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Immunology and Infection

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/59174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Summary

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Abstract

A hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é o processo de hipersensibilidade induzida por medicamentos hepáticos mais comum observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres. Os mecanismos subjacentes dessas diferenças sexuais na prevalência não são claros devido à escassez de modelos animais que imitam doenças humanas. Mesmo assim, acredita-se que os mecanismos subjacentes estejam amplamente associados a haplotipos de antígenos leucócitos humanos e hormônios sexuais. Em contraste, usando um modelo de rato DIH, descobrimos que as células CD4+ T iniciadas il-4 contra um epítope de citocromo P450 2E1 induz o fluxo de neutrófilos, macrófagos e células de mastro nos fígados de camundongos BALB/c fêmeas. Usando este modelo, também mostramos que as células T induzidas pelo IL-33+regulamente conferem proteção contra DIH em camundongos femininos e masculinos. Este modelo DIH é induzido pela imunização de camundongos com um epítope de CYP2E1 que foi alterado covalentemente com um metabólito de droga que tem sido associado com DIH. Este epítope é reconhecido por pacientes com DIH. Nosso método induz hepatites robustas e reprodutíveis e autoanticorpos que podem ser utilizados para estudar a patogênese do DIH. Enquanto estudos in vivo podem causar dor e angústia indevidas em camundongos quando feitos de forma inadequada, a vantagem de um modelo in vivo é a capacidade de avaliar a patogênese da doença em um grande número de camundongos. Além disso, os efeitos biológicos das proteínas hepáticas alteradas podem ser estudados por meio de procedimentos invasivos. A adição de estudos in vitro ao projeto experimental permite repetição rápida e análise mecanicista a nível celular. Assim, demonstraremos nosso protocolo de modelo e como ele pode ser utilizado para estudar mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

Introduction

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos. DIH é o processo de hipersensibilidade hepática mais comum, observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatiteautoimune 1. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres 2,3,4. Um tipo de DIH desenvolve-se em indivíduos suscetíveis após a administração de anestésicos voláteis halogenados, como isoflurano, sevoflurano, desflurano ou halotano. Esses anestésicos se ligam covalentemente a proteínas hepáticas com produtos reativos de seu metabolismo, criando assim novos autoantigens capazes de provocar respostas alérgicas ou autoimunes5.

O estudo de mecanismos patogênicos envolvidos no desenvolvimento de anestésicos e qualquer forma de DIH tem sido previamente dificultado pela falta de um modelo animal que imita de perto a indução da doença humana. Desenvolvemos um modelo experimental de murina de DIH com características semelhantes à DILI mediada imunológica em pacientes. A hepatite é induzida pela imunização com um dos dois autoantígenos que foram covalentemente modificados pelo metabólito de cloreto de trifluoroacetil (TFA) que é formado seguindo o metabolismo oxidativo do anestésico pelo citocromo enzimático P450 2E1 (CYP2E1)5. Um autoantígeno é a fração hepática cística cística hepótica S100, que é uma mistura de várias proteínas6, e o segundo autoantígeno é um epítope de CYP2E1 que é reconhecido por soro de pacientes com DILI7 anestésico imuno mediado. Ao usar camundongos BALB/c, que são relativamente resistentes à hepatite autoimune experimental, distinguemos nosso modelo do modelo de imunização induzido pelo S100 de hepatite autoimune em camundongos C57Bl/6J8.

Devido às suas diversas apresentações clínicas, o DIH é difícil de estudar em pacientes. Modelos experimentais translacionais oferecem a capacidade de avaliar a patogênese da doença in vivo e in vitro. Atualmente, não existem outros métodos alternativos para induzir DIH que examinem totalmente as respostas imunes in vivo ou in vitro adaptativas ou inatas sem o uso de animais. Além disso, como a trifluoroacetilação do S-100 ou do epítope CYP2E1 não parece produzir um imunogênio irritante, e estamos induzindo o DIH pela imunização com proteínas alteradas pelo TFA, esses animais não receberão éter, qualquer anestésico halogenado, barbiturado ou álcool antes da imunização ou outros procedimentos, considerando que esses agentes podem alterar os parâmetros que estamos estudando. Mesmo assim, diminuímos o uso do nosso mouse utilizando simulação de computador para confirmar as preferências vinculantes do nosso epítope CYP2E1descoberto 9 e espelhamos o DIH humano implicando sexo feminino, demonstrando que ratos BALB/c fêmeas desenvolvem um DIH10 mais severo.

Apesar das diversas apresentações de DIH em pacientes e desafios no estudo da doença clínica, a modificação pós-translacional de proteínas nativas por metabólitos reativas é um mecanismo-chave aceito na patogênese DIH que segue anestésicos halogenados11. Os investigadores também aceitam que o CYP2E1 é um grande autoantígeno neste processo12,13. O papel das células CD4+T regulamentadas (IL)-4-upregulated que reconhecem um CYP2E1 pós-translacionada e outras proteínas hepáticas é um iniciador aceito de DIH anestésico, atraindo neutrófilos, eosinófilos e células de mastro para o fígado14, e este mecanismo foi confirmado em muitas formas de DIH15,16. As células CD4+CD25+T (Tregs) induzidas a expressar o FoxP3 reduzem a gravidade do DIH, e deficiências relativas dessas células no baço pioram o DIH 10,7. Assim, a maioria dos avanços na compreensão do DIH têm sido possíveis utilizando modelos de camundongos in vivo para avaliar os mecanismos genéticos, metabólicos e imunológicos do DIH tanto in vivo quanto in vitro.

Como nós e outros investigadores descobrimos papéis para IL-4, neutrófilos e eosinófilos no início do DIH usando diferentes modelos de camundongos, acreditamos que esta observação suporta nossa alegação de que, independentemente do modelo DIH utilizado, hepatite e lesão são induzidas pelo IL-4. A força do nosso protocolo está na utilização da metodologia in vivo, tanto de camundongos masculinos quanto femininos, e na repetição da histologia, ensaios de proliferação de células T CD4+ e citocinas. A força do nosso uso de estudos in vitro é que eles reduzem o número de camundongos necessários, fornecendo a metodologia para isolar as interações celulares que impulsionam o DIH. Recomendamos o uso de camundongos masculinos e femininos, pois isso reduz a possibilidade de viés inconsciente na interpretação dos resultados e fortalece o potencial de tradução de nossos estudos, uma vez que a incidência, prevalência e gravidade do DIH é maior em mulheresde 17 anos. Recomendamos que os camundongos sejam obtidos de um único fornecedor; no entanto, se isso não for possível, obtenha controles de erva-mate ou camundongos do mesmo tipo de fornecedor que os camundongos geneticamente alterados.

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pela comissão de cuidados e uso de animais.

1. Trifluoroacetilação de proteínas citosocidas hepáticas S-100 ou um epítope CYP2E1

NOTA: Primeiro, prepare o trifluoroacetilado S100 (TFA-S100) e o epítope CYP2E1 trifluoroatilado (TFA-JHDN5). Como as proteínas S100 síndicas são necessárias para imunizações, e os camundongos BALB/c são necessários para produzir o imunogênio. A preparação produz uma grande quantidade de imunogênio; então, antecipar a realização desta porção cerca de quatro vezes por ano. Um método idêntico será usado para fazer o TFA-JHDN5. O epítope CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, pode ser sequenciado ou adquirido.

  1. Isolamento da fração S100 do fígado.
    1. Após a sedação de 5 – 10 camundongos BALB/c com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4 - 6 mg/kg de xilazina, confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de retirada), além da perda de reflexos de retardo e da perda de reflexos palpebrais.
    2. Usando uma tesoura microcirúrgica, exponha o conteúdo intra-abdominal usando uma incisão midline e faça um pequeno corte na veia cava inferior para remover o sangue.
    3. Coloque um angiocateter de 24 bitolas na veia portal e perfunde o fígado 10 mL/min com 40 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7.4 em um banho de água a 4 °C. Remova e pese os fígados agrupados e corte-os em pequenos pedaços (10 – 15 mm).
      NOTA: A eutanásia é induzida pela injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.
    4. Adicione 4 vezes o peso da sacarose (250 mM) -TRIS (10 mM)- Tampão de homogeneização EDTA (1 mM) (pH 7.4) complementado com comprimidos completos do inibidor de Protease (ver Tabela de Materiais) conforme recomendações dos fabricantes. Homogeneize-se em um tubo de polipropileno de 15 mL, utilizando um homogeneizador geral de tecido laboratorial em velocidade média no gelo até ficar homogêneo. Homogeneize-se no gelo para evitar que o tecido fique quente durante a homogeneização.
    5. Centrifugar o fígado homogeneiza a 1500 x g por 10 min e, em seguida, despeje o supernante. Centrifugar o supernante por 1 h a 100.000 x g. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C. O supernatante é o Csoúsico S-100.
  2. Trifluoroacetilação de S100 e JHDN5
    NOTA: A trifluoroacetilação dos grupos ε-amino de resíduos de liseina da S-100 será realizada de acordo com o procedimento de Satoh18. Todas as partes deste experimento, com exceção dos últimos dias de diálise, são realizadas no capô da fumaça.
    1. Determine a concentração proteica total do S-100 citosóico utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA)7. Diluir 20 mgs de rato BALB/c S100 ou JHDN5 a 10 mL com dH2O em um frasco de 70 mL Erlenmeyer. Ajuste o pH para 10 com 1N KOH.
    2. Adicione 4,7 mmole de S-ethyltrifluorothioacetato (S-ETFA), à solução. Mantenha o pH entre 9,9 e 10,0 com KOH 1N administrando KOH na moda gotícula por aproximadamente 1 h. Registo o volume total de KOH para cada reação.
    3. Transfira as soluções para fitas diálise separadas (Não enchimento demais). Dique as fitas por 72 h contra 4 L de dH2O com três mudanças por dia. Após a diálise, grave o volume final de TFA-S100 ou TFA-JHDN5 e, em seguida, aliquot em tubos rotulados. Encaixe o congelamento e armazene a -80 °C.
    4. Uma concentração estimada é determinada dividindo a quantidade inicial de S100 ou JHDN5 (em mg) pelo volume final após a diálise (mL). Para determinar a modificação percentual da proteína nativa19, diluir 1,0 mg de cada proteína nativa e alterada tfa (se a concentração final for superior a 1,0 mg) a 1,0 mL com dH2O em tubos de bala separados e preparar um branco usando 1,0 mL dH2O. Se a concentração da proteína alterada pelo TFA for inferior a 1,0 mg, não dilua
      1. Para separar os poços de uma placa de 96 poços, adicione 50 μL das proteínas em branco, nativas e alteradas. Adicione 50 μL de 4% NaHCO3 seguido por 50 μL de 0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno ácido sulfônico a cada poço.
      2. Incubar a placa a 40 °C por 2 h. Após a incubação, adicione 50 μL de 10 % SDS a cada poço seguido por 25 μL de 1N HCl.
      3. Leia em OD de 334 nm e, em seguida, registo absorvente de cada composto de 200 a 600 nm, a fim de confirmar a queda característica na absorvância a 334 nm. Calcule a modificação percentual dos resíduos de lise por TFA, utilizando a seguinte fórmula:
        Equation 1

2. Imunização de camundongos para induzir hepatite

NOTA: O DIH é modelado em camundongos BALB/c por meio de imunizações com proteínas citosóicas hepáticas que foram alteradas covalentemente por cloreto de trifluoracetil (TFA), um modelo de metabólito de drogas, TFA-S1006 ou um epítope de CYP2E1 covalentamente alterado por TFA9, TFA-JHDN5 que induz hepatite, células T autorativas e autoanticorpos CYP2E1. Os camundongos exibem uma fase de ativação esplênica 2 semanas após a imunização inicial e uma fase hepática por 3 semanas que é caracterizada por inflamação granulócítica. Camundongos BALB/c fêmeas são mais suscetíveis do que os machos à hepatite neste modelo.

  1. No dia 0, imunizar camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas subcutâneos na base do pescoço com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsificadas em volumes iguais de adjuvante completo de Freund (CFA). No dia 0, imunizar os camundongos com 50 ng de toxina de coqueluche, intramuscularmente em uma das patas traseiras. No dia 7, imunizar os camundongos subcutâneamente na base da cauda com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados em volumes iguais de CFA para garantir que cada rato receba duas injeções do mesmo imunogênio.
    NOTA: Os camundongos são monitorados de hora em hora durante as primeiras 6 horas após a imunização e, em seguida, pelo menos duas vezes por dia durante uma semana. Se os camundongos demonstrarem sinais de dor ou angústia, como postura curvada ou peles de babados, os analgésicos devem ser administrados de acordo com a ACUC local. Se for observado dor ou angústia significativas, os camundongos devem ser avaliados por um veterinário para determinar se a eutanásia é necessária.
  2. Determinação de respostas imunes de células T CD4+ a auto-proteínas inteiras, epítopos de auto-proteínas ou o hapten TFA usando citometria de fluxo
    1. Após a sedação de camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com xilazina de 4-6 mg/kg via injeção intraperitoneal, confirme a profundidade adequada da anestesia conforme descrito na etapa 1.1.1 e depois identifique o baço após expor a cavidade intra-abdominal usando tesoura microcirúrgica. Corte o baço no pedículo e coloque em uma placa de Petri com soro de bezerro fetal PBS/2% (FCS).
      NOTA: A eutanásia será induzida nos camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.
    2. Solte as células usando lâminas de vidro foscos e transfira para um tubo de polipropileno cônico de 50 mL. Lave com PBS/2% FCS, elevando o volume para 50 mL e centrifugando a 335 x g usando uma centrífuga refrigerada no banco. Despeje o supernatante e repita este passo.
    3. Remova as células vermelhas usando 1 mL de tampão de lysing ACK por 1 min e traga volume de até 50 mL com PBS/2% FCS. Centrifugar a 335 x g e despeje o supernatante.
    4. Conte as células. Rotule as células com CFSE por 30 minutos no gelo no escuro, de acordo com as instruções do fabricante. Suspender suspensões de célula única em 6 placas de poço de 3x106 células/mL por poço em PBS/2% FCS.
    5. Estimule as células rotuladas com CYP2E1, JHDN5 ou TFA-OVA (10 μg/mL) por 72 h a 37 °C em 5% DE CO2, 95% de ar (umidificado). Após a incubação, colorigue as células com CD4-APC (1:100) por 30 minutos no gelo e analise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.
    6. Utilize a seguinte estratégia de gating para identificar células CD4+CFSE+: as células CD4+CFSE+serão identificadas a partir das células vivas fechadas e exibidas como histogramas de células proliferando.
  3. Isolamento de células imunes infiltradas de camundongos imunizados.
    1. Para isolar as células imunes infiltradas nos fígados no dia 14 ou dia 21, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina e confirmar a profundidade adequada da anestesia como descrito na etapa 1.1.1. Após laparotomia usando uma incisão midline feita com uma tesoura micro cirúrgica, como descrito em 1.1.2, cannulate a veia portal com uma agulha de calibre 25 e, em seguida, corte a cava vena inferior abaixo das veias renais.
    2. Perfunda cada fígado a uma taxa de fluxo de 10 mL/min com 40 mL de PBS em um banho de água 37 °C. Após a perfusão, usando uma tesoura micro cirúrgica, corte o fígado no pediculo hepático, remova a vesícula biliar e corte o fígado no hilum.
    3. Interrompa o fígado em uma peneira de aço inoxidável de malha usando um pilão de seringa estéril de 20 mL e PBS frio. Filtre a suspensão celular resultante em tubos de centrífuga pré-esterilizados de 50 mL usando uma tela de malha de 300. Leve cada suspensão a 50 mL usando PBS frio e depois lave a suspensão por centrifugação por 10 min a 370 x g.
    4. Descarte o supernasce e, em seguida, acumule cada pelota por tratamento em novos tubos de 50 mL (recomenda-se um tubo por rato; no entanto, se as amostras forem agrupadas, 2-4 pelotas/tubo são recomendadas). Suspenda as pelotas agrupadas em 45 mL Percoll 35% (em PBS) e 100 UI/mL heparina.
    5. Gire cada tubo a 500 x g por 10 min a 20 °C. Descarte o supernascimento e suspenda a pelota em 5 mL de PBS e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise ACK a cada pelota por 10 minutos no gelo.
    6. Leve cada tubo a 50 mL com PBS e lave por centrifugação por 10 min a 370 x g. Descarte o supernasce e depois lave as células com PBS/2% FCS por centrifugação por 10 min a 370 x g. Conte as células.
    7. Análise do tipo celular usando citometria de fluxo
      NOTA: Aqui está um exemplo de como foxp3+tregs induzidos podem ser detectados.
      1. Incubar células 1x106 com reagente de bloqueio fcr e mancha com diluições de 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP por 30 minutos no gelo. Em seguida, colora as células intracelularmente com FoxP3-APC.
      2. Fixar as células com 250 μL de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) e armazenar a 4 °C até a análise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.
      3. Recomenda-se a seguinte estratégia de gating para detectar Foxp3+Tregs induzidos em suspensões de células únicas de fígado, baço ou linfonodos usando citometria de fluxo: Identifique células vivas usando o kit de manchas Aqua Dead Cell Live/Dead Fixable. Em seguida, portão em células hepáticas que são CD45+ (PerCP, clone RA3-6B2) e células gate CD4+ (FITC, cloneGK1.5) do portão CD45+. Das células CD4+, identifique as porcentagens das células CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).
  4. Análise histológica dos tecidos hepáticos para hepatite
    1. No dia 21, fixar as seções hepáticas (5 μm de espessura) em formalina tamponada 10% neutra e mancha com Hemaoxilina &Eosin.
    2. Determine as pontuações de histologia primeiro em baixa potência (40X) em uma média de 2 visualizações e confirme em 64X. Escore as seções teciduais da seguinte forma: Grau 0=sem inflamação ou necrose; Grau 1= inflamação lobular menor sem necrose; Grau 2= inflamação lobular envolvendo <50% da seção; Inflamação grau 3=lobular envolvendo ≥ 50% da seção; e grau 4=inflamação com necrose.
  5. Determinação dos níveis de citocina tecidual em baços e fígados.
    1. No dia 14 ou dia 21, homogeneize as amostras de fígado ou baço (1 g) de cada rato em 1 mL de RPMI/2% FCS até suavizar usando um homogeneizador de laboratório geral em configuração média. Mantenha a amostra fria no gelo.
    2. Centrifugar o homogeneizado por 15 min a 1455 x g a 4 °C usando uma centrífuga de desktop refrigerada. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C até ficar pronto para uso. Os níveis de citocina e quimiocina podem ser medidos com kits comerciais elisa, conforme instruções do kit. Padronize os níveis de citocinas convertendo os níveis (em mL ou μL) em pg/g de tecido.
  6. Detecção de anticorpos de soro para CYP2E1, o epítope CYP2E1 JHDN5 e o metabólito da droga TFA.
    1. Nos dias 14 ou 21, sedeia os camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de abstinência), além da perda de reflexos de direito e perda de reflexos palpebrais. Utilize uma agulha de 25 G presa a uma seringa tuberculina e aproxime-se do coração avançando lentamente a agulha para a cavidade torácica sob as costelas e imediatamente lateral ao processo xifoide. Coletar sangue usando punção intracardiac.
    2. Uma vez coletado o sangue, deixe-o coagular à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras de sangue a 295 x g por 20 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a sera, aliquot a sera e escor ao congelamento de encaixe a -20 °C.
    3. Aplique 100 μL de antígenos de teste CYP2E1, JHDN5 ou TFA-ovalbumin (OVA) (5 μg/mL em PBS) a 96 placas de poço por pelo menos 18 h a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, lave as placas com tampão de lavagem (PBS/2%FCS), 2 ciclos (4 lavagens cada).
    4. Aplique 100 μL de sera de rato (1:100) em PBS/2% FCS em triplicado nas placas e incubar em temperatura ambiente por 2h. Após 2h, lave as placas com tampão de lavagem conforme descrito na etapa 2.6.2.
    5. Adicione 100 μL de fosfatase alcalina (AKP)-anti-cabra anti-mouse IgG, AKP-rat anti-mouse IgG1, ou akp-rat anti-mouse IgG2a anticorpos secundários (1:1000) por 2 h seguido por um passo de lavagem de 1 ciclo com tampão de lavagem e 1 ciclo com PBS. Detecte os anticorpos usando um kit de substrato AKP e meça em OD 405 nm a cada 15 minutos com um espectotúmetro. TFA geralmente se desenvolve completamente em 15 min, enquanto CYP2E1 e o epítope CYP2E1 podem desenvolver-se de 30 a 60 min7.
  7. Estudos do desenvolvimento do estresse oxidativo induzido pelo IgG JHDN5 in vitro.
    1. Utilizando 12 placas de poço, incubar 106 células hepáticas terminatualmente diferenciadas por poço em deslizamentos de cobertura cobertos de fibronectina em 1000 μL de mídia Williams E complementadas com glutamina e suplemento geral (ver Tabela de Materiais) a 37 °C, 5% de CO2, 95% de umidade por 7 dias, conforme recomendado para maximizar a atividade CYP2E1.
    2. Adicione JHDN5 IgG (1:40) ou mouse IgG (1:1000) para separar poços e incubar por 2h a 37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade. Hybridoma sera foi muito diluído. Adicione detector de anticorpos fluorescentes vermelhos profundos (ver Tabela de Materiais) por mais 30 minutos a todos os poços.
    3. Lave os poços 3x com 1 mL de PBS no escuro. Fixar as células em 3,7% de formaldeído por 10 minutos. Examine por microscopia confocal dentro de 24 h.
  8. Estudos de co-localização de JHDN5 IgG com organelas intracelulares como mitocôndrias in vitro.
    1. Para demonstrar a co-localização do JHDN5 IgG com mitocôndrias, a cultura escassa (~30% de confluência) intereticamente diferenciadas células hepáticas em deslizamentos de cobertura cobertas de fibronectina por 7 dias na mídia E livre de corantes da Williams complementadas como descrito na etapa 2.7.
    2. Depois de determinar os comprimentos de onda de absorção corretos, adicione fluorescente verde, 488 nm -conjugado mouse IgG ou JHDN-5 (1:100) e fluorescente vermelho, 594-conjugado Mito-tracker Vermelho (1:100) para 2 h (37 °C), 5% CO2, 95% de umidade.
    3. Monte deslizamentos de cobertura cobertos de fibronectina com Reagente Anti-fade com DAPI, e examine por microscopia confocal.

3. Notas gerais do protocolo

  1. Utilize ferramentas de grau não farmacêutico quando os compostos não estiverem disponíveis em uma formulação de uso clínico. No entanto, obtenha cada uma dessas ferramentas de fornecedores comerciais confiáveis identificados neste método. Use sempre produtos químicos que estejam de acordo com as especificações definidas pelo Comitê de Reagentes Analíticos da Sociedade Química Americana de pelo menos o nível de grau de reagente. Para nossos métodos, utilize reagentes de nível analítico sempre que possível.
  2. Siga uma técnica asséptica rigorosa para a formulação das proteínas alteradas pelo TFA, a fim de evitar contaminação que possa afetar negativamente o bem-estar animal ou a interpretação dos dados.
  3. Armazenar e utilizar formulações de grau não farmacêutico em durações para as quais a formulação permanecerá potente, de acordo com as informações técnicas disponíveis. Armazene CFA em temperatura ambiente, CYP2E1 e seus epítopos a -20 ou -80 °C. Armazene proteínas alteradas por TFA a -80 °C e deixe chegar a 4 °C antes da emulsificação com CFA. Armazene proteínas alteradas tfa a -80 °C e armazene em alíquotas para evitar ciclos de congelamento repetidos.

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Representative Results

O calendário de vacinação utilizado para induzir o DIH apresentado na Figura 1 representa as duas imunizações necessárias na base do pescoço (dia 0) e a base da cauda (dia 7). A Figura 2 mostra dados representativos de proliferação obtidos no dia 14 utilizando CFSE em resposta ao CYP2E1, JHDN5, o epítope CYP2E1 e o metabólito trifluoroacetil (TFA) dos anestésicos. A Figura 3 mostra a estratégia de gating e a análise representativa da citometria de fluxo de CD4+CD25+FoxP3+ Tregs induzidas obtidas no dia 14. A Figura 4 mostra slides representativos de hematoxilina e eosina que demonstram a evolução da hepatite no dia 21 6. A Figura 5 mostra slides representativos de hematoxilina e eosina que demonstram hepatite mais grave em camundongos BALB/c fêmeas quando comparados aos machos no dia 21, além do conteúdo celular comparativo nestes fígados10. A Figura 6 mostra slides representativos de microscopia confocal demonstrando a ausência de co-localização do IgG do rato com mitocôndrias. A Figura 7 mostra microscopia confocal representativa demonstrando a co-localização do JHDN5 IgG com mitocôndrias.

Figure 1
Figura 1: Imunização de camundongos para induzir hepatite. O DIH pode ser induzido em camundongos BALB/c femininos (como exemplo) pela imunização com TFA-JHDN5 (100 μg) emulsionado no adjuvante completo de Freund (CFA) subcutâneamente (s.c.) na base do pescoço e 50 ng de toxina coqueluche intramuscular (i.m.) na perna traseira no dia 0 (Passo 1). No dia 7, os camundongos BALB/c podem então ser imunizados com TFA-JHDN5 (100μg) emulsionados em CFA (s.c.) no bae da cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Determinação das respostas imunes das células T CD4+ a autofisimentos inteiros, epítopos de auto-proteínas ou o hapten TFA usando citometria de fluxo. Suspensões de células únicas de esplenócitos de 6 a 8 semanas de idade, camundongos BALB/c isolados dia 14 após a imunização inicial, rotulado com CFSE, estimulado com TFA-OVA, CYP2E1 ou JHDN5 (10 μg/mL) para 72 h a 37 °C em 5% de CO2, 95% de ar (umidificado), manchado com CD4-APC e analisado por citometria de fluxo. Poços sem antígeno (mídia) foram usados como controles. Os camundongos BALB/c desenvolveram proliferação em resposta ao OVA-TFA e CYP2E1 e não ao JHDN5, quando comparados à mídia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estratégia de gating para a identificação de Tregs induzidos por CD4+CD25+FoxP3+ utilizando o método descrito em 2.3.7. O primeiro portão identifica células vivas. Para detectar células imunes, as células CD45+ foram inicialmente fechadas. Em seguida, foram identificadas e fechadas células CD4+ T, seguidas pela identificação de células CD25+FoxP3+ dentro da população de células T CD4+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise histológica dos tecidos hepáticos para hepatite. Os camundongos imunizados pelo CFA (painel superior) foram utilizados como controles de veículo. Os camundongos s100 imunizados (painel médio) foram avaliados após as imunizações no mesmo horário. No dia 21, os camundongos foram eutanizados, e o fígado fixado em formalina. Seções de 5 μm de espessura foram feitas e manchadas com hematoxilina e eosina (H&E). A inflamação hepática mínima (células azuis) é demonstrada após as imunizações CFA (superior) e S100 (média) e grandes quantidades de inflamação após as imunizações com TFA-S100. (H&E, ampliação 64X). Este valor é usado com permissão6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Camundongos BALB/c fêmeas desenvolvem mais DIH quando comparados com camundongos BALB/c machos. (A) Camundongos fêmeas (n = 8) apresentaram hepatite significativamente mais grave 3 semanas após as imunizações TFA-S100/CFA do que os machos (n = 7/grupo). (B) Seções hepáticas representativas de camundongos femininos e masculinos (H&E, ampliação 64X). (C) Os números de células HEPÁTICAs CD4+, CD8+, NK+e NKT+ foram significativamente maiores em fêmeas do que em homens. Média ± SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0.001. Este valor é usado com permissão10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Mouse IgG não co-localiza com mitocôndrias. Imagem confocal de células hepáticas terminatariamente diferenciadas manchadas com IgG de rato rotulado verde (488nm) (1:100) (verde) além de fluorescente vermelho (594)–-rotulado Mitotracker Red (1:100). O Mouse IgG com rótulo verde (488nm) não se co-localiza com o Mitotracker Red (ampliação 63X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: JHDN5 IgG co-localiza com mitocôndrias. Imagem confocal de células progenitoras hepáticas terminais diferenciadas manchadas com fluorescente verde (488)–- rotulada JHDN-5 IgG (1:100) além de fluorescente vermelha (594)–-rotulada de Vermelho Mitotracker (1:100). Fluorescente verde (488nm)–rotulado JHDN-5 IgG co-localiza com Mito-tracker Vermelho, demonstrado pela tonalidade amarela na imagem representativa (63X Magnificação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A força deste protocolo repousa em sua reprodutibilidade; por isso, é fundamental aderir às etapas sugeridas. A formulação do imunogênio pode ser uma barreira para alguns; no entanto, reproduzimos nosso modelo usando o epítope descrito em nosso documento, que remove a necessidade de isolar a fração S100 do fígado. É provável que epítopos adicionais ou proteínas possam ser alterados e induzir hepatite após as imunizações; no entanto, descrevemos essas proteínas que usamos com resultados confiáveis. Várias proteínas foram demonstradas como trifluoroacetiladas após exposição anestésica halógena. Provavelmente devido à propagação de epítopes, algumas dessas proteínas também são alvo de autoanticorpos em seu estado nativo, não trifluoroacetilado. Como exemplo, a subunidade E2 do complexo de desidrogenase piruvato (PDH-E2) carrega epítopos (o grupo protético ácido lipóico) com uma semelhança estrutural com o TFA-moiety em TFA-adducts. Anticorpos gerados em pacientes com hepatite halotano têm sido demonstrados como interativas às proteínas TFA e PDH-E2 20,21.

Nosso modelo DIH requer duas imunizações que são emulsificadas em CFA ao longo da parte de trás dos camundongos. Sabemos que as injeções de footpad com CFA têm sido associadas com dor e angústia no rato. Assim, o desenvolvimento do modelo experimental DIH incluiu vários ensaios experimentais. Quando avaliamos o modelo utilizando uma imunização utilizando CFA, com a segunda imunização utilizando o adjuvante incompleto de Freund (IFA) ou IFA em ambas as injeções com nosso imunogênio, a inflamação hepática não se desenvolveu. Em contraste acentuado, quando imunizamos os camundongos com o imunogênio utilizando duas imunizações com CFA, foi presente uma inflamação hepática significativa. A descrição original de outro modelo de hepatite autoimune incluiu estudos semelhantes aos nossos e exigiu duas imunizações com CFA para demonstrar inflamação hepática significativa8. Mesmo assim, reavaliamos continuamente os adjuvantes usando pesquisas de literatura para tentar otimizar a inflamação sem CFA. Como exemplo, há um conhecido adjuvante Titer Max que aumentaria as respostas das células B; no entanto, embora os anticorpos sejam um componente do DIH, nós e outros demonstramos um papel crítico para as respostas das células T em nosso modelo14.

O desenvolvimento de modelos confiáveis facilita as investigações da patogênese do DIH. Demonstramos que a histologia hepática e as células imunes podem ser avaliadas de forma confiável em vários estágios deste modelo. Demonstramos a identificação de células T específicas de antígeno, anticorpos séricos e citocinas teciduais que podem ser utilizadas para estudar o desenvolvimento de DIH. Demonstramos os métodos para isolar células do fígado inflamado e sugerimos o uso de heparina. No entanto, realizamos essa técnica sem heparina e os resultados foram indistinguíveis. Além disso, os métodos atuais de ruptura tecidual também podem liberar células do fígado.

Recentemente, utilizamos ferramentas modernas como o sequenciamento de próxima geração e o PCR quantitativo e experimentamos resultados reprodutíveis. Publicamos resultados sobre dih usando IL-4, receptor IL-4, IL-6, IL-6 receptor IL-33 e ST2 camundongos deficientes que foram todos derivados em um fundo BALB/c para que possamos utilizar o rato BALB/c como nosso mouse de controle. Futuras aplicações deste modelo de DIH incluirão o desenvolvimento de knock em camundongos, além da utilização da tecnologia CRISPR, a fim de descobrir mecanismos não reconhecidos anteriormente responsáveis pela patogênese do DIH.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Dr. Njoku gostaria de reconhecer o Dr. Noel R. Rose, PhD, por sua orientação e discussões perspicazes que resultaram na formulação deste modelo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ThermoFisher 28997
AKP Substrate Kit BioRad 172-1063
BALB/c mice Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher C34554
CFA H37Ra Becton Dickinson (Difco Bacto) 231131
FcR Blocking reagent Milteyi 130-092-575
General supplement ThermoFisher HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved ThermoFisher HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit  ThermoFisher L34965
NaHC03 Millipore Sigma S5761
Percoll® Millipore Sigma P1644-1L
Pertussis Toxin List Biologicals 180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free ThermoFisher 88666
Potassium Hydroxide JT Baker 3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) Millipore Sigma 177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) ThermoFisher 66810
UltraPure™ SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
Williams Media E, no phenol red ThermoFisher A1217601

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References

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Imunologia e Infecção Problema 159 hepatite induzida por drogas imunomediada Autoimunidade citocromo P450 2E autoanticorpo mitocôndrias estresse oxidativo Foxp3+Tregs sexo
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