Summary
Vi beskriver en in vivo immunisering, translasjonell hepatittmodell i BALB / c mus som kan brukes til å studere patogenesen av legemiddelindusert autoimmun hepatitt inkludert kjønnsforskjeller sett i denne sykdommen. Vi vil beskrive hvordan denne modellen demonstrerer reproduserbare analyser ved hjelp av in vivo og in vitro eksperimentelle teknikker.
Abstract
Legemiddelindusert autoimmun hepatitt (DIH) er den vanligste hepatiske legemiddelinduserte hypersensibiliseringsprosessen observert hos ca. 9 til 12% av pasientene med autoimmun hepatitt. Det overveldende flertallet av pasienter med DIH er kvinner. De underliggende mekanismene for disse kjønnsforskjellene i prevalens er uklare på grunn av mangelen på dyremodeller som etterligner menneskelig sykdom. Likevel er underliggende mekanismer allment antatt å være assosiert med humane leukocyttantigen haplotyper og kjønnshormoner. I motsetning til dette har vi ved hjelp av en DIH-musemodell avdekket at IL-4 initierte CD4 + T-celler rettet mot en epitop av cytokrom P450 2E1 induserer tilstrømning av nøytrofiler, makrofager og mastceller i leveren til kvinnelige BALB / c-mus. Ved hjelp av denne modellen har vi også vist at IL-33-induserte FoxP3 + regulatoriske T-celler gir beskyttelse mot DIH hos kvinnelige og mannlige mus. Denne DIH-modellen induseres ved immunisering av mus med en CYP2E1-epitop som har blitt kovalent endret med en legemiddelmetabolitt som har vært assosiert med DIH. Denne epitopen er anerkjent av pasienter med DIH. Vår metode induserer robust og reproduserbar hepatitt og autoantistoffer som kan brukes til å studere patogenesen til DIH. Mens in vivo-studier kan forårsake unødig smerte og nød hos mus når det gjøres feil, er fordelen med en in vivo-modell evnen til å evaluere patogenesen av sykdom hos et stort antall mus. I tillegg kan biologiske effekter av de endrede leverproteinene studeres ved hjelp av invasive prosedyrer. Tillegg av in vitro-studier til eksperimentell design tillater rask repetisjon og mekanistisk analyse på mobilnivå. Dermed vil vi demonstrere vår modellprotokoll og hvordan den kan brukes til å studere in vivo og in vitro mekanismer av DIH.
Introduction
Formålet med denne metoden er å beskrive en musemodell av medikamentindusert autoimmun hepatitt som utvikler seg in vivo og demonstrere hvordan den kan brukes til å undersøke det molekylære, immunologiske og genetiske grunnlaget for denne sykdommen. Det langsiktige målet med våre studier er å avdekke mekanismer som er ansvarlige for utvikling av kronisk leverbetennelse og skade ved å studere DIH hos følsomme pasienter. Leversykdom og skrumplever utgjør den sjette vanligste dødsårsaken hos voksne mellom 25 og 64 år. Idiosynkratisk DILI, noen ganger referert til som legemiddelindusert autoimmun hepatitt (DIH), er den tredje vanligste årsaken til akutt leversvikt i USA. DIH er den vanligste hepatiske legemiddelinduserte hypersensibiliseringsprosessen observert hos ca. 9 til 12 % av pasientene med autoimmun hepatitt1. Det overveldende flertallet av pasienter med DIH er kvinner 2,3,4. En type DIH utvikles hos følsomme individer etter administrering av halogenerte flyktige anestetika som isofluran, sevofluran, desfluran eller halotan. Disse anestetika binder kovalent til leverproteiner med reaktive produkter av deres metabolisme, og skaper dermed nye autoantigener som er i stand til å fremkalle allergiske eller autoimmune responser.
Studien av patogene mekanismer involvert i utviklingen av bedøvelse og enhver form for DIH har tidligere blitt hindret av mangelen på en dyremodell som nøye etterligner induksjonen av menneskelig sykdom. Vi har utviklet en eksperimentell murine modell av DIH med funksjoner som ligner immunmediert DILI hos pasienter. Hepatitt induseres ved immunisering med ett av to autoantigener som er kovalent modifisert av trifluoroacetylklorid (TFA)-metabolitten som dannes etter oksidativ metabolisme av bedøvelsen av enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Ett autoantigen er den hepatiske cytosoliske S100 leverfraksjonen, som er en blanding av flere proteiner6, og det andre autoantigenet er en epitop av CYP2E1 som gjenkjennes av sera fra pasienter med bedøvelse immunmediert DILI7. Ved å bruke BALB/c mus, som er relativt resistente mot eksperimentell autoimmun hepatitt, skiller vi vår modell fra den S100-induserte immuniseringsmodellen for autoimmun hepatitt hos C57Bl/6J mus8.
På grunn av sine mangfoldige kliniske presentasjoner er DIH vanskelig å studere hos pasienter. Translasjonelle eksperimentelle modeller gir muligheten til å evaluere patogenesen av sykdom in vivo og in vitro. For tiden finnes det ingen andre alternative metoder for å indusere DIH som fullt ut undersøker in vivo eller in vitro adaptive eller medfødte immunresponser uten bruk av dyr. Videre, siden trifluoroacetylering av S-100 eller CYP2E1 epitopen ikke ser ut til å produsere et irriterende immunogen, og vi induserer DIH ved immunisering med TFA-endrede proteiner, vil disse dyrene ikke motta eter, noe halogenert bedøvelsesmiddel, barbiturat eller alkohol før immunisering eller andre prosedyrer, med tanke på at disse midlene kan endre parametrene vi studerer. Likevel har vi redusert musebruken vår ved å bruke datasimulering for å bekrefte bindingspreferansene til vår oppdagede CYP2E1 epitop9 og har speilet menneskelig DIH som impliserer kvinnelig kjønn ved å demonstrere at kvinnelige BALB / c-mus utvikler en mer alvorlig DIH10.
Til tross for ulike presentasjoner av DIH hos pasienter og utfordringer i studiet av klinisk sykdom, er posttranslasjonell modifikasjon av innfødte proteiner ved reaktive legemiddelmetabolitter en akseptert nøkkelmekanisme i patogenesen DIH som følger halogenerte anestetika11. Etterforskerne aksepterer også at CYP2E1 er et viktig autoantigen i denne prosessen12,13. Rollen til interleukin (IL)-4-oppregulerte CD4+T-celler som gjenkjenner et posttranslasjonelt modifisert CYP2E1 og andre leverproteiner er en akseptert initiator av bedøvelses-DIH ved å tiltrekke nøytrofiler, eosinofiler og mastceller inn i leveren14, og denne mekanismen er bekreftet i mange former for DIH15,16. Induserte FoxP3-uttrykkende CD4+ CD25 + T-celler (Tregs) reduserer alvorlighetsgraden av DIH, og relative mangler av disse cellene i milten forverrer DIH 10,7. Dermed har de fleste fremskritt i forståelsen av DIH blitt gjort mulig ved å bruke in vivo musemodeller for å evaluere de genetiske, metabolske og immunologiske mekanismene til DIH både in vivo og in vitro.
Fordi vi og andre etterforskere har avdekket roller for IL-4, nøytrofiler og eosinofiler i initiering av DIH ved hjelp av forskjellige musemodeller, tror vi at denne observasjonen støtter vår påstand om at uavhengig av DIH-modellen som brukes, er hepatitt og skade indusert av IL-4. Styrken i protokollen vår ligger i bruk av in vivo-metodikk, både hann- og hunnmus, og repetisjon av histologi, CD4+ T-celleproliferasjonsanalyser og cytokiner. Styrken ved vår bruk av in vitro-studier er at de reduserer antall mus som trengs, samtidig som de gir metodikken for å isolere cellulære interaksjoner som driver DIH. Vi anbefaler bruk av hann- og hunnmus fordi dette reduserer muligheten for ubevisst skjevhet i tolkningen av resultater og styrker oversettelsespotensialet i våre studier siden forekomsten, prevalensen og alvorlighetsgraden av DIH er høyere hos kvinner17. Vi anbefaler at mus hentes fra en enkelt leverandør; Men hvis dette ikke er mulig, få kullkompiskontroller eller villtypemus fra samme leverandør som de genetisk endrede musene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av dyrepleie- og brukskomiteen.
1. Trifluoroacetylering av hepatiske S-100 cytosoliske proteiner eller en CYP2E1 epitop
MERK: Forbered først den trifluoroacetylerte S100 (TFA-S100) og trifluoroacetylerte CYP2E1 epitopen (TFA-JHDN5). Fordi syngeneiske S100 proteiner er nødvendig for immuniseringer, og BALB / c mus er nødvendig for å produsere immunogen. Preparatet gir en stor mengde immunogen; så forvent å utføre denne delen rundt fire ganger i året. En identisk metode vil bli brukt til å lage TFA-JHDN5. CYP2E1-epitopen (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, kan sekvenseres eller kjøpes.
- Isolering av S100 fraksjonen av leveren.
- Etter sedasjon av 5 – 10 BALB/c mus med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4 - 6 mg/kg xylazin, bekreft riktig anestesidybde ved å observere en reduksjon i muskeltonus og ingen respons på smertefulle stimuli, som en tåklemme (abstinensrefleks), i tillegg til tap av korrigerende reflekser og tap av palpebrale reflekser.
- Bruk mikrokirurgisk saks, utsett det intra-abdominale innholdet ved hjelp av et midtlinjesnitt og gjør et lite kutt i den dårligere vena cava for å fjerne blodet.
- Plasser en 24-gauge angiocatheter i portalvenen og fyll leveren 10 ml / min med 40 ml fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,4 i et vannbad ved 4 ° C. Fjern og vei de samlede leverene og kutt den i små biter (10-15 mm).
MERK: Eutanasi induseres ved intraperitoneal injeksjon av ytterligere ketamin/xylazin (80 mg/kg: 8 mg/kg), etterfulgt av cervikal dislokasjon og åpning av brysthulen for å kollapse lungene. Denne metoden gir minst smerte og ubehag for dyrene. Denne metoden er i samsvar med anbefalingene fra eutanasipanelet i American Veterinary Medical Association. - Tilsett 4 ganger vekten av sukrose (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homogeniseringsbuffer (pH 7.4) supplert med komplette proteasehemmer Cocktailtabletter (se materialtabell) i henhold til produsentens anbefalinger. Homogeniser i et 15 ml polypropylenrør, ved hjelp av en generell laboratorievevshomogenisator på middels hastighet på is til den er jevn. Homogeniser på is for å forhindre at vevet blir varmt under homogenisering.
- Sentrifuger leveren homogenaterer ved 1500 x g i 10 minutter og hell deretter av supernatanten. Sentrifuger supernatanten i 1 time ved 100 000 x g. Snapfrys supernatanten og oppbevar ved -80 °C. Supernatanten er cytosolisk S-100.
- Trifluoroacetylering av S100 og JHDN5
MERK: Trifluoroacetylering av ε-aminogruppene av lysinrester av S-100 vil bli utført i henhold til prosedyren i Satoh18. Alle deler av dette eksperimentet med unntak av de siste dagene av dialyse utføres i avtrekkshetten.- Bestem den totale proteinkonsentrasjonen av cytosolisk S-100 ved hjelp av bicinchoninic acid assay (BCA-analysen)7. Fortynn 20 mg BALB/c mus S100 eller JHDN5 til 10 ml med dH2O i en 50 ml Erlenmeyer kolbe. Juster pH til 10 med 1N KOH.
- Tilsett 4,7 mmol S-etyltrifluorothioacetat (S-ETFA) til oppløsningen. Oppretthold pH mellom 9,9 og 10,0 med 1N KOH ved å administrere KOH på dråpemåte i ca. 1 time. Registrer totalt kohvolum for hver reaksjon.
- Overfør løsningene til separate dialysekassetter (Ikke overfyll). Dialyser kassettene i 72 timer mot 4 L dH2O med tre endringer per dag. Etter dialyse, registrer det endelige volumet av TFA-S100 eller TFA-JHDN5 og deretter aliquot i merkede rør. Snap frys og oppbevar ved –80 °C.
- En estimert konsentrasjon bestemmes ved å dele den opprinnelige mengden S100 eller JHDN5 (i mg) med det endelige volumet etter dialyse (ml). For å bestemme prosentvis modifikasjon av det opprinnelige proteinet19, fortynn 1,0 mg av hvert innfødt og TFA-endret protein (hvis den endelige konsentrasjonen er større enn 1,0 mg) til 1,0 ml med dH2O i separate kulerør og lag et emne ved bruk av 1,0 ml dH2O. Hvis konsentrasjonen av det TFA-endrede proteinet er mindre enn 1,0 mg, må det ikke fortynnes
- For å skille brønner på en 96 brønnplate, tilsett 50 μL av de tomme, innfødte og endrede proteiner. Tilsett 50 μL av 4% NaHCO3 etterfulgt av 50 μL av 0,1% 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre til hver brønn.
- Inkuber platen ved 40 °C i 2 timer. Etter inkubasjonen tilsettes 50 μL av 10 % SDS til hver brønn etterfulgt av 25 μL 1N HCl.
- Les ved OD på 334 nm og registrer deretter absorbans av hver forbindelse fra 200 - 600 nm for å bekrefte det karakteristiske fallet i absorbans ved 334 nm. Beregn prosentvis modifikasjon av lysinrester av TFA, ved hjelp av følgende formel:
2. Immunisering av mus for å indusere hepatitt
MERK: DIH er modellert i BALB / c mus ved immuniseringer med levercytosoliske proteiner som har blitt kovalent endret av trifluoracetylklorid (TFA), en modell medikamentmetabolitt, TFA-S1006 eller en epitop av CYP2E1 kovalent endret av TFA9, TFA-JHDN5 som induserer hepatitt, autoreaktive T-celler og CYP2E1 autoantistoffer. Mus utviser en miltaktiveringsfase 2 uker etter den første immuniseringen og en leverfase med 3 uker som er preget av granulocytisk betennelse. Kvinnelige BALB / c mus er mer utsatt enn menn for hepatitt i denne modellen.
- På dag 0 immuniserer du 6–8 uker gamle BALB/c-mus subkutant ved nakkebunnen med 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgert i like store mengder fullstendig Freunds adjuvans (CFA). På dag 0 immuniserer musene med 50 ng kikhostetoksin, intramuskulært i et av bakbenene. På dag 7 immuniserer musen subkutant ved bunnen av halen med enten 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgert i like store mengder CFA for å sikre at hver mus mottar to injeksjoner av samme immunogen.
MERK: Musene overvåkes hver time de første 6 timene etter immuniseringen og deretter minst to ganger daglig i en uke. Hvis musene viser tegn på smerte eller ubehag, som bøyd stilling eller rufset pels, bør analgetika administreres i samsvar med lokal ACUC. Hvis betydelig smerte eller nød er notert, bør musene vurderes av en veterinær for å avgjøre om eutanasi er nødvendig. - Bestemmelse av CD4+ T-celleimmunresponser mot hele selvproteiner, epitoper av selvproteiner eller TFA-hapten ved bruk av flowcytometri
- Etter sedasjon av mus med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin via intraperitoneal injeksjon, bekreft riktig anestesidybde som beskrevet i trinn 1.1.1 og identifiser deretter milten etter eksponering av intra-bukhulen ved hjelp av mikrokirurgisk saks. Skjær milten ved pedicle og legg i en petriskål med PBS / 2% føtal kalveserum (FCS).
MERK: Eutanasi vil bli indusert hos mus ved intraperitoneal injeksjon av ytterligere ketamin/xylazin (80 mg/kg: 8 mg/kg), etterfulgt av cervikal dislokasjon og åpning av brysthulen for å kollapse lungene. Denne metoden gir minst smerte og ubehag for dyrene. Denne metoden er i samsvar med anbefalingene fra eutanasipanelet i American Veterinary Medical Association. - Slipp cellene ved hjelp av frostede glassglass og overfør til et 50 ml konisk polypropylenrør. Vask med PBS/2 % FCS ved å bringe volumet opp til 50 ml og sentrifugere ved 335 x g ved hjelp av en stasjonær kjølesentrifuge. Hell av supernatanten og gjenta dette trinnet.
- Fjern røde blodlegemer med 1 ml ACK Lysing-buffer i 1 min og bring volum opp til 50 ml med PBS / 2% FCS. Sentrifuge ved 335 x g og hell av supernatanten.
- Tell cellene. Merk cellene med CFSE i 30 minutter på is i mørket, i henhold til produsentens instruksjoner. Suspender enkeltcellesuspensjoner i 6 brønnplater på 3x106 celler / ml per brønn i PBS / 2% FCS.
- Stimuler merkede celler med enten CYP2E1, JHDN5 eller TFA-OVA (10 μg/ml) i 72 timer ved 37 °C i 5 % CO2, 95 % luft (fuktet). Etter inkubering, flekker cellene med CD4-APC (1:100) i 30 minutter på is og analyser ved flowcytometri innen 3 dager.
- Bruk følgende gatingstrategi for å identifisere CD4+CFSE+-celler: CD4+CFSE+-celler vil bli identifisert fra de inngjerdede levende cellene og vist som histogrammer for prolifererende celler.
- Etter sedasjon av mus med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin via intraperitoneal injeksjon, bekreft riktig anestesidybde som beskrevet i trinn 1.1.1 og identifiser deretter milten etter eksponering av intra-bukhulen ved hjelp av mikrokirurgisk saks. Skjær milten ved pedicle og legg i en petriskål med PBS / 2% føtal kalveserum (FCS).
- Isolering av infiltrerende immunceller fra immuniserte mus.
- For å isolere infiltrerende immunceller i leveren på dag 14 eller dag 21, bedøve musene ved intraperitoneal injeksjon med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin og bekrefte riktig anestesidybde som beskrevet i trinn 1.1.1. Etter laparotomi ved hjelp av et midtlinjesnitt laget med mikrokirurgisk saks som beskrevet i 1.1.2, kanyler portalvenen med en 25 gauge nål og kutt deretter den nedre vena cava under nyrevenene.
- Tilfør hver lever med en strømningshastighet på 10 ml / min med 40 ml PBS i et vannbad 37 ° C. Etter perfusjon, ved hjelp av mikro kirurgisk saks, kutt leveren ved hepatisk pedicle, fjern galleblæren og kutt deretter leveren ved hilum.
- Forstyrre leveren på en maske rustfritt stålsikt ved hjelp av en 20 ml steril sprøytepestle og kald PBS. Filtrer den resulterende cellesuspensjonen i 50 ml presteriliserte sentrifugerør ved hjelp av en 300 mesh skjerm. Bring hver suspensjon til 50 ml med kald PBS og vask deretter suspensjonen ved sentrifugering i 10 minutter ved 370 x g.
- Kast supernatanten og samle deretter hver pellet ved behandling i nye 50 ml rør (Ett rør per mus anbefales, men hvis prøvene samles, anbefales 2-4 pellets / rør). Suspender de samlede pellets i 45 ml Percoll 35% (i PBS) og 100 IE / ml heparin.
- Spinn hvert rør ved 500 x g i 10 minutter ved 20 °C. Kast supernatanten og oppheng pelleten i 5 ml PBS og tilsett deretter 1 ml ACK-lysbuffer til hver pellet i 10 minutter på is.
- Ta hver slange til 50 ml med PBS og vask med sentrifugering i 10 minutter ved 370 x g. Kast supernatanten og vask deretter cellene med PBS/2% FCS ved sentrifugering i 10 minutter ved 370 x g. Tell cellene.
-
Analyse av celletype ved hjelp av flowcytometri
MERK: Her er et eksempel på hvordan induserte Foxp3 + Tregs kan oppdages.- Inkuber 1x106 celler med FcR-blokkerende reagens og flekk med 1:100 fortynninger av CD4-FITC, CD25-PE og CD45-PerCP i 30 minutter på is. Deretter flekker cellene intracellulært med FoxP3-APC.
- Fest cellene med 250 μL fikseringsbuffer (se materialtabell), og oppbevar ved 4 °C til analyse med flowcytometri innen 3 dager.
- Følgende gatingstrategi anbefales for å oppdage indusert Foxp3 + Tregs i enkeltcellesuspensjoner fra lever, milt eller lymfeknuter ved hjelp av flowcytometri: Identifiser levende celler ved hjelp av Live / Dead Fixable Aqua Dead Cell-flekksett. Deretter port på leverceller som er CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2), og gate CD4 + celler (FITC, klonGK1.5) fra CD45 + porten. Fra CD4+-cellene identifiserer du prosentandelen av CD25+(PE, klon 7D4) og FoxP3+-celler (APC, klon 3G3)-celler.
- Histologisk analyse av levervev for hepatitt
- På dag 21, fest leverseksjonene (5 μm tykk) i 10% nøytral bufret formalin og flekk med Hematoxylin &Eosin.
- Bestem histologipoeng først ved lav effekt (40X) i gjennomsnitt 2 visninger og bekreft ved 64X. Skår vevssnittene som følger: Grad 0 = ingen betennelse eller nekrose; Grad 1 = mindre lobulær betennelse uten nekrose; Grad 2 = lobulær betennelse som involverer <50% av seksjonen; Grad 3 = lobulær betennelse som involverer ≥ 50% av seksjonen; og grad 4=betennelse med nekrose.
- Bestemmelse av vev cytokin nivåer i milt og lever.
- På dag 14 eller dag 21 homogeniserer du lever- eller miltprøvene (1 g) fra hver mus i 1 ml RPMI / 2% FCS til den er jevn ved hjelp av en generell laboratoriehomogenisator på middels innstilling. Hold prøven kald på is.
- Sentrifuger homogenatet i 15 minutter ved 1455 x g ved 4 °C ved hjelp av en nedkjølt stasjonær sentrifuge. Snap frys supernatanten og oppbevar ved -80 °C til den er klar til bruk. Cytokin- og kjemokinnivåer kan måles med kommersielle ELISA-sett, i henhold til kitinstruksjoner. Standardiser nivåene av cytokiner ved å konvertere nivåene (i ml eller μL) til pg / g av vev.
- Påvisning av serumantistoffer mot CYP2E1, CYP2E1-epitopen JHDN5 og TFA-legemiddelmetabolitten.
- På dag 14 eller 21 seder musene med 40-60 mg/kg ketamin blandet med 4-6 mg/kg xylazin. Bekreft riktig dybde av anestesi ved å observere en reduksjon i muskeltonen og ingen respons på smertefulle stimuli, for eksempel en tåklemme (uttaksrefleks), i tillegg til tap av korrigerende reflekser og tap av palpebrale reflekser. Bruk en 25 G nål festet til en tuberkulinsprøyte og nærme hjertet ved å sakte føre nålen inn i brysthulen under ribbeina og umiddelbart lateralt til xiphoidprosessen. Samle blod ved hjelp av intrakardiell punktering.
- Når blodet er samlet, la det koagulere ved romtemperatur. Sentrifuger blodprøvene ved 295 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig seraen, aliquot seraen og knipsfrys ved -20 °C.
- Påfør 100 μL CYP2E1, JHDN5 eller TFA-ovalbumin (OVA) testantigener (5 μg / ml i PBS) til 96 brønnplater i minst 18 timer ved 4 ° C over natten. Neste dag vasker du platene med vaskebuffer (PBS / 2% FCS), 2 sykluser (4 vasker hver).
- Påfør 100 μL mus sera (1:100) i PBS / 2% FCS i tre eksemplarer på platene og inkuber ved romtemperatur i 2 timer. Etter 2 timer vasker du platene med vaskebuffer som beskrevet i trinn 2.6.2.
- Tilsett 100 μL alkalisk fosfatase (AKP)-geit anti-mus IgG, AKP-rotte anti-mus IgG1, eller AKP-rotte anti-mus IgG2a sekundære antistoffer (1:1000) i 2 timer etterfulgt av et vasketrinn på 1 syklus med vaskebuffer og 1 syklus med PBS. Detekter antistoffene ved hjelp av et AKP-substratsett og mål ved OD 405 nm hvert 15. minutt med et spektrofotometer. TFA utvikler seg vanligvis helt på 15 minutter, mens CYP2E1 og CYP2E1 epitopen kan utvikle seg fra 30 til 60 min7.
- Studier av utviklingen av JHDN5 IgG-indusert oksidativt stress in vitro.
- Bruk 12 brønnplater til å inkubere 106 terminalt differensierte leverceller per brønn på fibronektindekkede dekkslipper i 1000 μL Williams E-medier supplert med glutamin og generelt tilskudd (se materialtabell) ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet i 7 dager som anbefalt for å maksimere CYP2E1-aktiviteten.
- Tilsett JHDN5 IgG (1:40) eller muse-IgG (1:1000) for å skille brønner og inkubere i 2 timer ved 37 °C, 5 % CO2, 95 % fuktighet. Hybridoma sera var veldig fortynnet. Tilsett dyprød fluorescerende antistoffdetektor (se materialtabell) i ytterligere 30 minutter til alle brønner.
- Vask brønnene 3x med 1 ml PBS i mørket. Fest cellene i 3,7% formaldehyd i 10 minutter. Undersøk ved konfokal mikroskopi innen 24 timer.
- Samlokaliseringsstudier av JHDN5 IgG med intracellulære organeller som mitokondrier in vitro.
- For å demonstrere samlokalisering av JHDN5 IgG med mitokondrier, sparsomt kultur (~ 30% konfluens) terminalt differensierte leverceller på fibronektindekkede dekkslipper i 7 dager i fargefri Williams media E supplert som beskrevet i trinn 2.7.
- Etter å ha bestemt de riktige absorpsjonsbølgelengdene, tilsett grønn fluorescerende, 488 nm-konjugert mus IgG eller JHDN-5 (1: 100) og rød fluorescerende, 594-konjugert Mito-tracker Rød (1: 100) i 2 timer (37 ° C), 5% CO2, 95% fuktighet.
- Monter merkede fibronektindekkede dekselslipper med Anti-fade Reagent med DAPI, og undersøk ved konfokal mikroskopi.
3. Generelle protokollnotater
- Bruk ikke-farmasøytiske verktøy når forbindelser ikke er tilgjengelige i en klinisk bruksformulering. Få imidlertid hvert av disse verktøyene fra pålitelige kommersielle leverandører identifisert i denne metoden. Bruk alltid kjemikalier som samsvarer med spesifikasjonene definert av Komiteen for analytiske reagenser fra American Chemical Society på minst reagensgradnivået. For våre metoder, bruk analytiske karakternivåreagenser når det er mulig.
- Følg streng aseptisk teknikk for formulering av TFA-endrede proteiner for å forhindre forurensning som kan påvirke dyrevelferden eller tolkningen av data negativt.
- Oppbevar og bruk ikke-farmasøytiske formuleringer med varigheter der formuleringen vil forbli potent, i henhold til tilgjengelig teknisk informasjon. Oppbevar CFA ved romtemperatur, CYP2E1 og dets epitoper ved -20 eller -80 °C. Oppbevar TFA-endrede proteiner ved -80 °C og få lov til å komme til 4 °C før emulgering med CFA. Oppbevar TFA-endrede proteiner ved -80 °C og oppbevar i aliquots for å forhindre gjentatte fryse-tine-sykluser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immuniseringsplanen som brukes til å indusere DIH vist i figur 1 , representerer de to immuniseringene som kreves ved nakkebunnen (dag 0) og halebunnen (dag 7). Figur 2 viser representative proliferasjonsdata innhentet på dag 14 ved bruk av CFSE som respons på CYP2E1, JHDN5, CYP2E1-epitopen og trifluoroacetyl (TFA)-metabolitten i bedøvelsene. Figur 3 viser gatingstrategi og representativ flowcytometrianalyse av indusert CD4+CD25+FoxP3+ Tregs oppnådd på dag 14. Figur 4 viser representative hematoksylin- og eosinfargede lysbilder som viser utviklingen av hepatitt på dag 21 6. Figur 5 viser representative hematoksylin- og eosinfargede lysbilder som viser mer alvorlig hepatitt hos kvinnelige BALB/c-mus sammenlignet med hanner på dag 21, i tillegg til det komparative celleinnholdet i disse leverene10. Figur 6 viser representative konfokale mikroskopibilder som viser fravær av samlokalisering av muse-IgG med mitokondrier. Figur 7 viser representativ konfokal mikroskopi som viser samlokalisering av JHDN5 IgG med mitokondrier.
Figur 1: Immunisering av mus for å indusere hepatitt. DIH kan induseres hos kvinnelig BALB/c mus (som et eksempel) ved immunisering med TFA-JHDN5 (100 μg) emulgert i komplett Freunds adjuvans (CFA) subkutant (s.c.) ved nakkebunnen og 50 ng kikhostetoksin intramuskulært (dvs.m.) i bakbenet på dag 0 (trinn 1). På dag 7 kan BALB/c mus immuniseres med TFA-JHDN5 (100μg) emulgert i CFA (s.c.) ved bae i halen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bestemmelse av CD4+T-celleimmunresponser mot hele selvproteiner, epitoper av selvproteiner eller TFA-hapten ved bruk av flowcytometri. Enkeltcellesuspensjoner av splenocytter fra 6 – 8 uker gamle BALB/c mus isolert dag 14 etter den første immuniseringen, merket med CFSE, stimulert med TFA-OVA, CYP2E1 eller JHDN5 (10 μg/ml) i 72 timer ved 37 °C i 5 % CO2, 95 % luft (fuktet), farget med CD4-APC og analysert ved flowcytometri. Brønner uten antigen (media) ble brukt som kontroller. BALB/c mus utviklet spredning som respons på OVA-TFA og CYP2E1 og ikke JHDN5, sammenlignet med media. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gating-strategi for identifisering av CD4+CD25+FoxP3+-induserte Tregs ved hjelp av metoden beskrevet i 2.3.7. Den første porten identifiserer levende celler. For å oppdage immunceller ble CD45+ celler opprinnelig inngjerdet. Deretter ble CD4+ T-celler identifisert og inngjerdet, etterfulgt av identifisering av CD25+FoxP3+-celler i CD4+T-cellepopulasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk analyse av levervev for hepatitt. CFA-immuniserte mus (topppanel) ble brukt som kjøretøykontroller. S100-immuniserte mus (midtpanel) ble evaluert etter immuniseringer på samme skjema. På dag 21 ble mus avlivet, og leveren festet i formalin. Seksjon 5 μm tykk ble laget og farget med hematoksylin og eosin (H&E). Minimal leverbetennelse (blå celler) er påvist etter CFA (øverst) og S100 (midten) immuniseringer og store mengder betennelse etter immuniseringer med TFA-S100. (H&E, forstørrelse 64X). Dette tallet er brukt med tillatelse6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvinnelig BALB/c mus utvikler mer DIH sammenlignet med hann-BALB/c-mus. (A) Hunnmus (n = 8) hadde signifikant mer alvorlig hepatitt 3 uker etter TFA-S100/CFA-immuniseringer enn hanner (n = 7/gruppe). (B) Representative leversnitt fra hunn- og hannmus (H&E, forstørrelse 64X). (C) Antall hepatiske CD4+-, CD8+-, NK+- og NKT+-celler var signifikant høyere hos kvinner enn hos menn. Gjennomsnitt ± SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Dette tallet er brukt med tillatelse10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Muse-IgG samlokaliseres ikke med mitokondrier. Konfokalt bilde av terminalt differensierte leverceller farget med grønn fluorescerende (488 nm) -merket mus IgG (1:100) (grønn) i tillegg til rød fluorescerende (594) - merket Mitotracker Red (1:100). Grønn fluorescerende (488nm)-merket Mus IgG ikke co-lokalisering med Mitotracker Red (63X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: JHDN5 IgG samlokaliseres med mitokondrier. Konfokalt bilde av terminalt differensierte hepatiske stamceller farget med grønn fluorescerende (488) - merket JHDN-5 IgG (1: 100) i tillegg til rød fluorescerende (594) - merket Mitotracker Rød (1: 100). Grønn fluorescerende (488nm)-merket JHDN-5 IgG samlokaliseres med Mito-tracker Rød, demonstrert av den gule fargen på det representative bildet (63X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Styrken til denne protokollen hviler i dens reproduserbarhet; så det er viktig å følge de foreslåtte trinnene. Formulering av immunogen kan være en barriere for noen; Vi har imidlertid reprodusert modellen vår ved hjelp av epitopen beskrevet i vårt dokument, noe som fjerner behovet for å isolere S100-fraksjonen av leveren. Det er sannsynlig at ytterligere epitoper eller proteiner kan endres og indusere hepatitt etter vaksinasjoner; Vi beskriver imidlertid de proteinene vi har brukt med pålitelige resultater. Flere proteiner har vist seg å være trifluoroacetylert ved halogenert bedøvelseseksponering. Mest sannsynlig på grunn av epitopspredning, er noen av disse proteinene også mål for autoantistoffer i deres opprinnelige, ikke-trifluorecylert tilstand. Som et eksempel bærer E2-underenheten av pyruvat-dehydrogenasekomplekset (PDH-E2) epitoper (liposyreprotesegruppen) med en strukturell likhet med TFA-delen i TFA-addukter. Antistoffer generert hos pasienter med halotan hepatitt har vist seg å være kryssreaktive mot TFA-proteiner og PDH-E2 20,21.
Vår DIH-modell krever to immuniseringer som emulgeres i CFA langs baksiden av musene. Vi vet at footpad injeksjoner med CFA har vært assosiert med smerte og ubehag i musen. Derfor inkluderte utviklingen av den eksperimentelle DIH-modellen flere eksperimentelle forsøk. Da vi evaluerte modellen ved hjelp av en immunisering ved hjelp av CFA, med den andre immuniseringen ved hjelp av ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) eller IFA i begge injeksjonene med immunogenet vårt, utviklet det seg ikke leverbetennelse. I skarp kontrast, da vi immuniserte musene med immunogenet ved hjelp av to immuniseringer med CFA, var signifikant leverbetennelse tilstede. Den opprinnelige beskrivelsen av en annen modell for autoimmun hepatitt inkluderte studier som ligner på vår og krevde to immuniseringer med CFA for å demonstrere signifikant leverbetennelse8. Likevel revurderer vi kontinuerlig adjuvanser ved hjelp av litteratursøk for å forsøke å optimalisere betennelse uten CFA. Som et eksempel er det en kjent adjuvans Titer Max som vil øke B-celleresponsen; Men selv om antistoffer er en komponent i DIH, har vi og andre vist en kritisk rolle for T-celleresponser i vår modell14.
Utviklingen av pålitelige modeller letter undersøkelsene av patogenesen til DIH. Vi demonstrerer at leverhistologi og immunceller kan evalueres pålitelig på ulike stadier i denne modellen. Vi demonstrerer identifisering av antigenspesifikke T-celler, serumantistoffer og vevscytokiner som kan brukes til å studere utviklingen av DIH. Vi demonstrerer metodene for å isolere celler fra den betente leveren og foreslår bruk av heparin. Vi har imidlertid utført denne teknikken uten heparin, og resultatene kunne ikke skilles. I tillegg kan dagens metoder for vevsforstyrrelser også frigjøre celler fra leveren.
Nylig har vi brukt moderne verktøy som neste generasjons sekvensering og kvantitativ PCR og har opplevd reproduserbare resultater. Vi har publisert resultater angående DIH ved bruk av IL-4, IL-4-reseptor, IL-6, IL-6-reseptor IL-33 og ST2 mangelfull mus som alle ble avledet på en BALB / c-bakgrunn, slik at vi kan bruke BALB / c-musen som vår kontrollmus. Fremtidige anvendelser av denne modellen av DIH vil inkludere utvikling av banke i mus i tillegg til bruk av CRISPR-teknologi for å avdekke tidligere ukjente mekanismer som er ansvarlige for patogenesen til DIH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dr. Njoku vil gjerne anerkjenne Dr. Noel R. Rose, MD PhD, for hans veiledning og innsiktsfulle diskusjoner som resulterte i formuleringen av denne modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J.
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V.
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
