Summary
Vi beskriver en in vivo immunisering, translationell hepatitmodell hos BALB / c-möss som kan användas för att studera patogenesen av läkemedelsinducerad autoimmun hepatit inklusive könsskillnader som ses vid denna sjukdom. Vi kommer att beskriva hur denna modell visar reproducerbara analyser med hjälp av in vivo och in vitro experimentella tekniker.
Abstract
Läkemedelsinducerad autoimmun hepatit (DIH) är den vanligaste leverläkemedelsinducerade överkänslighetsprocessen som observerats hos cirka 9 till 12% av patienterna med autoimmun hepatit. Den överväldigande majoriteten av patienterna med DIH är kvinnor. De underliggande mekanismerna för dessa könsskillnader i prevalens är oklara på grund av bristen på djurmodeller som efterliknar mänsklig sjukdom. Trots det anses underliggande mekanismer allmänt vara associerade med humana leukocytantigenhaplotyper och könshormoner. Däremot har vi med hjälp av en DIH-musmodell avslöjat att IL-4-initierade CD4 + T-celler riktade mot en epitop av cytokrom P450 2E1 inducerar tillströmning av neutrofiler, makrofager och mastceller i levern hos kvinnliga BALB / c-möss. Med hjälp av denna modell har vi också visat att IL-33-inducerade FoxP3+regulatoriska T-celler ger skydd mot DIH hos hon- och hanmöss. Denna DIH-modell induceras genom att immunisera möss med en epitop av CYP2E1 som har förändrats kovalent med en läkemedelsmetabolit som har associerats med DIH. Denna epitop känns igen av patienter med DIH. Vår metod inducerar robust och reproducerbar hepatit och autoantikroppar som kan användas för att studera patogenesen av DIH. Medan in vivo-studier kan orsaka onödig smärta och nöd hos möss när de görs felaktigt, är fördelen med en in vivo-modell förmågan att utvärdera sjukdomspatogenesen hos ett stort antal möss. Dessutom kan biologiska effekter av de förändrade leverproteinerna studeras med invasiva procedurer. Tillägget av in vitro-studier till den experimentella designen möjliggör snabb upprepning och mekanistisk analys på cellnivå. Således kommer vi att demonstrera vårt modellprotokoll och hur det kan användas för att studera in vivo- och in vitro-mekanismer för DIH.
Introduction
Syftet med denna metod är att beskriva en musmodell av läkemedelsinducerad autoimmun hepatit som utvecklas in vivo och visa hur den kan användas för att undersöka den molekylära, immunologiska och genetiska grunden för denna sjukdom. Det långsiktiga målet med våra studier är att avslöja mekanismer som är ansvariga för utvecklingen av kronisk leverinflammation och skada genom att studera DIH hos mottagliga patienter. Leversjukdom och skrumplever utgör den sjätte vanligaste dödsorsaken hos vuxna mellan 25 och 64 år. Idiosynkratisk DILI, ibland kallad läkemedelsinducerad autoimmun hepatit (DIH) är den tredje vanligaste orsaken till akut leversvikt i USA. DIH är den vanligaste leverläkemedelsinducerade överkänslighetsprocessen som observerats hos cirka 9 till 12% av patienterna med autoimmun hepatit1. Den överväldigande majoriteten av patienterna med DIH är kvinnor 2,3,4. En typ av DIH utvecklas hos mottagliga individer efter administrering av halogenerade flyktiga anestetika såsom isofluran, sevofluran, desfluran eller halotan. Dessa anestetika binder kovalent till leverproteiner med reaktiva produkter av deras metabolism, vilket skapar nya autoantigener som kan framkalla allergiska eller autoimmuna svar5.
Studien av patogena mekanismer som är involverade i utvecklingen av bedövningsmedel och någon form av DIH har tidigare hindrats av bristen på en djurmodell som nära efterliknar induktionen av mänsklig sjukdom. Vi har utvecklat en experimentell murinmodell av DIH med funktioner som liknar immunmedierad DILI hos patienter. Hepatit induceras genom immunisering med en av två autoantigen som har modifierats kovalent av metaboliten trifluoracetylklorid (TFA) som bildas efter oxidativ metabolism av bedövningen av enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Ett autoantigen är den hepatiska cytosoliska S100-leverfraktionen, som är en blandning av flera proteiner6, och den andra autoanten är en epitop av CYP2E1 som känns igen av sera från patienter med bedövande immunmedierad DILI7. Genom att använda BALB/c-möss, som är relativt resistenta mot experimentell autoimmun hepatit, skiljer vi vår modell från den S100-inducerade immuniseringsmodellen av autoimmun hepatit hos C57Bl/6J-möss8.
På grund av dess olika kliniska presentationer är DIH svårt att studera hos patienter. Translationella experimentella modeller erbjuder förmågan att utvärdera patogenesen av sjukdom in vivo och in vitro. För närvarande finns det inga andra alternativa metoder för att inducera digitala innovationsknutpunkter som fullständigt undersöker adaptiva eller medfödda immunsvar in vivo eller in vitro utan användning av djur. Dessutom, eftersom trifluoracetylering av S-100 eller CYP2E1-epitopen inte verkar producera ett irriterande immunogen, och vi inducerar DIH genom immunisering med TFA-förändrade proteiner, kommer dessa djur inte att få eter, något halogenerat bedövningsmedel, barbiturat eller alkohol före immunisering eller andra förfaranden, med tanke på att dessa medel kan förändra parametrarna vi studerar. Trots det har vi minskat vår musanvändning genom att använda datorsimulering för att bekräfta bindningspreferenserna för vår upptäckta CYP2E1-epitop9 och har speglat mänsklig DIH som involverar kvinnligt kön genom att visa att kvinnliga BALB / c-möss utvecklar en svårare DIH10.
Trots olika presentationer av DIH hos patienter och utmaningar i studien av klinisk sjukdom är post-translationell modifiering av inhemska proteiner med reaktiva läkemedelsmetaboliter en accepterad nyckelmekanism i patogenesen DIH som följer halogenerade anestetika11. Utredarna accepterar också att CYP2E1 är ett viktigt autoantigen i denna process 12,13. Rollen av interleukin (IL) -4-uppreglerade CD4 + T-celler som känner igen en post-translationellt modifierad CYP2E1 och andra leverproteiner är en accepterad initiativtagare till anestetisk DIH genom att locka neutrofiler, eosinofiler och mastceller i levern14, och denna mekanism har bekräftats i många former av DIH15,16. Inducerade FoxP3-uttryckande CD4 + CD25 + T-celler (Tregs) minskar svårighetsgraden av DIH, och relativa brister hos dessa celler i mjälten förvärrar DIH 10,7. Således har majoriteten av framstegen när det gäller att förstå DIH möjliggjorts genom att använda in vivo-musmodeller för att utvärdera de genetiska, metaboliska och immunologiska mekanismerna för DIH både in vivo och in vitro.
Eftersom vi och andra utredare har avslöjat roller för IL-4, neutrofiler och eosinofiler vid initiering av DIH med olika musmodeller, tror vi att denna observation stöder vårt påstående att oavsett vilken DIH-modell som används, induceras hepatit och skada av IL-4. Styrkan i vårt protokoll ligger i användningen av in vivo-metodik, både manliga och kvinnliga möss, och upprepning av histologi, CD4 + T-cellproliferationsanalyser och cytokiner. Styrkan i vår användning av in vitro-studier är att de minskar antalet möss som behövs samtidigt som de tillhandahåller metoden för att isolera cellulära interaktioner som driver DIH. Vi rekommenderar användning av han- och honmöss eftersom detta minskar risken för omedveten bias vid tolkning av resultat och stärker översättningspotentialen i våra studier eftersom förekomsten, prevalensen och svårighetsgraden av DIH är högre hos kvinnor17. Vi rekommenderar att möss erhålls från en enda leverantör; men om detta inte är möjligt, skaffa kullkompiskontroller eller vildtypsmöss från samma leverantör som de genetiskt förändrade mössen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av djurvårds- och användningskommittén.
1. Trifluoracetylering av hepatiska S-100 cytosoliska proteiner eller en CYP2E1 epitop
OBS: Förbered först trifluoracetylerad S100 (TFA-S100) och trifluoracetylerad CYP2E1-epitop (TFA-JHDN5). Eftersom syngena S100-proteiner behövs för immuniseringar, och BALB / c-möss krävs för att producera immunogen. Preparatet ger en stor mängd immunogen; så räkna med att utföra denna del cirka fyra gånger om året. En identisk metod kommer att användas för att göra TFA-JHDN5. CYP2E1-epitopen (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, kan sekvenseras eller köpas.
- Isolering av S100-fraktionen av levern.
- Efter sedering av 5 - 10 BALB / c-möss med 40-60 mg / kg ketamin blandat med 4 - 6 mg / kg xylazin, bekräfta korrekt anestesidjup genom att observera en minskning av muskeltonen och inget svar på smärtsamma stimuli, såsom en tånypa (abstinensreflex), förutom förlusten av rätande reflexer och förlusten av palpebrala reflexer.
- Använd mikrokirurgisk sax, exponera det intra-abdominala innehållet med ett snitt i mittlinjen och gör ett litet snitt i den underlägsna vena cava för att ta bort blodet.
- Placera en 24-gauge angiokateter i portalvenen och persuera levern 10 ml/min med 40 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4 i ett vattenbad vid 4 °C. Ta bort och väg de sammanslagna leverna och skär den i små bitar (10 - 15 mm).
OBS: Eutanasi induceras genom intraperitoneal injektion av ytterligare ketamin/ xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg), följt av cervikal dislokation och öppning av bröstkaviteten för att kollapsa lungorna. Denna metod ger minst smärta och obehag för djuren. Denna metod överensstämmer med rekommendationerna från panelen för eutanasi från American Veterinary Medical Association. - Tillsätt 4 gånger vikten av sackaros (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homogeniseringsbuffert (pH 7,4) kompletterad med Komplett proteashämmare Cocktailtabletter (se materialtabell) enligt tillverkarens rekommendationer. Homogenisera i ett 15 ml polypropenrör med användning av en allmän laboratorievävnadshomogenisator på medelhastighet på is tills den är jämn. Homogenisera på is för att förhindra att vävnaden blir varm under homogenisering.
- Centrifugera leverhomogenaten vid 1500 x g i 10 min och häll sedan av supernatanten. Centrifugera supernatanten i 1 timme vid 100 000 x g. Snäpp in supernatanten och förvara vid -80 °C. Supernatanten är cytosolisk S-100.
- Trifluoracetylering av S100 och JHDN5
OBS: Trifluoracetylering av de ε-aminogrupperna av lysinrester av S-100 kommer att utföras enligt proceduren för Satoh18. Alla delar av detta experiment med undantag för de sista dagarna av dialys utförs i dragskåpet.- Bestäm den totala proteinkoncentrationen av den cytosoliska S-100 med användning av bicinchoninsyraanalysen (BCA-analys)7. Späd 20 mg BALB/c mus S100 eller JHDN5 till 10 ml meddH2Oi en 50 ml Erlenmeyerkolv. Justera pH till 10 med 1N KOH.
- Tillsätt 4,7 mmol S-etyltrifluortioacetat (S-ETFA) till lösningen. Håll pH mellan 9,9 – 10,0 med 1N KOH genom att administrera KOH i droppform i cirka 1 h. Registrera den totala volymen KOH för varje reaktion.
- Överför lösningarna till separata dialyskassetter (Överfyll inte). Dialysera kassetterna i 72 h mot 4 L dH2O med tre byten per dag. Efter dialys, registrera den slutliga volymen av TFA-S100 eller TFA-JHDN5 och sedan alikvotera i märkta rör. Snäppfrys och förvara vid –80 °C.
- En uppskattad koncentration bestäms genom att dividera den ursprungliga mängden S100 eller JHDN5 (i mg) med den slutliga volymen efter dialys (ml). För att bestämma procentmodifieringen av det inhemska proteinet19, späd 1,0 mg av varje inbyggt och TFA-förändrat protein (om den slutliga koncentrationen är större än 1,0 mg) till 1,0 ml meddH2Oi separata kulrör och förbered ett ämne med 1,0 mldH2O. Om koncentrationen av det TFA-förändrade proteinet är mindre än 1,0 mg, späd inte ut
- För att separera brunnar på en 96-brunnsplatta, tillsätt 50 μL av de tomma, infödda och förändrade proteinerna. Tillsätt 50 μL 4% NaHCO3 följt av 50 μL 0,1% 2,4,6-trinitrobensensulfonsyra till varje brunn.
- Inkubera plattan vid 40 °C i 2 timmar. Efter inkubationen tillsätt 50 μl 10 % SDS till varje brunn följt av 25 μl 1N HCl.
- Läs av vid OD på 334 nm och registrera sedan absorbansen för varje förening från 200 till 600 nm för att bekräfta den karakteristiska minskningen av absorbansen vid 334 nm. Beräkna den procentuella modifieringen av lysinrester med TFA med hjälp av följande formel:
2. Immunisering av möss för att inducera hepatit
OBS: DIH modelleras i BALB / c-möss genom immuniseringar med levercytosoliska proteiner som har förändrats kovalent av trifluoracetylklorid (TFA), en modellläkemedelsmetabolit, TFA-S1006 eller en epitop av CYP2E1 kovalent förändrad av TFA9, TFA-JHDN5 som inducerar hepatit, autoreaktiva T-celler och CYP2E1-autoantikroppar. Möss uppvisar en mjältaktiveringsfas 2 veckor efter den första immuniseringen och en leverfas med 3 veckor som kännetecknas av granulocytisk inflammation. Kvinnliga BALB / c-möss är mer mottagliga än män för hepatit i denna modell.
- På dag 0, immunisera 6–8 veckor gamla BALB / c-möss subkutant vid basen av nacken med 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgerad i lika stora volymer av komplett Freunds adjuvans (CFA). På dag 0, immunisera mössen med 50 ng kikhosttoxin, intramuskulärt i ett av bakbenen. På dag 7, immunisera mössen subkutant vid svansens botten med antingen 200 μg TFA-S100 eller 100 μg TFA-JHDN5 emulgerad i lika stora volymer CFA för att säkerställa att varje mus får två injektioner av samma immunogen.
OBS: Mössen övervakas varje timme under de första 6 timmarna efter immuniseringen och sedan minst två gånger dagligen i en vecka. Om mössen visar tecken på smärta eller ångest, såsom böjd hållning eller volangpäls, ska smärtstillande medel administreras i enlighet med den lokala ACUC. Om betydande smärta eller ångest noteras bör mössen utvärderas av en veterinär för att avgöra om eutanasi är nödvändig. - Bestämning av CD4 + T-cellsimmunsvar mot hela självproteiner, epitoper av självproteiner eller TFA-hapten med hjälp av flödescytometri
- Efter sedering av möss med 40-60 mg/kg ketamin blandat med 4-6 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion, bekräfta rätt anestesidjup enligt beskrivningen i steg 1.1.1 och identifiera sedan mjälten efter exponering av den intraabdominella håligheten med hjälp av mikrokirurgisk sax. Skär mjälten vid pedikeln och lägg i en petriskål med PBS/2% fetalt kalvserum (FCS).
OBS: Eutanasi kommer att induceras hos mössen genom intraperitoneal injektion av ytterligare ketamin / xylazin (80 mg / kg: 8 mg / kg), följt av cervikal dislokation och öppning av bröstkaviteten för att kollapsa lungorna. Denna metod ger minst smärta och obehag för djuren. Denna metod överensstämmer med rekommendationerna från panelen för eutanasi från American Veterinary Medical Association. - Släpp cellerna med frostat glasglas och överför till ett 50 ml koniskt polypropenrör. Tvätta med PBS/2% FCS genom att föra volymen upp till 50 ml och centrifugera vid 335 x g med en kylcentrifug på bänkskivan. Häll av supernatanten och upprepa detta steg.
- Ta bort röda blodkroppar med 1 ml ACK Lysing-buffert i 1 min och få volym upp till 50 ml med PBS/2% FCS. Centrifugera vid 335 x g och häll av supernatanten.
- Räkna cellerna. Märk cellerna med CFSE i 30 minuter på is i mörkret, enligt tillverkarens instruktioner. Suspendera encellssuspensioner i 6 brunnsplattor med 3x106 celler/ml per brunn i PBS/2% FCS.
- Stimulera märkta celler med antingen CYP2E1, JHDN5 eller TFA-OVA (10 μg / ml) i 72 timmar vid 37 ° C i 5% CO2, 95% luft (fuktad). Efter inkubation, färga cellerna med CD4-APC (1:100) i 30 min på is och analysera med flödescytometri inom 3 dagar.
- Använd följande gating-strategi för att identifiera CD4 + CFSE + -celler: CD4 + CFSE + -celler kommer att identifieras från de gated levande cellerna och visas som histogram av prolifererande celler.
- Efter sedering av möss med 40-60 mg/kg ketamin blandat med 4-6 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion, bekräfta rätt anestesidjup enligt beskrivningen i steg 1.1.1 och identifiera sedan mjälten efter exponering av den intraabdominella håligheten med hjälp av mikrokirurgisk sax. Skär mjälten vid pedikeln och lägg i en petriskål med PBS/2% fetalt kalvserum (FCS).
- Isolering av infiltrerande immunceller från immuniserade möss.
- För att isolera infiltrerande immunceller i levern på dag 14 eller dag 21, bedöva mössen genom intraperitoneal injektion med 40-60 mg / kg ketamin blandat med 4-6 mg / kg xylazin och bekräfta rätt anestesidjup enligt beskrivningen i steg 1.1.1. Efter laparotomi med hjälp av ett snitt i mittlinjen gjord med mikrokirurgisk sax enligt beskrivningen i 1.1.2, kannulera portalvenen med en 25 gauge nål och skär sedan den underlägsna vena cava under njurvenerna.
- Perfusera varje lever med en flödeshastighet på 10 ml/min med 40 ml PBS i ett vattenbad på 37 °C. Efter perfusion, med hjälp av mikrokirurgisk sax, skär levern vid leverpedikeln, ta bort gallblåsan och skär sedan levern vid hilum.
- Stör levern på en nätsikt i rostfritt stål med en 20 ml steril sprutstöt och kall PBS. Filtrera den resulterande cellsuspensionen i 50 ml försteriliserade centrifugrör med en 300-nätskärm. Bringa varje suspension till 50 ml med kall PBS och tvätta sedan suspensionen genom centrifugering i 10 min vid 370 x g.
- Kassera supernatanten och slå sedan ihop varje pellet genom behandling i nya 50 ml rör (Ett rör per mus rekommenderas; om proverna slås samman rekommenderas dock 2-4 pellets/rör). Suspendera de poolade pelletsen i 45 ml Percoll 35% (i PBS) och 100 IE / ml heparin.
- Snurra varje rör vid 500 x g i 10 min vid 20 °C. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 5 ml PBS och tillsätt sedan 1 ml ACK-lyseringsbuffert till varje pellet i 10 minuter på is.
- Bringa varje rör till 50 ml med PBS och tvätta genom centrifugering i 10 min vid 370 x g. Kassera supernatanten och tvätta sedan cellerna med PBS/2% FCS genom centrifugering i 10 min vid 370 x g. Räkna cellerna.
-
Analys av celltyp med hjälp av flödescytometri
OBS: Här är ett exempel på hur inducerade Foxp3 + Tregs kan detekteras.- Inkubera 1x106 celler med FcR-blockerande reagens och fläck med 1:100 utspädningar av CD4-FITC, CD25-PE och CD45-PerCP i 30 min på is. Därefter färgar cellerna intracellulärt med FoxP3-APC.
- Fixera cellerna med 250 μL fixeringsbuffert (se materialtabell) och förvara vid 4 °C tills de analyseras med flödescytometri inom 3 dagar.
- Följande grindstrategi rekommenderas för att detektera inducerade Foxp3+Tregs i encellssuspensioner från lever, mjälte eller lymfkörtlar med hjälp av flödescytometri: Identifiera levande celler med hjälp av Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit. Därefter grind på leverceller som är CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2) och grind CD4 + -celler (FITC, cloneGK1.5) från CD45 + -porten. Från CD4 + -cellerna identifierar du procentandelarna av CD25 + (PE, klon 7D4) och FoxP3 + (APC, klon 3G3) celler.
- Histologisk analys av levervävnader för hepatit
- På dag 21, fixa leversektionerna (5 μm tjocka) i 10% neutralt buffrat formalin och fläcka med Hematoxylin &Eosin.
- Bestäm histologipoäng först vid låg effekt (40X) i genomsnitt 2 visningar och bekräfta vid 64X. Poängsätt vävnadssektionerna enligt följande: Grad 0 = ingen inflammation eller nekros; Grad 1 = mindre lobulär inflammation utan nekros; Grad 2 = lobulär inflammation som involverar <50% av sektionen; Grad 3 = lobulär inflammation som involverar ≥ 50% av sektionen; och grad 4 = inflammation med nekros.
- Bestämning av vävnadscytokinnivåer i mjälte och lever.
- På dag 14 eller dag 21, homogenisera lever- eller mjältproverna (1 g) från varje mus i 1 ml RPMI/2% FCS tills det är jämnt med hjälp av en allmän laboratoriehomogenisator på mediuminställning. Håll provet kallt på is.
- Centrifugera homogenatet i 15 minuter vid 1455 x g vid 4 °C med hjälp av en kyld stationär centrifug. Snäpp in supernatanten och förvara vid -80 °C tills den är klar att användas. Cytokin- och kemokinnivåer kan mätas med kommersiella ELISA-kit, enligt kitinstruktionerna. Standardisera nivåerna av cytokiner genom att omvandla nivåerna (i ml eller μl) till pg / g vävnad.
- Detektion av serumantikroppar mot CYP2E1, CYP2E1-epitopen JHDN5 och TFA-läkemedelsmetaboliten.
- Dag 14 eller 21, lugna mössen med 40-60 mg/kg ketamin blandat med 4-6 mg/kg xylazin. Bekräfta korrekt anestesidjup genom att observera en minskning av muskeltonen och inget svar på smärtsamma stimuli, såsom en tånypa (abstinensreflex), förutom förlusten av rätande reflexer och förlusten av palpebrala reflexer. Använd en 25 G nål fäst vid en tuberkulinspruta och närma dig hjärtat genom att långsamt föra nålen in i brösthålan under revbenen och omedelbart i sidled till xiphoidprocessen. Samla blod med intrakardiell punktering.
- När blod har samlats in, låt det koagulera vid rumstemperatur. Centrifugera blodproverna vid 295 x g i 20 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort serumen, alikvotera serumen och snäpp frys vid -20 °C.
- Applicera 100 μl CYP2E1-, JHDN5- eller TFA-ovalbumintestantigener (OVA) (5 μg/ml i PBS) på 96 brunnsplattor i minst 18 timmar vid 4 °C över natten. Nästa dag, tvätta plattorna med tvättbuffert (PBS/2%FCS), 2 cykler (4 tvättar vardera).
- Applicera 100 μl mussera (1:100) i PBS/2% FCS i tre exemplar på plattorna och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar. Tvätta plattorna efter 2 timmar med tvättbuffert enligt beskrivningen i steg 2.6.2.
- Tillsätt 100 μL alkaliskt fosfatas (AKP)-get-anti-mus IgG, AKP-råtta antimus IgG1 eller AKP-råtta antimus IgG2a sekundära antikroppar (1:1000) i 2 timmar följt av ett tvättsteg på 1 cykel med tvättbuffert och 1 cykel med PBS. Detektera antikropparna med hjälp av ett AKP-substratkit och mät vid OD 405 nm var 15: e minut med en spektrofotometer. TFA utvecklas vanligtvis helt på 15 min medan CYP2E1 och CYP2E1-epitopen kan utvecklas från 30 till 60 min7.
- Studier av utvecklingen av JHDN5 IgG-inducerad oxidativ stress in vitro.
- Använd 12 brunnsplattor, inkubera 106 terminalt differentierade leverceller per brunn på fibronektintäckta täckslips i 1000 μL Williams E-media kompletterat med glutamin och allmänt tillskott (se materialtabell) vid 37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet i 7 dagar som rekommenderas för att maximera CYP2E1-aktiviteten.
- Tillsätt JHDN5 IgG (1:40) eller mus IgG (1:1000) för att separera brunnar och inkubera i 2 timmar vid 37 °C, 5 % CO2, 95 % luftfuktighet. Hybridom sera var mycket utspädd. Tillsätt djupröd fluorescerande antikroppsdetektor (se materialtabell) i ytterligare 30 minuter till alla brunnar.
- Tvätta brunnarna 3x med 1 ml PBS i mörkret. Fixa cellerna i 3,7% formaldehyd i 10 min. Undersök med konfokalmikroskopi inom 24 timmar.
- Samlokaliseringsstudier av JHDN5 IgG med intracellulära organeller såsom mitokondrier in vitro.
- För att demonstrera samlokalisering av JHDN5 IgG med mitokondrier, gles odling (~ 30% sammanflöde) terminalt differentierade leverceller på fibronektintäckta täckglidningar i 7 dagar i färgfria Williams media E kompletterat enligt beskrivningen i steg 2.7.
- Efter bestämning av rätt absorptionsvåglängder, tillsätt grön fluorescerande, 488 nm -konjugerad mus IgG eller JHDN-5 (1:100) och röd fluorescerande, 594-konjugerad Mito-tracker Röd (1:100) i 2 h (37 ° C), 5% CO2, 95% luftfuktighet.
- Montera märkta fibronektintäckta täckslips med Anti-fade Reagent med DAPI och undersök med konfokalmikroskopi.
3. Allmänna protokollanteckningar
- Använd icke-farmaceutisk kvalitet verktyg när föreningar inte är tillgängliga i en klinisk användning formulering. Få dock vart och ett av dessa verktyg från pålitliga kommersiella leverantörer som identifieras i denna metod. Använd alltid kemikalier som överensstämmer med specifikationer som fastställts av Committee on Analytical Reagents of the American Chemical Society på minst reagensnivå. För våra metoder, använd reagenser på analytisk kvalitetsnivå när det är möjligt.
- Följ strikt aseptisk teknik för formulering av TFA-förändrade proteiner för att förhindra kontaminering som kan påverka djurens välbefinnande eller tolkningen av data negativt.
- Lagra och använd icke-farmaceutiska formuleringar på varaktigheter för vilka formuleringen kommer att förbli potent, enligt tillgänglig teknisk information. Förvara CFA vid rumstemperatur, CYP2E1 och dess epitoper vid -20 eller -80 °C. Förvara TFA-förändrade proteiner vid -80 °C och tillåts komma till 4 °C före emulgering med CFA. Förvara TFA-förändrade proteiner vid -80 °C och förvara i alikvoter för att förhindra upprepade frys-tina cykler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immuniseringsschemat som används för att inducera DIH som visas i figur 1 representerar de två immuniseringar som krävs vid basen av nacken (dag 0) och svansens bas (dag 7). Figur 2 visar representativa proliferationsdata som erhållits på dag 14 med CFSE som svar på CYP2E1, JHDN5, CYP2E1-epitopen och trifluoracetyl (TFA) metaboliten av anestetika. Figur 3 visar gatingstrategin och representativ flödescytometrianalys av inducerad CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs erhållen på dag 14. Figur 4 visar representativa hematoxylin- och eosinfärgade diabilder som visar utvecklingen av hepatit på dag 21 6. Figur 5 visar representativa hematoxylin- och eosinfärgade objektglas som visar allvarligare hepatit hos kvinnliga BALB/c-möss jämfört med män på dag 21 utöver det jämförande cellinnehållet i dessa lever10. Figur 6 visar representativa konfokalmikroskopiglas som visar frånvaron av samlokalisering av mus-IgG med mitokondrier. Figur 7 visar representativ konfokalmikroskopi som visar samlokalisering av JHDN5 IgG med mitokondrier.
Figur 1: Immunisering av möss för att inducera hepatit. DIH kan induceras hos kvinnliga BALB / c-möss (som ett exempel) genom immunisering med TFA-JHDN5 (100 μg) emulgerat i komplett Freunds adjuvans (CFA) subkutant (sc) vid basen av nacken och 50 ng kikhosttoxin intramuskulärt (i.m.) i bakbenet på dag 0 (steg 1). På dag 7 kan BALB/c-möss sedan immuniseras med TFA-JHDN5 (100μg) emulgerat i CFA (s.c.) vid svansens bae. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bestämning av CD4 + T-cellsimmunsvar mot hela självproteiner, epitoper av självproteiner eller TFA-hapten med hjälp av flödescytometri. Encellssuspensioner av splenocyter från 6 - 8 veckor gamla BALB / c-möss isolerade dag 14 efter den initiala immuniseringen, märkta med CFSE, stimulerade med TFA-OVA, CYP2E1 eller JHDN5 (10 μg / ml) i 72 timmar vid 37 ° C i 5% CO2, 95% luft (fuktad), färgad med CD4-APC och analyserad med flödescytometri. Brunnar utan antigen (media) användes som kontroller. BALB/c-möss utvecklade spridning som svar på OVA-TFA och CYP2E1 och inte JHDN5, jämfört med media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Grindstrategi för identifiering av CD4+CD25+FoxP3+-inducerade Tregs med den metod som beskrivs i 2.3.7. Den första porten identifierar levande celler. För att upptäcka immunceller var CD45 + -celler initialt gated. Därefter identifierades och gated identifierades CD4 + T-celler, följt av identifiering av CD25 + FoxP3 + -celler inom CD4 + T-cellpopulationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologisk analys av levervävnader för hepatit. CFA-immuniserade möss (topppanel) användes som fordonskontroller. S100-immuniserade möss (mittpanel) utvärderades efter immuniseringar enligt samma schema. På dag 21 avlivades möss och levern fixerades i formalin. Sektioner 5 μm tjocka gjordes och färgades med hematoxylin och eosin (H&E). Minimal leverinflammation (blå celler) demonstreras efter CFA (överst) och S100 (mitten) immuniseringar och stora mängder inflammation efter immuniseringar med TFA-S100. (H&E, förstoring 64X). Denna siffra används med tillstånd6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kvinnliga BALB/c-möss utvecklar mer DIH jämfört med manliga BALB/c-möss. (A) Honmöss (n = 8) hade signifikant svårare hepatit 3 veckor efter TFA-S100/CFA-immuniseringar än män (n = 7/grupp). (B) Representativa leversektioner från hon- och hanmöss (H&E, förstoring 64X). (C) Antalet hepatiska CD4+-, CD8+-, NK+ och NKT+-celler var signifikant högre hos kvinnor än hos män. *p<0<05, **p<0.01, ***p<0.001. ± Denna siffra används med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Mus-IgG samlokaliseras inte med mitokondrier. Konfokal bild av terminalt differentierade leverceller färgade med grön fluorescerande (488nm) -märkt mus IgG (1:100) (grön) förutom röd fluorescerande (594) - märkt Mitotracker Red (1:100). Grön fluorescerande (488nm) - märkt Mus IgG lokaliseras inte tillsammans med Mitotracker Red (63X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: JHDN5 IgG samlokaliseras med mitokondrier. Konfokal bild av terminalt differentierade leverprogenitorceller färgade med grön fluorescerande (488) - märkt JHDN-5 IgG (1: 100) förutom röd fluorescerande (594) - märkt Mitotracker Red (1: 100). Grön fluorescerande (488nm) - märkt JHDN-5 IgG samlokaliseras med Mito-tracker Red, vilket demonstreras av den gula nyansen på den representativa bilden (63X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Styrkan i detta protokoll ligger i dess reproducerbarhet; så det är viktigt att följa de föreslagna stegen. Formulering av immunogen kan vara en barriär för vissa; Vi har dock reproducerat vår modell med hjälp av epitopen som beskrivs i vårt dokument, vilket tar bort behovet av att isolera S100-fraktionen av levern. Det är troligt att ytterligare epitoper eller proteiner kan förändras och inducera hepatit efter immuniseringar; vi beskriver dock de proteiner som vi har använt med tillförlitliga resultat. Flera proteiner har visat sig vara trifluoracetylerade vid exponering för halogenerat bedövningsmedel. Troligtvis på grund av epitopspridning är några av dessa proteiner också mål för autoantikroppar i deras ursprungliga, icke-trifluoracetylerade tillstånd. Som ett exempel bär E2-underenheten i pyruvatdehydrogenaskomplexet (PDH-E2) epitoper (liponsyraprotesgruppen) med en strukturell likhet med TFA-delen i TFA-addukter. Antikroppar som genereras hos patienter med halotanhepatit har visat sig vara korsreaktiva mot TFA-proteiner och PDH-E2 20,21.
Vår DIH-modell kräver två immuniseringar som emulgeras i CFA längs mössens baksida. Vi vet att fotdynainjektioner med CFA har associerats med smärta och ångest i musen. Därför inkluderade utvecklingen av den experimentella DIH-modellen flera experimentella prövningar. När vi utvärderade modellen med en immunisering med CFA, med den andra immuniseringen med ofullständig Freunds adjuvans (IFA) eller IFA i båda injektionerna med vårt immungen, utvecklades inte leverinflammation. I skarp kontrast, när vi immuniserade mössen med immunogen med hjälp av två immuniseringar med CFA, var signifikant leverinflammation närvarande. Den ursprungliga beskrivningen av en annan modell av autoimmun hepatit inkluderade studier som liknar vår och krävde två immuniseringar med CFA för att visa signifikant leverinflammation8. Trots det omvärderar vi kontinuerligt adjuvanser med hjälp av litteratursökningar för att försöka optimera inflammation utan CFA. Som ett exempel finns det ett välkänt adjuvans Titer Max som skulle öka B-cellsvar; men även om antikroppar är en komponent i DIH, har vi och andra visat en kritisk roll för T-cellsvar i vår modell14.
Utvecklingen av tillförlitliga modeller underlättar undersökningarna av patogenesen av DIH. Vi visar att leverhistologi och immunceller kan utvärderas på ett tillförlitligt sätt i olika stadier i denna modell. Vi visar identifiering av antigenspecifika T-celler, serumantikroppar och vävnadscytokiner som kan användas för att studera utvecklingen av DIH. Vi demonstrerar metoderna för att isolera celler från den inflammerade levern och föreslår användning av heparin. Vi har dock utfört denna teknik utan heparin och resultaten var oskiljbara. Dessutom kan nuvarande metoder för vävnadsstörning också frigöra celler från levern.
Nyligen har vi använt moderna verktyg som nästa generations sekvensering och kvantitativ PCR och har upplevt reproducerbara resultat. Vi har publicerat resultat avseende DIH med IL-4, IL-4-receptor, IL-6, IL-6-receptor IL-33 och ST2 bristfälliga möss som alla härleddes på en BALB / c-bakgrund så att vi kan använda BALB / c-musen som vår kontrollmus. Framtida tillämpningar av denna modell av DIH kommer att inkludera utveckling av knock hos möss utöver användningen av CRISPR-teknik för att avslöja tidigare okända mekanismer som är ansvariga för patogenesen av DIH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dr. Njoku vill erkänna Dr. Noel R. Rose, MD PhD, för hans vägledning och insiktsfulla diskussioner som resulterade i formuleringen av denna modell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J.
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V.
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
