 分間除去し、PBS/2% FCS で最大 50 mL の容量にします。335 x g で遠心分離し、上清を流し出す。
- セルをカウントします。製造元の指示に従って、暗闇の中で氷上で30分間CFSEで細胞にラベルを付けます。単一細胞懸濁液を、PBS/2% FCS 中で 1 ウェルあたり 3x10 6 細胞/mL の6 ウェルプレートに懸濁します。
- 標識細胞をCYP2E1、JHDN5、またはTFA-OVA(10 μg/mL)のいずれかで、5%CO2、95%空気(加湿)中で37°Cで72時間刺激します。インキュベーション後、細胞をCD4-APC(1:100)で氷上で30分間染色し、3日以内にフローサイトメトリーで分析する。
- CD4+CFSE+細胞を同定するには、以下のゲーティング戦略を利用する:CD4+CFSE+細胞は、ゲーティングされた生きた細胞から同定され、増殖細胞のヒストグラムとして表示される。
- 腹腔内注射により40-60mg/kgケタミンと4-6mg/kgキシラジンを混合したマウスを鎮静した後、ステップ1.1.1に記載のように適切な麻酔深さを確認し、顕微手術用はさみを用いて腹腔内を露出させた後に脾臓を同定する。椎弓根で脾臓を切って、PBS / 2%ウシ胎児血清(FCS)を入れたペトリ皿に入れます。
- 免疫マウスからの浸潤免疫細胞の単離。
- 14日目または21日目に肝臓に浸潤した免疫細胞を単離するには、40〜60mg/kgのケタミンと4〜6mg/kgキシラジンを混合した腹腔内注射によりマウスを麻酔し、ステップ1.1.1で説明したように適切な麻酔の深さを確認する。1.1.2に記載されているようにマイクロ外科用はさみで作った正中線切開を用いて開腹後、門脈を25ゲージ針でカニューレを作り、腎静脈の下の下大静脈を切断する。
- 37°Cの水浴中で40mLのPBSで各肝臓を10mL/minの流速で灌流する。 灌流後、マイクロ外科用はさみを使用して、肝ペディクルで肝臓を切断し、胆嚢を除去し、次いでヒルムで肝臓を切断する。
- 20mLの滅菌シリンジ乳棒と冷たいPBSを使用して、メッシュのステンレススチールシーブで肝臓を破砕します。得られた細胞懸濁液を300メッシュスクリーンを用いて50mL予備滅菌遠沈管に濾過する。冷PBSを使用して各懸濁液を50mLにしてから、370 x gで10分間遠心分離して懸濁液を洗浄する。
- 上清を捨て、処理によって各ペレットを新しい50mLチューブにプールする(マウス1本につき1本のチューブを推奨するが、サンプルをプールする場合は2〜4本のペレット/チューブを推奨)。プールしたペレットを45mLパーコール35%(PBS中)および100IU/mLヘパリンに懸濁する。
- 各チューブを500 x gで20°Cで10分間回転させます。 上清を捨て、ペレットを5mLのPBSに懸濁し、次いで氷上で10分間、各ペレットに1mLのACK溶解バッファーを加える。
- 各チューブをPBSで50mLにし、370 x gで10分間遠心分離して洗浄します。上清を捨て、PBS/2% FCSで細胞を370 x gで10分間遠心分離して洗浄します。セルをカウントします。
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フローサイトメトリーによる細胞型の解析
注:誘導されたFoxp3 + Tregsを検出する方法の例を次に示します。- 1x106細胞をFcRブロッキング試薬と共にインキュベートし、氷上でCD4-FITCおよびCD25-PE、およびCD45-PerCPの1:100希釈液で30分間染色する。次に、細胞内をFoxP3-APCで染色する。
- 250 μLの固定バッファー( 材料表参照)で細胞を固定し、フローサイトメトリーによる分析まで3日以内に4°Cで保存した。
- フローサイトメトリーを使用して肝臓、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液中の誘導Foxp3 + Tregsを検出するために、以下のゲーティング戦略が推奨されます:生/死固定可能なアクア死細胞染色キットを使用して生細胞を同定する。次に、CD45+である肝細胞(PerCP、クローンRA3-6B2)にゲートし、CD45+ゲートからCD4+細胞(FITCの、クローンGK1.5)にゲートする。CD4+細胞から、CD25+(PE、クローン7D4)およびFoxP3+(APC、クローン3G3)細胞の割合を同定する。
- 肝炎に対する肝臓組織の組織学的解析
- 21日目に、肝臓切片(厚さ5μm)を10%中性緩衝ホルマリンに固定し、ヘマトキシリン&Eosinで染色する。
- 最初に2ビューの平均で低電力(40X)で組織学スコアを決定し、64Xで確認します。次のように組織切片をスコア付けする:グレード0=炎症または壊死なし;グレード1 =壊死のない軽度の小葉炎症;グレード2=セクションの<50%を含む小葉の炎症;グレード3=セクションの50%≥関与する小葉性炎症;グレード4 =壊死を伴う炎症。
- 脾臓および肝臓における組織サイトカインレベルの決定。
- 14日目または21日目に、培地設定時に一般的な実験室用ホモジナイザーを使用して、各マウスの肝臓または脾臓サンプル(1g)を1mLのRPMI/2% FCSで滑らかになるまでホモジナイズします。氷の上でサンプルを冷たく保ちます。
- ホモジネートを冷蔵卓上遠心分離機を用いて4°Cで1455 x gで15分間遠心分離する。上清をスナップ凍結し、使用準備ができるまで-80°Cで保存します。サイトカインおよびケモカインレベルは、キットの説明書に従って、市販のELISAキットで測定することができる。サイトカインのレベル(mLまたはμL単位)を組織のpg/gに変換することによって、サイトカインのレベルを標準化します。
- CYP2E1、CYP2E1エピトープJHDN5およびTFA薬物代謝産物に対する血清抗体の検出。
- 14日目または21日目に、40〜60mg / kgのケタミンと4〜6mg / kgのキシラジンを混合してマウスを鎮静させる。正しい反射の喪失および眼瞼反射の喪失に加えて、筋肉の緊張の低下およびつま先のピンチ(離脱反射)などの痛みを伴う刺激に対する反応がないことを観察することによって、麻酔の適切な深さを確認する。ツベルクリン注射器に取り付けられた25G針を利用し、針を肋骨の下の胸腔にゆっくりと進め、剣状突起の直後に横に進んで心臓に近づく。心臓内穿刺を使用して血液を採取する。
- 血液が採取されたら、室温で凝固させます。血液サンプルを295 x g で室温で20分間遠心分離します。血清を慎重に取り出し、血清をアリコートし、-20°Cでスナップフリーズする。
- 100 μL の CYP2E1、JHDN5、または TFA-オボアルブミン (OVA) 試験抗原 (PBS 中 5 μg/mL) を 96 ウェルプレートに 4 °C で一晩少なくとも 18 時間塗布します。翌日、プレートを洗浄バッファー(PBS/2%FCS)で2サイクル(各4回洗浄)洗浄します。
- 100 μL のマウス血清 (1:100) を PBS/2% FCS に 3 連でプレート上に塗布し、室温で 2 時間インキュベートします。2 時間後、ステップ 2.6.2 の説明に従って、洗浄バッファーでプレートを洗浄します。
- アルカリホスファターゼ(AKP)-ヤギ抗マウスIgG、AKP-ラット抗マウスIgG1、またはAKPラット抗マウスIgG2a二次抗体(1:1000)を100μLずつ2時間加えた後、洗浄バッファーで1サイクル、PBSで1サイクルの洗浄工程を行った。AKP基質キットを用いて抗体を検出し、分光光度計で15分毎にOD405nmで測定する。TFAは通常15分で完全に発達するが、CYP2E1およびCYP2E1エピトープは30〜60分7で発達し得る。
- インビトロでのJHDN5 IgG誘発酸化ストレスの発生に関する研究。
- 12ウェルプレートを用いて、CYP2E1活性を最大化するために推奨されるように、グルタミンおよび一般的なサプリメント(材料表を参照)を添加した1000μLのウィリアムズE培地(材料表を参照)中のフィブロネクチンで覆われたカバースリップ上で、1ウェルあたり106個の末端分化肝細胞を7日間インキュベートする。
- JHDN5 IgG(1:40)またはマウスIgG(1:1000)を加えてウェルを分離し、37°C、5%CO2、湿度95%で2時間インキュベートします。ハイブリドーマ血清は非常に希薄であった。深赤色蛍光抗体検出器( 材料表を参照)をすべてのウェルに追加30分間追加します。
- 暗闇の中で1mLのPBSでウェルを3倍に洗浄する。細胞を3.7%ホルムアルデヒドで10分間固定します。24時間以内に共焦点顕微鏡で調べてください。
- JHDN5 IgGとミトコンドリアなどの細胞内細胞小器官とのインビトロでの共局在研究。
- JHDN5 IgGとミトコンドリアとの共局在を実証するために、フィブロネクチンで覆われたカバースリップ上の末期分化肝細胞をまばらに培養(〜30%コンフルエント)し、ステップ2.7に記載されるように補充した色素フリーウィリアムズ培地E中で7日間行った。
- 正しい吸収波長を決定した後、緑色蛍光、488nm結合マウスIgGまたはJHDN-5(1:100)および赤色蛍光、594結合水トラッカーレッド(1:100)を2時間(37°C)、5%CO2、湿度95%で加える。
- 標識されたフィブロネクチンで覆われたカバースリップをDAPI付き退色防止試薬でマウントし、共焦点顕微鏡で調べた。
3. 一般的なプロトコルノート
- 化合物が臨床使用製剤で入手できない場合は、非医薬品グレードのツールを利用します。ただし、これらのツールのそれぞれは、この方法で特定された信頼できる商業サプライヤーから入手してください。米国化学会の分析試薬委員会が定める、少なくとも試薬グレードレベルの仕様に準拠した化学物質を必ず使用してください。当社の方法では、可能な限り分析グレードレベルの試薬を使用してください。
- 動物福祉やデータの解釈に悪影響を及ぼす可能性のある汚染を防ぐために、TFA改変タンパク質の製剤化のための厳格な無菌技術に従ってください。
- 非医薬品グレードの製剤は、入手可能な技術情報に従って、製剤が効力のあるままである期間に保管および使用してください。CFAを室温で、CYP2E1およびそのエピトープを-20または-80°Cで保存する。 TFA改変タンパク質を-80°Cで保存し、CFAによる乳化の前に4°Cに来るようにした。TFA変化タンパク質を-80°Cで保存し、凍結融解サイクルの繰り返しを防ぐためにアリコートで保存します。
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Representative Results
図1に示すDIHを誘導するために利用される免疫化スケジュールは、首の付け根(0日目)および尾の付け根(7日目)で必要とされる2つの免疫化を表す。図2は、麻酔薬のCYP2E1、JHDN5、CYP2E1エピトープおよびトリフルオロアセチル(TFA)代謝産物に応答してCFSEを使用して14日目に得られた代表的な増殖データを示す。図3は、14日目に得られた誘導CD4+CD25+FoxP3+Tregsのゲーティング戦略および代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図4は、代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色スライドを示し、6日目の21日目の肝炎の進化を実証する。図5は、これらの肝臓10における比較細胞含量に加えて、21日目に雄と比較した場合、雌BALB/cマウスにおいてより重篤な肝炎を示す代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色スライドを示す。図6は、マウスIgGとミトコンドリアとの共局在化の欠如を実証する代表的な共焦点顕微鏡スライドを示す。図7は、JHDN5 IgGとミトコンドリアとの共局在を実証する代表的な共焦点顕微鏡法を示す。
図1:肝炎を誘導するためのマウスの免疫化。 DIHは、雌のBALB/cマウス(一例として)において、完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化したTFA-JHDN5(100μg)を首の基部の皮下(s.c.)で免疫し、0日目に後肢に筋肉内(すなわち)に50ngの百日咳毒素を免疫することによって誘導することができる(ステップ1)。7日目に、BALB/cマウスを尾部のbaeでCFA(s.c.)に乳化したTFA-JHDN5(100μg)で免疫することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリーを用いた自己タンパク質全体、自己タンパク質のエピトープ、またはTFAハプテンに対するCD4+ T細胞免疫応答の決定。 初期免疫後14日目に単離した6~8週齢のBALB/cマウスの脾細胞の単一細胞懸濁液をCFSEで標識し、TFA-OVA、CYP2E1またはJHDN5(10μg/mL)で刺激し、5%CO2、95%空気中(加湿)、CD4-APCで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。抗原を含まないウェル(培地)をコントロールとして用いた。BALB/cマウスは、培地と比較した場合、JHDN5ではなくOVA-TFAおよびCYP2E1に応答して増殖を発症した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2.3.7に記載の方法を用いてCD4+CD25+FoxP3+誘導Tregsを同定するためのゲーティング戦略。最初のゲートは生細胞を識別します。免疫細胞を検出するために、CD45+細胞を最初にゲーティングした。次に、CD4+ T細胞を同定してゲーティングし、続いてCD4+ T細胞集団内のCD25+FoxP3+細胞を同定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:肝炎の肝臓組織の組織学的分析。 CFA免疫マウス(トップパネル)をビヒクルコントロールとして使用した。S100免疫マウス(中央パネル)は、同じスケジュールで以下の免疫化を評価した。21日目に、マウスを安楽死させ、肝臓をホルマリンで固定した。厚さ5μmの切片を作り、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色した。CFA(上)およびS100(中央)免疫およびTFA−S100による免疫化に続く大量の炎症に続いて、最小限の肝炎症(青色細胞)が実証される。(H&E、倍率64X)。この図は、許可6 で使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:雌のBALB/cマウスは、雄のBALB/cマウスと比較してより多くのDIHを発症する。 (A)雌マウス(n=8)は、TFA-S100/CFA免疫の3週間後に雄(n=7/群)よりも有意に重篤な肝炎を有していた。(b)雌および雄マウスからの代表的な肝臓切片(H&E、倍率64X)。(C) 肝CD4+、CD8+、NK+、およびNKT+細胞の数は、男性よりも女性の方が有意に高かった。SEM±平均 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.この図は、許可10 で使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウスIgGはミトコンドリアと共局在化しない。 赤色蛍光(594)標識マイトトラッカーレッド(1:100)に加えて、緑色蛍光(488nm)標識マウスIgG(1:100)(緑色)で染色された終末分化肝細胞の共焦点画像。緑色蛍光(488nm)標識されたマウスIgGは、マイトトラッカーレッド(倍率63倍)と共局在化しません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:JHDN5 IgGはミトコンドリアと共局在化する。 赤色蛍光(594)-標識ミトトラッカーレッド(1:100)に加えて、緑色蛍光(488)-標識JHDN-5 IgG(1:100)で染色された終末分化肝前駆細胞の共焦点画像。緑色蛍光(488nm)標識JHDN-5 IgGは、水戸トラッカーレッドと共局在し、代表画像上の黄色の色相(倍率63倍)によって実証される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの強みは、その再現性にあります。したがって、提案された手順に従うことが重要です。免疫原の製剤は、いくつかの障壁となり得る;しかし、我々は我々の文書に記載されているエピトープを使用してモデルを再現したので、肝臓のS100画分を単離する必要性は取り除かれた。追加のエピトープまたはタンパク質が改変され、免疫化後に肝炎を誘発する可能性がある。ただし、信頼できる結果で使用したタンパク質について説明します。いくつかのタンパク質は、ハロゲン化麻酔薬曝露時にトリフルオロアセチル化されることが実証されている。エピトープ拡散に起因する可能性が最も高いが、これらのタンパク質のいくつかは、それらの天然の非トリフルオロアセチル化状態における自己抗体の標的でもある。一例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDH-E2)のE2サブユニットは、TFA付加物中のTFA部分と構造的に類似したエピトープ(リポ酸補欠分子基)を運ぶ。ハロタン肝炎患者において産生された抗体は、TFAタンパク質およびPDH−E2に対して交差反応性であることが実証されている20,21。
私たちのDIHモデルでは、マウスの背中に沿ってCFAで乳化された2つの免疫が必要です。CFAによる足パッド注射は、マウスの痛みや苦痛と関連していることがわかっています。したがって、実験DIHモデルの開発には、いくつかの実験的試験が含まれていた。CFAを用いた1回の免疫を用いてモデルを評価し、我々の免疫原を用いた両方の注射において、不完全フロイントアジュバント(IFA)またはIFAを用いた2回目の免疫化では、肝炎症は発症しなかった。対照的に、CFAによる2回の免疫を用いてマウスを免疫原で免疫した場合、有意な肝炎症が存在した。自己免疫性肝炎の別のモデルの元の記述には、我々の研究と同様の研究が含まれ、有意な肝炎症を実証するためにCFAによる2回の免疫化が必要であった8。それでも、文献検索を使用してアジュバントを継続的に再評価し、CFAなしで炎症を最適化しようとしています。例として、B細胞応答を増強するであろう周知のアジュバントTiter Maxがある。しかし、抗体はDIHの構成要素であるが、我々と他の人々は、我々のモデル14においてT細胞応答に重要な役割を実証している。
信頼性の高いモデルの開発は、DIHの病因の調査を容易にする。我々は、肝臓組織学および免疫細胞が、このモデルの様々な段階で確実に評価できることを実証する。我々は、DIHの開発を研究するために利用できる抗原特異的T細胞、血清抗体および組織サイトカインの同定を実証する。我々は、炎症を起こした肝臓から細胞を単離する方法を実証し、ヘパリンの使用を提案する。しかし、我々はヘパリンなしでこの技術を行い、結果は区別がつかなかった。さらに、組織破壊の現在の方法もまた、肝臓から細胞を放出し得る。
最近では、次世代シーケンシングや定量PCRなどの最新のツールを活用し、再現性のある結果を達成しています。BALB/cをバックグラウンドで誘導したIL-4、IL-4受容体、IL-6、IL-6受容体IL-33、ST2遺伝子欠損マウスを用いたDIHに関する成果を発表し、BALB/cマウスをコントロールマウスとして利用できるようにしました。DIHのこのモデルの将来の応用には、DIHの病因の原因となるこれまで認識されていなかったメカニズムを明らかにするために、CRISPR技術の利用に加えて、マウスのノックインの開発が含まれる。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
Njoku博士は、このモデルの策定につながった彼の指導と洞察に満ちた議論について、MD博士のNoel R. Rose博士に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
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