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Immunology and Infection

इसके रोगजनक तंत्र के अध्ययन के लिए बीएएलबी /सी चूहों में दवा-प्रेरित, ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस का प्रेरण

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/59174
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Summary

सी चूहों में एक इन विवो टीकाकरण, ट्रांसलेशनल हेपेटाइटिस मॉडल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग इस बीमारी में देखे गए सेक्स अंतर सहित दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हम वर्णन करेंगे कि यह मॉडल विवो और इन विट्रो प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण कैसे प्रदर्शित करता है।

Abstract

दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस (डीआईएच) ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के लगभग 9 से 12% रोगियों में देखी जाने वाली सबसे आम यकृत दवा-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता प्रक्रिया है। डीआईएच के रोगियों में अधिकांश महिलाएं हैं। मानव रोग की नकल करने वाले पशु मॉडल की कमी के कारण प्रसार में इन सेक्स अंतरों के अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं हैं। फिर भी, अंतर्निहित तंत्र को व्यापक रूप से मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन हैप्लोटाइप और सेक्स हार्मोन से जुड़ा माना जाता है। इसके विपरीत, एक डीआईएच माउस मॉडल का उपयोग करके, हमने खुलासा किया है कि आईएल -4 ने साइटोक्रोम पी 450 2 ई 1 के एपिटोप के खिलाफ निर्देशित सीडी 4 + टी कोशिकाओं को महिला बीएएलबी / इस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने यह भी दिखाया है कि आईएल -33-प्रेरित फॉक्सपी 3 + नियामक टी कोशिकाएं मादा और पुरुष चूहों में डीआईएच के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करती हैं। यह डीआईएच मॉडल सीवाईपी 2 ई 1 के एपिटोप के साथ चूहों को प्रतिरक्षित करके प्रेरित होता है जिसे डीआईएच से जुड़े ड्रग मेटाबोलाइट के साथ सहसंयोजक रूप से बदल दिया गया है। यह एपिटोप डीआईएच वाले रोगियों द्वारा मान्यता प्राप्त है। हमारी विधि मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हेपेटाइटिस और ऑटोएंटिबॉडी को प्रेरित करती है जिसका उपयोग डीआईएच के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि विवो अध्ययन में अनुचित तरीके से किए जाने पर चूहों में अनुचित दर्द और संकट हो सकता है, इन विवो मॉडल का लाभ बड़ी संख्या में चूहों में बीमारी के रोगजनन का मूल्यांकन करने की क्षमता है। इसके अतिरिक्त, परिवर्तित यकृत प्रोटीन के जैविक प्रभावों का अध्ययन आक्रामक प्रक्रियाओं का उपयोग करके किया जा सकता है। प्रयोगात्मक डिजाइन में इन विट्रो अध्ययनों के अलावा एक सेलुलर स्तर पर तेजी से पुनरावृत्ति और यंत्रवत विश्लेषण की अनुमति देता है। इस प्रकार, हम अपने मॉडल प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करेंगे और इसका उपयोग विवो और डीआईएच के इन विट्रो तंत्र में अध्ययन करने के लिए कैसे किया जा सकता है।

Introduction

इस पद्धति का उद्देश्य दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के एक माउस मॉडल का वर्णन करना है जो विवो में विकसित होता है और यह प्रदर्शित करता है कि इस बीमारी के आणविक, प्रतिरक्षाविज्ञानी और आनुवंशिक आधार की जांच के लिए इसका उपयोग कैसे किया जा सकता है। हमारे अध्ययन का दीर्घकालिक उद्देश्य अतिसंवेदनशील रोगियों में डीआईएच का अध्ययन करके पुरानी जिगर की सूजन और चोट के विकास के लिए जिम्मेदार तंत्र को उजागर करना है। यकृत रोग और सिरोसिस 25 से 64 वर्ष की आयु के वयस्कों में मृत्यु का छठा सबसे आम कारण है। इडियोसिंक्रेटिक डीआईएलआई, जिसे कभी-कभी दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस (डीआईएच) के रूप में जाना जाता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में तीव्र यकृत विफलता का तीसरा सबसे आम कारण है। डीआईएच ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस1 के लगभग 9 से 12% रोगियों में देखी जाने वाली सबसे आम यकृत दवा-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता प्रक्रिया है। डीआईएच के रोगियों में से अधिकांश महिलाएं 2,3,4 हैं। आइसोफ्लूरेन, सेवोफ्लुरेन, डेसफ्लुरेन या हेलोथेन जैसे हलोजनयुक्त वाष्पशील एनेस्थेटिक्स के प्रशासन के बाद अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में एक प्रकार का डीआईएच विकसित होता है। ये संवेदनाहारी सहसंयोजक रूप से अपने चयापचय के प्रतिक्रियाशील उत्पादों के साथ यकृत प्रोटीन को बांधती हैं, इस प्रकार एलर्जी या ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने में सक्षम उपन्यास ऑटोएंटिजन बनाती हैं5.

संवेदनाहारी और डीआईएच के किसी भी रूप के विकास में शामिल रोगजनक तंत्र का अध्ययन पहले एक पशु मॉडल की कमी से बाधित हुआ है जो मानव रोग के प्रेरण की बारीकी से नकल करता है। हमने रोगियों में प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले डीआईएलआई जैसी विशेषताओं के साथ डीआईएच का एक प्रायोगिक म्यूरिन मॉडल विकसित किया है। हेपेटाइटिस दो ऑटोएंटिजन में से एक के साथ टीकाकरण से प्रेरित होता है जिसे ट्राइफ्लोरोसेटाइल क्लोराइड (टीएफए) मेटाबोलाइट द्वारा सहसंयोजक रूप से संशोधित किया गया है जो एंजाइम साइटोक्रोम पी 450 2 ई 1 (सीवाईपी 2 ई 1) 5 द्वारा संवेदनाहारी के ऑक्सीडेटिव चयापचय के बाद बनता है। एक ऑटोएंटिजन यकृत साइटोसोलिक एस 100 यकृत अंश है, जो कई प्रोटीन6 का मिश्रण है, और दूसरा ऑटोएंटिजन सीवाईपी 2 ई 1 का एक एपिटोप है जिसे संवेदनाहारी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले डीआईएलआई7 वाले रोगियों से सीरा द्वारा मान्यता प्राप्त है। सी चूहों का उपयोग करके, जो प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं, हम अपने मॉडल को सी 57 बीएल / 6जे चूहों में ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के एस 100-प्रेरित टीकाकरण मॉडल से अलग करते हैं।

इसकी विविध नैदानिक प्रस्तुतियों के कारण, डीआईएच रोगियों में अध्ययन करना मुश्किल है। ट्रांसलेशनल प्रायोगिक मॉडल विवो और इन विट्रो में रोग के रोगजनन का मूल्यांकन करने की क्षमता प्रदान करते हैं। वर्तमान में, डीआईएच को प्रेरित करने के लिए कोई अन्य वैकल्पिक तरीके नहीं हैं जो जानवरों के उपयोग के बिना विवो या इन विट्रो अनुकूली या जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में पूरी तरह से जांच करते हैं। इसके अलावा, चूंकि एस -100 या सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप के ट्राइफ्लोरोएसिटाइलेशन एक परेशान इम्युनोजेन का उत्पादन नहीं करते हैं, और हम टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन के साथ टीकाकरण द्वारा डीआईएच को प्रेरित कर रहे हैं, इन जानवरों को टीकाकरण या अन्य प्रक्रियाओं से पहले ईथर, किसी भी हलोजनयुक्त संवेदनाहारी, बार्बिटुरेट या अल्कोहल प्राप्त नहीं होगा, यह देखते हुए कि ये एजेंट हमारे द्वारा अध्ययन किए जा रहे मापदंडों को बदल सकते हैं। फिर भी, हमने अपने खोजे गए सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप9 की बाध्यकारी वरीयताओं की पुष्टि करने के लिए कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग करके अपने माउस उपयोग को कम करदिया है और मानव डीआईएच को प्रतिबिंबित किया है जो महिला सेक्स को दर्शाता है कि मादा बीएएलबी /

रोगियों में डीआईएच की विविध प्रस्तुतियों और नैदानिक रोग के अध्ययन में चुनौतियों के बावजूद, प्रतिक्रियाशील दवा चयापचयों द्वारा देशी प्रोटीन का पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन रोगजनन डीआईएच में एक स्वीकृत महत्वपूर्ण तंत्र है जो हलोजनयुक्त संवेदनाहारी11 का अनुसरण करता है। जांचकर्ता यह भी स्वीकार करते हैं कि सीवाईपी 2 ई 1 इस प्रक्रिया में एक प्रमुख ऑटोएंटिजनहै 12,13। इंटरल्यूकिन (आईएल) -4-अपग्रेडेड सीडी 4 + टी कोशिकाओं की भूमिका जो पोस्ट-ट्रांसलेशनली संशोधित सीवाईपी 2 ई 1 और अन्य यकृत प्रोटीन को पहचानती है, यकृत14 में न्यूट्रोफिल, ईोसिनोफिल और मस्तूल कोशिकाओं को आकर्षित करके संवेदनाहारी डीआईएच का एक स्वीकृत सर्जक है, और इस तंत्र की पुष्टि डीआईएच15,16 के कई रूपों में की गई है। प्रेरित फॉक्सपी 3-व्यक्त सीडी 4 + सीडी 25 + टी कोशिकाएं (ट्रेग्स) डीआईएच की गंभीरता को कम करती हैं, और प्लीहा में इन कोशिकाओं की सापेक्ष कमियां डीआईएच 10,7 को खराब करती हैं। इस प्रकार, डीआईएच को समझने में अधिकांश प्रगति विवो और इन विट्रो दोनों में डीआईएच के आनुवंशिक, चयापचय और इम्यूनोलॉजिकल तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए विवो माउस मॉडल में उपयोग करके संभव बनाई गई है।

क्योंकि हमने और अन्य जांचकर्ताओं ने विभिन्न माउस मॉडल का उपयोग करके डीआईएच की दीक्षा में आईएल -4, न्यूट्रोफिल और ईोसिनोफिल के लिए भूमिकाओं को उजागर किया है, हम मानते हैं कि यह अवलोकन हमारे विवाद का समर्थन करता है कि उपयोग किए गए डीआईएच मॉडल की परवाह किए बिना, हेपेटाइटिस और चोट आईएल -4 से प्रेरित होती है। हमारे प्रोटोकॉल की ताकत विवो पद्धति में, नर और मादा चूहों दोनों के उपयोग में निहित है, और ऊतक विज्ञान, सीडी 4 + टी सेल प्रसार परख और साइटोकिन्स की पुनरावृत्ति। इन विट्रो अध्ययनों के हमारे उपयोग की ताकत यह है कि वे डीआईएच को चलाने वाले सेलुलर इंटरैक्शन को अलग करने के लिए पद्धति प्रदान करते समय आवश्यक चूहों की संख्या को कम करते हैं। हम नर और मादा चूहों के उपयोग की सलाह देते हैं क्योंकि यह परिणामों की व्याख्या में बेहोश पूर्वाग्रह की संभावना को कम करता है और हमारे अध्ययन की अनुवाद क्षमता को मजबूत करता है क्योंकि डीआईएच की घटना, प्रसार और गंभीरता महिलाओं में अधिक है17. हम अनुशंसा करते हैं कि चूहों को एक ही विक्रेता से प्राप्त किया जाता है; हालाँकि, यदि यह संभव नहीं है, तो आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के समान विक्रेता से कूड़े के साथी नियंत्रण या जंगली प्रकार के चूहों को प्राप्त करें।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. यकृत एस -100 साइटोसोलिक प्रोटीन या सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप का ट्राइफ्लोरोएसिटिलेशन

नोट: सबसे पहले, ट्राइफ्लोरोसेटाइलेटेड एस 100 (टीएफए-एस 100) और ट्राइफ्लोरोसेटाइलेटेड सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप (टीएफए-जेएचडीएन 5) तैयार करें। क्योंकि टीकाकरण के लिए सिंजेनिक एस 100 प्रोटीन की आवश्यकता होती है, और इम्यूनोजेन का उत्पादन करने के लिए बीएएलबी / तैयारी बड़ी मात्रा में इम्यूनोजेन पैदा करती है; इसलिए, वर्ष में लगभग चार बार इस हिस्से को करने की उम्मीद करें। टीएफए-जेएचडीएन 5 बनाने के लिए एक समान विधि का उपयोग किया जाएगा। सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप (जेएचडीएन 5), जीआईआई / एफएनएन / जीपीटी / डब्ल्यूकेडी / आईआरआर / एफएसएल / टीटीएल, अनुक्रमित या खरीदा जा सकता है।

  1. जिगर के एस 100 अंश का अलगाव।
    1. किग्रा केटामाइन के साथ 5 - 10 बीएएलबी / सी चूहों की बेहोश करने की क्रिया के बाद 4 - 6 मिलीग्राम / किग्रा जाइलाज़िन के साथ मिश्रित, मांसपेशियों की टोन में कमी और दर्दनाक उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं देखकर संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें, जैसे कि पैर की अंगुली चुटकी (निकासी पलटा), सही सजगता के नुकसान और पैल्पेब्रल सजगता के नुकसान के अलावा।
    2. माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके, मिडलाइन चीरा का उपयोग करके इंट्रा-पेट सामग्री को उजागर करें और रक्त को हटाने के लिए अवर वेना कावा में एक छोटा सा कटौती करें।
    3. पोर्टल नस में एक 24-गेज एंजियोकैथेटर रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पीएच 7.4 के 40 मिलीलीटर के साथ यकृत 10 मिलीलीटर / पूल किए गए लिवर को निकालें और तौलें और इसे छोटे टुकड़ों (10 - 15 मिमी) में काट लें।
      नोट: इच्छामृत्यु अतिरिक्त केटामाइन / ज़ाइलाज़िन (80 मिलीग्राम / किग्रा: 8 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से प्रेरित होती है, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और फेफड़ों को ढहने के लिए छाती गुहा खोलती है। यह विधि जानवरों को कम से कम दर्द और असुविधा प्रदान करती है। यह विधि अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन के इच्छामृत्यु पर पैनल की सिफारिशों के अनुरूप है।
    4. सुक्रोज (250 एमएम) -टीआरआईएस (10 एमएम) के वजन का 4 गुना जोड़ें - ईडीटीए (1 एमएम) होमोजेनाइजेशन बफर (पीएच 7.4) निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार पूर्ण प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल गोलियों ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक। चिकनी होने तक बर्फ पर मध्यम गति पर एक सामान्य प्रयोगशाला ऊतक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके, 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में होमोजेनाइज करें। होमोजेनाइजेशन के दौरान ऊतक को गर्म होने से रोकने के लिए बर्फ पर होमोजेनाइज करें।
    5. 10 मिनट के लिए 1500 x g पर यकृत होमोजेनेट्स अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला डालो। 100,000 एक्स जी पर 1 घंटे के लिए सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। स्नैप सतह पर तैरनेवाला फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। सतह पर तैरनेवाला साइटोसोलिक एस -100 है।
  2. एस 100 और जेएचडीएन 5 का ट्राइफ्लोरोएसिटिलेशन
    नोट: एस -100 के लाइसिन अवशेषों के ε-एमिनो समूहों के ट्राइफ्लोरोएसिटाइलेशन को सतोह18 की प्रक्रिया के अनुसार किया जाएगा। डायलिसिस के बाद के दिनों के अपवाद के साथ इस प्रयोग के सभी हिस्सों को धुएं के हुड में किया जाता है।
    1. बाइसिंकोनिक एसिड परख (बीसीए परख) 7 का उपयोग करके साइटोसोलिक एस -100 की कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। सी माउस एस 100 या जेएचडीएन 5 से 10 मिलीग्राम को 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में डीएच2ओ के साथ पतला करें। 1 एन केओएच के साथ पीएच को 10 में समायोजित करें।
    2. समाधान में एस-एथिलट्रिफ्लोरोथियोसेटेट (एस-ईटीएफए) के 4.7 मिमील जोड़ें। लगभग 1 घंटे के लिए छोटी बूंद फैशन में केओएच का प्रशासन करके 1 एन केओएच के साथ 9.9 - 10.0 के बीच पीएच बनाए रखें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए केओएच की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें।
    3. समाधान को अलग-अलग डायलिसिस कैसेट में स्थानांतरित करें (ओवरफिल न करें)। प्रति दिन तीन परिवर्तनों के साथ डीएच 2 ओ के 4 एल के खिलाफ 72 घंटे के लिए कैसेटडायलाइज़करें। डायलिसिस के बाद, टीएफए-एस 100 या टीएफए-जेएचडीएन 5 की अंतिम मात्रा रिकॉर्ड करें और फिर लेबल वाली ट्यूबों में विभाज्य करें। स्नैप फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. डायलिसिस (एमएल) के बाद अंतिम मात्रा से एस 100 या जेएचडीएन 5 (मिलीग्राम में) की प्रारंभिक मात्रा को विभाजित करके एक अनुमानित एकाग्रता निर्धारित की जाती है। देशी प्रोटीन19 के प्रतिशत संशोधन को निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक देशी और टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन के 1.0 मिलीग्राम (यदि अंतिम एकाग्रता 1.0 मिलीग्राम से अधिक है) को अलग-अलग बुलेट ट्यूबों में डीएच2ओ के साथ 1.0 मिलीग्राम तक पतला करें और 1.0 एमएल डीएच2ओ का उपयोग करके एक खाली तैयार करें। यदि टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन की एकाग्रता 1.0 मिलीग्राम से कम है, तो पतला न करें
      1. 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को अलग करने के लिए, रिक्त, देशी और परिवर्तित प्रोटीन के 50 μL जोड़ें। प्रत्येक कुएं में 4% एनएएचसीओ3 के 50 μL जोड़ें, इसके बाद 0.1% 2,4,6-ट्रिनिट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड के 50 μL जोड़ें।
      2. 2 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 10% एसडीएस के 50 μL जोड़ें, इसके बाद 1N एचसीएल के 25 μL जोड़ें।
      3. 334 एनएम के आयुध डिपो में पढ़ें और फिर 334 एनएम पर अवशोषण में विशेषता ड्रॉप की पुष्टि करने के लिए 200 - 600 एनएम से प्रत्येक यौगिक के अवशोषण को रिकॉर्ड करें। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके टीएफए द्वारा लाइसिन अवशेषों के प्रतिशत संशोधन की गणना करें:
        Equation 1

2. हेपेटाइटिस को प्रेरित करने के लिए चूहों का टीकाकरण

सी चूहों में यकृत साइटोसोलिक प्रोटीन के साथ टीकाकरण द्वारा मॉडलिंग की जाती है जिसे ट्राइफ्लोरेसिटाइल क्लोराइड (टीएफए), एक मॉडल ड्रग-मेटाबोलाइट, टीएफए-एस 1006 या सीवाईपी 2 ई 1 के एपिटोप द्वारा सहसंयोजक रूप से बदल दिया गया है टीएफए9, टीएफए-जेएचडीएन 5 जो हेपेटाइटिस, ऑटोरिएक्टिव टी कोशिकाओं को प्रेरित करता है, और सीवाईपी 2 ई 1 ऑटोएंटी चूहे प्रारंभिक टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद एक प्लीहा सक्रियण चरण और 3 सप्ताह तक एक यकृत चरण प्रदर्शित करते हैं जो ग्रैनुलोसाइटिक सूजन की विशेषता है। मादा बीएएलबी / सी चूहों इस मॉडल में हेपेटाइटिस के लिए पुरुषों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं।

  1. सी चूहों को गर्दन के आधार पर चमड़े के नीचे टीएफए-एस 100 के 200 μg या टीएफए-जेएचडीएन 5 के 100 μg के साथ पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) के बराबर मात्रा में पायसीकृत करें। दिन 0 पर, चूहों को 50 एनजी पर्टुसिस विष के साथ प्रतिरक्षित करें, हिंद पैरों में से एक में इंट्रामस्क्युलर रूप से। 7 दिन पर, चूहों को पूंछ के आधार पर चमड़े के नीचे टीएफए-एस 100 के 200 μg या टीएफए-जेएचडीएन 5 के 100 μg के साथ सीएफए के बराबर मात्रा में पायसीकृत करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक माउस को एक ही इम्यूनोजेन के दो इंजेक्शन प्राप्त हों।
    नोट: चूहों टीकाकरण के बाद पहले 6 घंटे के लिए प्रति घंटा निगरानी कर रहे हैं और फिर एक सप्ताह के लिए दैनिक कम से कम दो बार. यदि चूहे दर्द या संकट के संकेत प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि कूबड़ मुद्रा या रफल्ड फर, एनाल्जेसिक को स्थानीय एसीयूसी के अनुसार प्रशासित किया जाना चाहिए। यदि महत्वपूर्ण दर्द या संकट नोट किया जाता है, तो चूहों का मूल्यांकन पशुचिकित्सा द्वारा किया जाना चाहिए ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि इच्छामृत्यु आवश्यक है या नहीं।
  2. पूरे स्व-प्रोटीन, स्व-प्रोटीन के एपिटोप्स या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके टीएफए हैप्टेन के लिए सीडी 4 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का निर्धारण
    1. किग्रा केटामाइन के साथ चूहों की बेहोश करने की क्रिया के बाद इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से 4-6 मिलीग्राम / किग्रा जाइलाज़िन के साथ मिश्रित, चरण 1.1.1 में वर्णित संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें और फिर माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके इंट्रा-पेट गुहा को उजागर करने के बाद प्लीहा की पहचान करें। पेडिकल पर प्लीहा काटें और पीबीएस / 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पेट्री डिश में रखें।
      नोट: इच्छामृत्यु चूहों में अतिरिक्त केटामाइन / ज़ाइलाज़िन (80 मिलीग्राम / किग्रा: 8 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जाएगा, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और फेफड़ों को ढहने के लिए छाती गुहा खोलना होगा। यह विधि जानवरों को कम से कम दर्द और असुविधा प्रदान करती है। यह विधि अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन के इच्छामृत्यु पर पैनल की सिफारिशों के अनुरूप है।
    2. पाले सेओढ़ लिया ग्लास स्लाइड का उपयोग कर कोशिकाओं को छोड़ दें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2% एफसीएस के साथ 50 एमएल तक की मात्रा लाकर और बेंचटॉप प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग करके 335 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करें। सतह पर तैरनेवाला डालो और इस चरण को दोहराएं।
    3. 1 मिनट के लिए एसीके लाइजिंग बफर के 1 एमएल का उपयोग करके लाल कोशिकाओं को हटा दें और पीबीएस / 2% एफसीएस के साथ 50 एमएल तक की मात्रा लाएं। 335 x g पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला डालो।
    4. कोशिकाओं की गिनती करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए सीएफएसई के साथ कोशिकाओं को लेबल करें। पीबीएस /2% एफसीएस में अच्छी तरह से प्रति 3x106 कोशिकाओं / एमएल की 6 अच्छी तरह से प्लेटों में एकल सेल निलंबन निलंबित करें।
    5. 5% सीओ 2, 95% हवा (आर्द्र) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए सीवाईपी 2 ई 1, जेएचडीएन 5, या टीएफए-ओवीए (10 μg / एमएल) के साथ लेबल कोशिकाओं को उत्तेजित करें। इनक्यूबेशन के बाद, बर्फ पर 30 मिनट के लिए सीडी 4-एपीसी (1: 100) के साथ कोशिकाओं को दाग दें और 3 दिनों के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
    6. सीडी 4 + सीएफएसई + कोशिकाओं की पहचान करने के लिए निम्नलिखित गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: सीडी 4 + सीएफएसई + कोशिकाओं को गेटेड जीवित कोशिकाओं से पहचाना जाएगा और प्रसार कोशिकाओं के हिस्टोग्राम के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा।
  3. प्रतिरक्षित चूहों से घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव।
    1. 14 या दिन 21 पर यकृत में घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 40-60 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन के साथ 40-60 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को संवेदनाहारी करें और चरण 1.1.1 में वर्णित संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें। 1.1.2 में वर्णित सूक्ष्म सर्जिकल कैंची के साथ किए गए मिडलाइन चीरा का उपयोग करके लैपरोटॉमी के बाद, पोर्टल नस को 25 गेज सुई के साथ कैन्युलेट करें और फिर गुर्दे की नसों के नीचे अवर वेना कावा काट लें।
    2. मिनट की प्रवाह दर पर प्रत्येक जिगर को 40 एमएल पीबीएस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में परफ्यूज करें। छिड़काव के बाद, सूक्ष्म सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, यकृत पेडिकल पर यकृत को काटें, पित्ताशय की थैली को हटा दें और फिर हिलम पर यकृत काट लें।
    3. एक 20 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज मूसल और ठंडे पीबीएस का उपयोग कर एक जाल स्टेनलेस स्टील छलनी पर जिगर को बाधित। 300 जाल स्क्रीन का उपयोग करके परिणामी सेल निलंबन को 50 एमएल पूर्व-निष्फल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में फ़िल्टर करें। ठंड पीबीएस का उपयोग करके प्रत्येक निलंबन को 50 एमएल तक लाएं और फिर 370 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा निलंबन को धो लें।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर नए 50 एमएल ट्यूबों में उपचार द्वारा प्रत्येक गोली पूल करें (माउस प्रति एक ट्यूब की सिफारिश की जाती है; हालांकि, यदि नमूने पूल किए जाते हैं, तो 2-4 छर्रों / 45 एमएल पेरकोल 35% (पीबीएस में), और 100 आईयू / एमएल हेपरिन में पूल किए गए छर्रों को निलंबित करें।
    5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 x g पर प्रत्येक ट्यूब स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 5 मिलीलीटर में गोली को निलंबित करें और फिर बर्फ पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक गोली के लिए एसीके लाइज़िंग बफर के 1 एमएल जोड़ें।
    6. पीबीएस के साथ 50 एमएल के लिए प्रत्येक ट्यूब लाओ और 370 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर 370 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस /2% एफसीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं की गिनती करें।
    7. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके सेल प्रकार का विश्लेषण
      नोट: यहां एक उदाहरण दिया गया है कि प्रेरित फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स का पता कैसे लगाया जा सकता है।
      1. एफसीआर अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ 1x106 कोशिकाओं सेते हैं और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सीडी 4-एफआईटीसी, सीडी 25-पीई, और सीडी 45-पेरसीपी के 1: 100 कमजोर पड़ने के साथ दाग। अगला, फॉक्सपी 3-एपीसी के साथ इंट्रासेल्युलर रूप से कोशिकाओं को दाग दें।
      2. निर्धारण बफर के 250 μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ( सामग्री की तालिका देखें), और 3 दिनों के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      3. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके यकृत, प्लीहा या लिम्फ नोड्स से एकल कोशिका निलंबन में प्रेरित फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स का पता लगाने के लिए निम्नलिखित गेटिंग रणनीति की सिफारिश की जाती है: लाइव / अगला, यकृत कोशिकाओं पर गेट जो सीडी 45+ (पेरसीपी, क्लोन आरए 3-6 बी 2), और सीडी 45 + गेट से गेट सीडी 4 + कोशिकाएं (एफआईटीसी, क्लोनजीके 1.5) हैं। सीडी 4 + कोशिकाओं से, सीडी 25 + (पीई, क्लोन 7 डी 4) और फॉक्सपी 3 + (एपीसी, क्लोन 3 जी 3) कोशिकाओं के प्रतिशत की पहचान करें।
  4. हेपेटाइटिस के लिए जिगर के ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
    1. 21 वें दिन, यकृत वर्गों (5 μm मोटी) को 10% तटस्थ बफर किए गए फॉर्मलिन में ठीक करें और हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन के साथ दाग दें।
    2. 2 विचारों के औसत में कम शक्ति (40X) पर पहले ऊतक विज्ञान स्कोर निर्धारित करें और 64X पर पुष्टि करें। निम्नानुसार ऊतक वर्गों स्कोर करें: ग्रेड 0 = कोई सूजन या परिगलन नहीं; ग्रेड 1 = बिना किसी परिगलन के मामूली लोबुलर सूजन; ग्रेड 2 = अनुभाग के <50% शामिल लोबुलर सूजन; ग्रेड 3 = लोबुलर सूजन जिसमें अनुभाग का ≥ 50% शामिल है; और ग्रेड 4 = परिगलन के साथ सूजन।
  5. प्लीहा और यकृत में ऊतक साइटोकिन के स्तर का निर्धारण।
    1. 14 वें दिन या दिन 21 पर, मध्यम सेटिंग पर एक सामान्य प्रयोगशाला होमोजेनाइज़र का उपयोग करके चिकनी होने तक आरपीएमआई / 2% एफसीएस के 1 एमएल में प्रत्येक माउस से यकृत या प्लीहा के नमूनों (1 ग्राम) को होमोजेनाइज करें। बर्फ पर नमूना ठंडा रखें।
    2. एक प्रशीतित डेस्कटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग कर4 डिग्री सेल्सियस पर 1455 x g पर 15 मिनट के लिए होमोजेनेट अपकेंद्रित्र। स्नैप सतह पर तैरनेवाला फ्रीज और उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। किट निर्देशों के अनुसार, साइटोकिन और केमोकाइन के स्तर को वाणिज्यिक एलिसा किट के साथ मापा जा सकता है। ऊतक के पीजी / जी के स्तर (एमएल या μL में) को परिवर्तित करके साइटोकिन्स के स्तर को मानकीकृत करें।
  6. सीवाईपी 2 ई 1, सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप जेएचडीएन 5 और टीएफए दवा मेटाबोलाइट के लिए सीरम एंटीबॉडी का पता लगाना।
    1. 14 या 21 दिनों में, चूहों को 40-60 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन के साथ 4-6 मिलीग्राम / किग्रा जाइलाज़िन के साथ मिश्रित करें। मांसपेशियों की टोन में कमी और दर्दनाक उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं देखकर संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें, जैसे कि पैर की अंगुली चुटकी (निकासी पलटा), सही सजगता के नुकसान और पैल्पेब्रल सजगता के नुकसान के अलावा। एक तपेदिक सिरिंज से जुड़ी 25 जी सुई का उपयोग करें और धीरे-धीरे पसलियों के नीचे वक्ष गुहा में सुई को आगे बढ़ाकर और तुरंत एक्सिफॉइड प्रक्रिया के लिए पार्श्व करके हृदय से संपर्क करें। इंट्राकार्डियक पंचर का उपयोग करके रक्त एकत्र करें।
    2. एक बार रक्त एकत्र हो जाने के बाद, इसे कमरे के तापमान पर थक्का बनने दें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 295 x g पर रक्त के नमूने अपकेंद्रित्र। ध्यान से सेरा को हटा दें, सेरा को विभाज्य करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज स्नैप करें।
    3. सीवाईपी 2 ई 1, जेएचडीएन 5, या टीएफए-ओवाल्ब्यूमिन (ओवीए) परीक्षण एंटीजन (पीबीएस में 5 μg / एमएल) के 100 μL को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 18 घंटे के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर लागू करें। अगले दिन, वॉश बफर (पीबीएस / 2% एफसीएस), 2 चक्र (प्रत्येक 4 वॉश) के साथ प्लेटों को धो लें।
    4. प्लेटों पर ट्रिप्लिकेट में पीबीएस/2% एफसीएस में माउस सेरा (1:100) के 100 μL लागू करें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 2 घंटे के बाद, चरण 2.6.2 में वर्णित के रूप में धोने बफर के साथ प्लेटों को धो लें।
    5. क्षारीय फॉस्फेट (एकेपी) -बकरी एंटी-माउस आईजीजी, एकेपी-चूहा एंटी-माउस आईजीजी 1, या एकेपी-चूहा एंटी-माउस आईजीजी 2 ए माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1000) के 100 μL को 2 घंटे के लिए जोड़ें, इसके बाद धोने के बफर के साथ 1 चक्र का धोने का चरण और पीबीएस के साथ 1 चक्र। एक एकेपी सब्सट्रेट किट का उपयोग करके एंटीबॉडी का पता लगाएं और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ हर 15 मिनट में ओडी 405 एनएम पर मापें। टीएफए आमतौर पर पूरी तरह से 15 मिनट में विकसित होता है जबकि सीवाईपी 2 ई 1 और सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप 30 से 60 मिनट7 तक विकसित हो सकते हैं।
  7. इन विट्रो में जेएचडीएन 5 आईजीजी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के विकास का अध्ययन।
    1. 12 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करते हुए, विलियम्स ई मीडिया के 1000 μL में फाइब्रोनेक्टिन-कवर कवर स्लिप्स पर अच्छी तरह से 106 टर्मिनल रूप से विभेदित यकृत कोशिकाओं को सेते हैं, ग्लूटामाइन और सामान्य पूरक ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता 7 दिनों के लिए सीवाईपी 2 ई 1 गतिविधि को अधिकतम करने की सिफारिश की जाती है।
    2. कुओं को अलग करने के लिए जेएचएन 5 आईजीजी (1: 40) या माउस आईजीजी (1: 1000) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता पर2 घंटे के लिए सेते हैं। हाइब्रिडोमा सेरा बहुत पतला था। सभी कुओं के लिए एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए गहरी लाल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी डिटेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
    3. अंधेरे में पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुओं 3x धो लें। 10 मिनट के लिए 3.7% फॉर्मलाडेहाइड में कोशिकाओं को ठीक करें। 24 घंटे के भीतर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच करें।
  8. "इन विट्रो में माइटोकॉन्ड्रिया जैसे इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल के साथ जेएचडीएन 5 आईजीजी का सह-स्थानीयकरण अध्ययन" (पीडीएफ).
    1. माइटोकॉन्ड्रिया के साथ जेएचडीएन 5 आईजीजी के सह-स्थानीयकरण का प्रदर्शन करने के लिए, फाइब्रोनेक्टिन-कवर कवर स्लिप्स पर विरल संस्कृति (~ 30% संगम) डाई-फ्री विलियम्स के मीडिया ई में 7 दिनों के लिए टर्मिनल रूप से विभेदित यकृत कोशिकाओं को चरण 2.7 में वर्णित के रूप में पूरक किया गया है।
    2. सही अवशोषण तरंग दैर्ध्य का निर्धारण करने के बाद, हरे फ्लोरोसेंट, 488 एनएम -संयुग्मित माउस आईजीजी या जेएचडीएन -5 (1: 100) और लाल फ्लोरोसेंट, 594-संयुग्मित मिटो-ट्रैकर लाल (1: 100) 2 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस), 5% सीओ2, 95% आर्द्रता के लिए जोड़ें।
    3. डीएपीआई के साथ एंटी-फीका अभिकर्मक के साथ फाइब्रोनेक्टिन-कवर कवर स्लिप्स लेबल माउंट करें, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच करें।

3. सामान्य प्रोटोकॉल नोट्स

  1. नैदानिक उपयोग सूत्रीकरण में यौगिक उपलब्ध नहीं होने पर गैर-फार्मास्युटिकल ग्रेड उपकरणों का उपयोग करें। हालांकि, इस पद्धति में पहचाने गए विश्वसनीय वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से इनमें से प्रत्येक उपकरण प्राप्त करें। हमेशा उन रसायनों का उपयोग करें जो कम से कम अभिकर्मक ग्रेड स्तर के अमेरिकन केमिकल सोसाइटी के विश्लेषणात्मक अभिकर्मकों पर समिति द्वारा परिभाषित विनिर्देशों के अनुरूप हैं। हमारे तरीकों के लिए, जब भी संभव हो विश्लेषणात्मक ग्रेड स्तर अभिकर्मकों का उपयोग करें।
  2. संदूषण को रोकने के लिए टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन के निर्माण के लिए सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन करें जो पशु कल्याण या डेटा की व्याख्या पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है।
  3. उपलब्ध तकनीकी जानकारी के अनुसार, गैर-फार्मास्युटिकल ग्रेड फॉर्मूलेशन को उन अवधियों में स्टोर और उपयोग करें जिनके लिए फॉर्मूलेशन शक्तिशाली रहेगा। कमरे के तापमान पर सीएफए स्टोर करें, सीवाईपी 2 ई 1 और इसके एपिटोप -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर। -80 डिग्री सेल्सियस पर टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन स्टोर करें और सीएफए के साथ पायसीकरण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर आने की अनुमति दें। टीएफए परिवर्तित प्रोटीन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और दोहराए जाने वाले फ्रीज-पिघलना चक्रों को रोकने के लिए विभाज्य में स्टोर करें।

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Representative Results

चित्रा 1 में दिखाए गए डीआईएच को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला टीकाकरण अनुसूची गर्दन (दिन 0) और पूंछ के आधार (दिन 7) के आधार पर आवश्यक दो टीकाकरण का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 2 सीवाईपी 2 ई 1, जेएचडीएन 5, सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप और एनेस्थेटिक्स के ट्राइफ्लोरोसेटाइल (टीएफए) मेटाबोलाइट के जवाब में सीएफएसई का उपयोग करके दिन 14 पर प्राप्त प्रतिनिधि प्रसार डेटा दिखाता है। चित्रा 3 दिन 14 पर प्राप्त प्रेरित सीडी 4 + सीडी 25 + फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स के गेटिंग रणनीति और प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण को दर्शाता है। चित्रा 4 प्रतिनिधि हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन दाग स्लाइड दिखाता है जो दिन 21 6 पर हेपेटाइटिस के विकास का प्रदर्शन करता है। चित्रा 5 प्रतिनिधि हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन दाग स्लाइड दिखाता है जो इन यकृतों में तुलनात्मक सेलुलर सामग्री के अलावा 21 वें दिन पुरुषों की तुलना में महिला बीएएलबी / सी चूहों में अधिक गंभीर हेपेटाइटिस का प्रदर्शन करता है। चित्रा 6 माइटोकॉन्ड्रिया के साथ माउस आईजीजी के सह-स्थानीयकरण की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्लाइड दिखाता है। चित्रा 7 माइटोकॉन्ड्रिया के साथ जेएचडीएन 5 आईजीजी के सह-स्थानीयकरण का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1: हेपेटाइटिस को प्रेरित करने के लिए चूहों का टीकाकरण। सी चूहों (उदाहरण के लिए) में टीएफए-जेएचडीएन 5 (100 μg) के साथ टीकाकरण द्वारा गर्दन के आधार पर चमड़े के नीचे (एससी) पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में पायसीकृत किया जा सकता है और 50 एनजी पर्टुसिस विष इंट्रामस्क्युलर रूप से (यानी) दिन 0 (चरण 1) पर हिंद पैर में। सी चूहों को पूंछ के बीएई पर सीएफए (एससी) में पायसीकृत टीएफए-जेएचडीएन 5 (100μg) के साथ प्रतिरक्षित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पूरे आत्म-प्रोटीन, आत्म-प्रोटीन के एपिटोप या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके टीएफए हैप्टेन के लिए सीडी 4 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का निर्धारण। सी चूहों से स्प्लेनोसाइट्स के एकल सेल निलंबन प्रारंभिक टीकाकरण के बाद 14 दिन पृथक, सीएफएसई के साथ लेबल, टीएफए-ओवीए, सीवाईपी 2 ई 1 या जेएचडीएन 5 (10 μg / एमएल) के साथ उत्तेजित 5% सीओ 2, 95% हवा (आर्द्र) में 37 डिग्री सेल्सियस पर72 घंटे के लिए उत्तेजित, सीडी 4-एपीसी के साथ दाग और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। एंटीजन (मीडिया) के बिना कुओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सी चूहों ने मीडिया की तुलना में ओवीए-टीएफए और सीवाईपी 2 ई 1 के जवाब में प्रसार विकसित किया, न कि जेएचडीएन 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 2.3.7 में वर्णित विधि का उपयोग करके सीडी 4 + सीडी 25 + फॉक्सपी 3 + प्रेरित ट्रेग्स की पहचान के लिए गेटिंग रणनीति। पहला गेट जीवित कोशिकाओं की पहचान करता है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, सीडी 45+ कोशिकाओं को शुरू में गेट किया गया था। इसके बाद, सीडी 4 + टी कोशिकाओं की पहचान की गई और गेट किया गया, इसके बाद सीडी 4 + टी सेल आबादी के भीतर सीडी 25 + फॉक्सपी 3 + कोशिकाओं की पहचान की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हेपेटाइटिस के लिए यकृत के ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। सीएफए-प्रतिरक्षित चूहों (शीर्ष पैनल) का उपयोग वाहन नियंत्रण के रूप में किया गया था। एस 100-प्रतिरक्षित चूहों (मध्य पैनल) का मूल्यांकन उसी अनुसूची पर टीकाकरण के बाद किया गया था। 21 वें दिन, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई, और यकृत फॉर्मलिन में तय किया गया। धारा 5 μm मोटी बनाई गई थी और हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया था। टीएफए-एस 100 के साथ टीकाकरण के बाद सीएफए (शीर्ष) और एस 100 (मध्य) टीकाकरण और बड़ी मात्रा में सूजन के बाद न्यूनतम यकृत सूजन (नीली कोशिकाओं) का प्रदर्शन किया जाता है। (एच एंड ई, आवर्धन 64 एक्स)। इस आंकड़े का उपयोग अनुमति6 के साथ किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मादा बीएएलबी /सी चूहों में नर बीएएलबी /सी चूहों की तुलना में अधिक डीआईएच विकसित होता है। (ए) मादा चूहों (एन = 8) में पुरुषों (एन = 7/समूह) की तुलना में टीएफए-एस 100 / सीएफए टीकाकरण के 3 सप्ताह बाद काफी अधिक गंभीर हेपेटाइटिस था। (बी) मादा और पुरुष चूहों से प्रतिनिधि यकृत वर्गों (एच एंड ई, आवर्धन 64 एक्स)। (सी) यकृत सीडी 4 +, सीडी 8 +, एनके +, और एनकेटी + कोशिकाओं की संख्या पुरुषों की तुलना में महिलाओं में काफी अधिक थी। * पी ± <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001। इस आंकड़े का उपयोग अनुमति10 के साथ किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: माउस आईजीजी माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करता है। लाल फ्लोरोसेंट (594) -लेबल वाले माइटोट्रैकर रेड (1: 100) के अलावा हरे फ्लोरोसेंट (488 एनएम) -लेबल वाले माउस आईजीजी (1: 100) (हरे) के साथ दाग वाले टर्मिनल विभेदित यकृत कोशिकाओं की कॉन्फोकल छवि। ग्रीन फ्लोरोसेंट (488 एनएम) -लेबल माउस आईजीजी माइटोट्रैकर रेड (63 एक्स आवर्धन) के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: जेएचडीएन 5 आईजीजी माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। लाल फ्लोरोसेंट (594) -लेबल वाले माइटोट्रैकर रेड (1: 100) के अलावा हरे फ्लोरोसेंट (488) के साथ दाग वाले टर्मिनल विभेदित यकृत पूर्वज कोशिकाओं की कॉन्फोकल छवि - लेबल जेएचडीएन -5 आईजीजी (1: 100)। ग्रीन फ्लोरोसेंट (488 एनएम) -लेबल जेएचडीएन -5 आईजीजी मिटो-ट्रैकर रेड के साथ सह-स्थानीयकरण करता है, जो प्रतिनिधि छवि (63 एक्स आवर्धन) पर पीले रंग द्वारा प्रदर्शित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की ताकत इसकी प्रजनन क्षमता में टिकी हुई है; इसलिए, सुझाए गए चरणों का पालन करना महत्वपूर्ण है। इम्यूनोजेन का निर्माण कुछ के लिए एक बाधा हो सकता है; हालाँकि, हमने अपने दस्तावेज़ में वर्णित एपिटोप का उपयोग करके अपने मॉडल को पुन: पेश किया है, जो यकृत के एस 100 अंश को अलग करने की आवश्यकता को हटा देता है। यह संभावना है कि अतिरिक्त एपिटोप या प्रोटीन को बदला जा सकता है और टीकाकरण के बाद हेपेटाइटिस को प्रेरित किया जा सकता है; हालाँकि, हम उन प्रोटीनों का वर्णन करते हैं जिन्हें हमने विश्वसनीय परिणामों के साथ उपयोग किया है। कई प्रोटीनों को हलोजनयुक्त संवेदनाहारी जोखिम पर ट्राइफ्लोरोसेटाइलेटेड होने का प्रदर्शन किया गया है। एपिटोप फैलने के कारण सबसे अधिक संभावना है, इनमें से कुछ प्रोटीन अपने मूल, गैर-ट्राइफ्लोरोसेटाइलेटेड अवस्था में ऑटोएंटिबॉडी का लक्ष्य भी हैं। एक उदाहरण के रूप में, पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स (पीडीएच-ई 2) का ई 2 सबयूनिट टीएफए-एडक्ट्स में टीएफए-मॉइटी के लिए संरचनात्मक समानता के साथ एपिटोप (लिपोइक एसिड कृत्रिम समूह) को वहन करता है। हेलोथेन हेपेटाइटिस वाले रोगियों में उत्पन्न एंटीबॉडी को टीएफए-प्रोटीन और पीडीएच-ई 2 20,21 के लिए क्रॉस-रिएक्टिव होने का प्रदर्शन किया गया है।

हमारे डीआईएच मॉडल को दो टीकाकरण की आवश्यकता होती है जो चूहों के पीछे सीएफए में पायसीकृत होते हैं। हम जानते हैं कि सीएफए के साथ फुटपैड इंजेक्शन माउस में दर्द और संकट से जुड़े हुए हैं। इसलिए, प्रायोगिक डीआईएच मॉडल के विकास में कई प्रयोगात्मक परीक्षण शामिल थे। जब हमने सीएफए का उपयोग करके एक टीकाकरण का उपयोग करके मॉडल का मूल्यांकन किया, तो हमारे इम्यूनोजेन के साथ दोनों इंजेक्शनों में अधूरे फ्रायंड के सहायक (आईएफए) या आईएफए का उपयोग करके दूसरे टीकाकरण के साथ, यकृत सूजन विकसित नहीं हुई। इसके विपरीत, जब हमने सीएफए के साथ दो टीकाकरण का उपयोग करके इम्यूनोजेन के साथ चूहों का टीकाकरण किया, तो महत्वपूर्ण यकृत सूजन मौजूद थी। ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के एक अन्य मॉडल के मूल विवरण में हमारे समान अध्ययन शामिल थे और महत्वपूर्ण यकृत सूजन 8 प्रदर्शित करने के लिए सीएफए के साथ दो टीकाकरणकी आवश्यकता थी। फिर भी, हम सीएफए के बिना सूजन को अनुकूलित करने का प्रयास करने के लिए साहित्य खोजों का उपयोग करके सहायकका लगातार पुनर्मूल्यांकन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, एक प्रसिद्ध सहायक टिटर मैक्स है जो बी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ाएगा; हालांकि, हालांकि एंटीबॉडी डीआईएच का एक घटक हैं, हमने और अन्य लोगों ने हमारे मॉडल14 में टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है।

विश्वसनीय मॉडल का विकास डीआईएच के रोगजनन की जांच की सुविधा प्रदान करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यकृत ऊतक विज्ञान और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इस मॉडल में विभिन्न चरणों में मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है। हम एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं, सीरम एंटीबॉडी और ऊतक साइटोकिन्स की पहचान प्रदर्शित करते हैं जिनका उपयोग डीआईएच के विकास का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हम सूजन वाले जिगर से कोशिकाओं को अलग करने के तरीकों का प्रदर्शन करते हैं और हेपरिन के उपयोग का सुझाव देते हैं। हालांकि, हमने हेपरिन के बिना इस तकनीक का प्रदर्शन किया है और परिणाम अप्रभेद्य थे। इसके अतिरिक्त, ऊतक विघटन के वर्तमान तरीके भी यकृत से कोशिकाओं को छोड़ सकते हैं।

हाल ही में, हमने अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और मात्रात्मक पीसीआर जैसे आधुनिक उपकरणों का उपयोग किया है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का अनुभव किया है। हमने आईएल -4, आईएल -4 रिसेप्टर, आईएल -6, आईएल -6 रिसेप्टर आईएल -33 और एसटी 2 की कमी वाले चूहों का उपयोग करके डीआईएच के बारे में परिणाम प्रकाशित किए हैं जो सभी बीएएलबी / सी पृष्ठभूमि पर व्युत्पन्न थे ताकि हम अपने नियंत्रण माउस के रूप में बीएएलबी / डीआईएच के इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों में सीआरआईएसपीआर प्रौद्योगिकी के उपयोग के अलावा चूहों में दस्तक का विकास शामिल होगा ताकि डीआईएच के रोगजनन के लिए जिम्मेदार पहले से अपरिचित तंत्र को उजागर किया जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

नोएल आर रोज, एमडी पीएचडी को उनके मार्गदर्शन और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए स्वीकार करना चाहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप इस मॉडल का निर्माण हुआ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ThermoFisher 28997
AKP Substrate Kit BioRad 172-1063
BALB/c mice Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher C34554
CFA H37Ra Becton Dickinson (Difco Bacto) 231131
FcR Blocking reagent Milteyi 130-092-575
General supplement ThermoFisher HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved ThermoFisher HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit  ThermoFisher L34965
NaHC03 Millipore Sigma S5761
Percoll® Millipore Sigma P1644-1L
Pertussis Toxin List Biologicals 180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free ThermoFisher 88666
Potassium Hydroxide JT Baker 3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) Millipore Sigma 177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) ThermoFisher 66810
UltraPure™ SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
Williams Media E, no phenol red ThermoFisher A1217601

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References

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Thomas, D., Wu, T. Y., Cottagiri, M., Nyandjo, M., Njoku, D. B. Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms. J. Vis. Exp. (159), e59174, doi:10.3791/59174 (2020).

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