Overekspression længe Noncoding RNA'er ved hjælp af gen-aktivering CRISPR
Summary
Traditionelle cDNA-baserede overekspression teknikker har en begrænset anvendelighed for overekspression af lange noncoding RNA’er på grund af deres flere splice formularer med potentielle funktionalitet. Denne revision rapporterer en protokol, ved hjælp af CRISPR teknologi til overexpress flere splice varianter af en længe noncoding RNA.
Abstract
Længe noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nyt og spændende forskningsfelt, med antallet af publikationer fra feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse undersøgelser har bekræftet, at lncRNAs er ændret i næsten alle sygdomme. Men at studere de funktionelle roller for lncRNAs i forbindelse med sygdom fortsat vanskelig på grund af den manglende proteinprodukter, væv-specifikke udtryk, lavt udtryk niveauer, kompleksiteten i splice former, og af bevarelse blandt arter. Givet den artsspecifikke udtryk, er lncRNA undersøgelser ofte begrænset til menneskelige forskning sammenhænge når man studerer sygdomsprocesser. Da lncRNAs funktion på molekylært niveau, er en måde at dissekere lncRNA biologi enten fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og foranstaltning cellulære virkningerne. I denne artikel præsenteres en skriftlig og visualiseret protokol til overexpress lncRNAs in vitro. Som en repræsentant eksperiment, er en lncRNA, der er associeret med inflammatorisk tarmsygdom, Interferon Gamma antisensstoffer 1 (IFNG-AS1), vist sig at være overexpressed i en Jurkat T-celle model. For at opnå dette, bruges den aktiverende grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) teknik til at aktivere overekspression på de endogene genomisk loci. Den aktiverende CRISPR teknik mål et sæt af transkriptionsfaktorer til webstedet transcriptional start af et gen, muliggør en robust overekspression af flere lncRNA splice formularer. Denne procedure vil blive opdelt i tre trin, nemlig a guide RNA (gRNA) design og vektor konstruktion, (ii) virus generation og transduktion, og (iii) koloni screening for overekspression. For denne repræsentant eksperiment, en større end 20-fold forbedring i IFNG-AS1 i Jurkat T-celler blev observeret.
Introduction
Mens mest biomedicinsk forskning har fokuseret på protein-kodning afskrifter, består fleste af transskriberede gener faktisk af noncoding RNA’er (Ensembl release 93). Aktuel forskning er begyndt at udforske dette område med antallet af publikationer om lncRNAs i sygdomsprocesser stiger eksponentielt mellem 2007 og 20171. Disse publikationer viser, at mange lncRNAs er forbundet med sygdommen. De molekylære mekanismer af disse lncRNAs er dog svært at studere på grund af deres forskellige funktioner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med oplysninger om betydningen af lncRNAs i sygdom, udtrykkes lncRNAs ofte på et lavere niveau end kodning RNA’er2. Derudover er lncRNAs dårligt bevaret, hvilket begrænser de funktionelle undersøgelser i human-celle-linje-baserede teknikker3. En metode til at studere mekanismen i disse roman gener er at endogent overexpress dem i kulturperler celler. Overekspression undersøgelser kan indeholde vigtige oplysninger om funktionen af specifikke gener og aktiverer forskere at dissekere centrale molekylære veje.
En ny metode til at aktivere omskrivning af lncRNA gener er baseret på CRISPR teknologi udviklet i starten af Gersbach laboratorium4. Denne protokol er blevet tilpasset til brug i lncRNA biologi og til udtryk for disse gener i andre modelsystemer. I CRISPR overekspression teknik, kan et protein kaldet CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) være rettet mod en DNA sekvens via en antisense gRNA, der genkendes af Cas9. Normalt, vil Cas9 fremkalde DNA kavalergang; men mutationer i Cas9, tidligere udviklet til overekspression teknik, deaktivere dette trin5. Når en transcriptional aktivator er sammenvoksede til en “død” Cas9 (dCas9) og transduced i cellelinjer, den endogene overekspression af lncRNAs kan være opnåede4,6. Tilføjelse af yderligere ændringer til gRNA, muliggør yderligere transcriptional faktorer til at binde til gRNA, øget effektivitet af dCas9 gen aktivisering ordning 10-fold7. Vigtigere, blev det påvist, at transcriptional aktivering kræver nærhed (< 200 bp) at det transkriptionel starte site gener, gør det muligt for en specifik Opregulering i gen-rige områder7. I modsætning til CRISPR knockout teknologier skal dCas9 og gRNA kassetter integreres i genom til cellerne til at bevare en overekspression over flere generationer. En metode til at opnå dette er at bruge lentiviruses til at integrere der indeholder dCas9 og gRNA kassetter. Efter integrationen, kan lncRNA Gen-ekspression bestemmes.
I denne artikel, vil blive demonstreret en protokol for lncRNA overekspression i en Jurkat T-celle model. En trinvis procedure er vist og kan også tilpasses vedhængende celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript præsenterer en protokol for at bruge aktivering CRISPR til overexpress lncRNAs in vitro. Dette er en specielt vigtig teknik, når man studerer længe noncoding RNA’er som transkriptom produkt er den funktionelle enhed. Efter overekspression, kan forskeren derefter bruge disse celler at øge signal / støj-forhold, når man studerer bindende partnere og endda måle cellulære konsekvenserne af øget niveauer af lncRNAs. Derudover som lncRNAs ofte handle på cis-gener, muliggør denne endogene overekspres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. understøttes af RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. understøttes af en Crohns & Colitis Foundation (CCFA) karriere udvikling award, kur: fordøjelsessystemet sygdomme Research Center (Morsø) DK41301, og UCLA klinisk og translationel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi core blev finansieret af Center for AIDS Research (CFAR) give 5P 30 AI028697. Den UCLA integreret Molekylær teknologier core blev støttet af kur/P30 give DK041301. Dette arbejde blev også støttet af UCLA AIDS Institute.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
