Summary

Che overexpressing lunghi non codificanti RNA utilizzando CRISPR Gene-attivante

Published: March 01, 2019
doi:

Summary

Tecniche tradizionali basati su cDNA sovraespressione hanno una limitata applicabilità per la sovraespressione di RNA lunghi non codificanti a causa del loro più moduli di giunzione con funzionalità potenziale. Questa revisione segnala un protocollo utilizzando la tecnologia CRISPR per overexpress più varianti di splicing di un RNA lunghi non codificante.

Abstract

Lungo non codificanti RNA (lncRNA) biologia è un nuovo ed eccitante campo di ricerca, con il numero di pubblicazioni da questo settore in crescita esponenziale dal 2007. Questi studi hanno confermato che lncRNAs sono alterati in quasi tutte le malattie. Tuttavia, studiando i ruoli funzionali per lncRNAs nel contesto della malattia rimane difficile a causa della mancanza di prodotti proteici, espressione tessuto-specifica, i livelli di espressione bassa complessità nelle forme della giuntura e mancanza di conservazione tra specie. Dato l’espressione specie-specifica, gli studi lncRNA sono spesso limitati ai contesti di ricerca umana quando lo studio dei processi di malattia. Poiché lncRNAs funzionare a livello molecolare, un modo di sezionare lncRNA biologia è di rimuovere il lncRNA o dei overexpress gli effetti cellulari lncRNA e misura. In questo articolo, è presentato un protocollo scritto e visualizzato in quel momento ai overexpress lncRNAs in vitro. Come un esperimento rappresentanza, un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, l’interferone Gamma antisenso 1 (IFNG-AS1), è indicato per essere sovraespresso in un modello di T-cellula di Jurkat. A tale scopo, l’attivazione tecnica regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster è possibile abilitare sovraespressione ai loci genomici endogeni. La tecnica d’attivazione di CRISPR si rivolge a un insieme di fattori di trascrizione per il sito di inizio trascrizionale di un gene, consentendo una robusta sovraespressione di molteplici forme di giuntura lncRNA. Questa procedura verrà essere suddivisi in tre passi, vale a dire (i) guida RNA (gRNA) progettazione e vettore di costruzione, (ii) virus generazione e trasduzione e screening (iii) Colonia per sovraespressione. Per questo esperimento rappresentanza, un maggiore di 20 volte aumento in IFNG-AS1 in cellule di T di Jurkat è stato osservato.

Introduction

Mentre la ricerca biomedica più è incentrato su trascrizioni di proteina-codificazione, la maggior parte dei geni trascritti in realtà consiste di RNA non codificanti (Ensembl rilascio 93). La ricerca attuale sta cominciando ad esplorare questo campo, con il numero di pubblicazioni su lncRNAs nei processi di malattia aumenta in modo esponenziale tra 2007 e 20171. Queste pubblicazioni dimostrano che molti lncRNAs sono associate con la malattia. Tuttavia, i meccanismi molecolari di questi lncRNAs sono difficili da studiare a causa di loro diverse funzioni rispetto al mRNA. Ad aggravare il problema della comprensione del ruolo di lncRNAs nella malattia, lncRNAs sono spesso espressi a livelli inferiori a codificazione RNAs2. Inoltre, lncRNAs sono mal conservati, che limita gli studi funzionali in umani-cell-linea-based tecniche3. Un metodo per studiare il meccanismo di questi nuovi geni consiste in modo endogeno iperesprimono li in cellule coltivate. Sovraespressione studi possono fornire le principali informazioni per quanto riguarda la funzione dei geni specifici e consentire ai ricercatori di sezionare vie molecolari chiave.

Un nuovo metodo per attivare la trascrizione dei geni di lncRNA si basa su tecnologie CRISPR sviluppati inizialmente da Gersbach laboratorio4. Questo protocollo è stato adattato per uso in biologia di lncRNA e per l’espressione di questi geni in altri sistemi-modello. In CRISPR che overexpressing tecnica, una proteina chiamata proteina CRISPR 9 (Cas9) può essere diretto verso una sequenza di DNA tramite una gRNA antisenso che viene riconosciuto da Cas9. Normalmente, Cas9 indurranno la fenditura del DNA; Tuttavia, mutazioni in Cas9, precedentemente sviluppato per la tecnica di sovraespressione, disattivare questo passaggio5. Quando un attivatore trascrizionale è fusa ad un “morto” Cas9 (dCas9) e trasformata in linee cellulari, la sovraespressione endogena di lncRNAs può essere raggiunto4,6. L’aggiunta di ulteriori modifiche per il gRNA, consentendo ulteriori fattori trascrizionali di associare il gRNA, aumentato l’efficacia del sistema di attivazione del gene di dCas9 10 volte7. D’importanza, è stato dimostrato che l’attivazione trascrizionale richiede vicinanza (< 200 bp) iniziare la trascrizione geni sito, consentendo un upregulation specifici in aree ricche di gene7. A differenza delle tecnologie di knockout CRISPR, dCas9 e gRNA cassette devono essere integrati nel genoma per consentire le cellule a mantenere una sovraespressione nel corso di più generazioni. Un metodo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare lentivirus per integrare le cassette contenenti dCas9 e gRNA. Dopo l’integrazione, l’espressione del gene di lncRNA può essere determinato.

In questo articolo, verrà dimostrato un protocollo per la sovraespressione di lncRNA in un modello di T-cellula di Jurkat. Una procedura dettagliata viene visualizzata e può essere adattata anche a cellule aderenti.

Protocol

Nota: È importante notare che questo protocollo usa lentivirus replica-carenti. Eseguire la gestione di virale solo dopo addestramento di sicurezza di laboratorio appropriati. Bleach tutti gli elementi e le superfici che vengono a contatto con virus vivi per un minimo di 10 min dopo la manipolazione. Uso una protezione monouso laboratorio di cappotto e viso e occhi, così come doppie guanti, in ogni momento. Eseguire lavori di virus in biosicurezza livello 2 + laboratori con certificazione virale. Dedic…

Representative Results

Un sistema di doppio vettore ai overexpress lncRNA IFNG-AS1L’esperimento di esempio in questo manoscritto è la sovraespressione di un sistema di modello di T-cellula di Jurkat esprimendo il lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 è un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, che è stato visto per regolare il Gamma interferone10. Il gene di IFNG-AS1 contiene tre varianti di splicing che tutti utilizzare lo stesso sito…

Discussion

Questo manoscritto presenta un protocollo per l’utilizzo di attivazione CRISPR per overexpress lncRNAs in vitro. Si tratta di una tecnica particolarmente importante quando si studia a lungo non codificanti RNA come il prodotto di trascrittomica è l’unità funzionale. Dopo sovraespressione, il ricercatore può, quindi, utilizzare queste cellule per aumentare il rapporto segnale-rumore quando lo studio partner di legame e anche misurare le conseguenze cellulari di aumento dei livelli di lncRNAs. Come lncRNAs frequentement…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.P. è supportato da DK60729 RO1 e P30 DK 41301-26. D.P. è supportato dal career development award di Crohn & colite Foundation (CCFA), cura: centro di ricerca Malattie Digestive (DDRC) DK41301 e UCLA clinica e traslazionale Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Il nucleo di virologia UCLA è stato finanziato dal centro di ricerca del AIDS (CFAR) concedere 5P 30 AI028697. Le tecnologie molecolari integrate di UCLA core è stato sostenuto dalla cura/P30 concedere DK041301. Questo lavoro è stato supportato anche dall’istituto UCLA AIDS.

Materials

Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
CaCl2 Sigma Aldrich C1016
cDNA synthesis kit (iScript) BioRad 1708891
dCas9 forward primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 
dCas9 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector Addgene 50918
DMEM Corning 10013CM
Ethanol Acros Organics 61509-0010
FBS Sigma Aldrich F2442
gRNA plasmid VectorBuilder VB180119-1195qxv
HEK293T cells ATCC  CRL-1573
HEPES Sigma Aldrich H3375
HPRT1 forward primer Integrated DNA Technologies n/a GACCAGTCAACAGGGGACAT 
HPRT1 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B Corning MT3024CR
Isopropanol Fisher Scientific BP2618-500
Jurkat cells ATCC  TIB-152 clone E6-1
L-glutamine Corning 25005Cl
LB agar Fisher Scientific BP1425-500
LB broth Fisher Scientific BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) Qiagen 12362
Na2HPO4 Sigma Aldrich NIST2186II
Optimem I reduced serum media  Gibco 31985070
p24 elisa Perkin Elmer NEK050B
PBS Corning 21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin Corning 30-002-Cl
pMDG2.G Addgene   #12259
pMDLg/pRRE Addgene  #60488
Poly-L-Lysine Sigma Aldrich P-4832
Polybrene EMD Millipore TR-1003
pRSV-REV Addgene #12253
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini) BioRad 7326820
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
SYBR green (iTaq universal) BioRad 1725122
Triton X-100 Sigma Aldrich X100

References

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Cite This Article
Rankin, C. R., Treger, J., Faure-Kumar, E., Benhammou, J., Anisman-Posner, D., Bollinger, A. E., Pothoulakis, C., Padua, D. M. Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR. J. Vis. Exp. (145), e59233, doi:10.3791/59233 (2019).

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