Overexpressing lang Noncoding RNAs med aktivering av Gene CRISPR
Summary
Tradisjonelle cDNA-baserte overuttrykte teknikker har et begrenset bruksområde for overuttrykte lang noncoding RNAs på grunn av skjemaene for flere skjøte med mulig funksjonalitet. Denne anmeldelsen rapporterer en protokoll bruker CRISPR teknologi for å overexpress flere skjøte-varianter av en lang noncoding.
Abstract
Lang noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nytt og spennende forskning, med antall publikasjoner fra dette feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse studiene bekrefter at lncRNAs er endret i nesten alle sykdommer. Studere funksjonsroller for lncRNAs i forbindelse med sykdom imidlertid vanskelig på grunn av mangel på protein produkter, vev-spesifikke uttrykk, lav uttrykk nivåer, kompleksiteten i skjøte former, og mangel på bevaring blant arter. Gitt artsspesifikke uttrykket, er lncRNA studier ofte begrenset til menneskelig forskning sammenhenger når studere sykdom prosesser. Siden lncRNAs fungerer på molekylært nivå, er en måte for dissekere lncRNA biologi å fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og måle mobilnettet effektene. I denne artikkelen presenteres en skriftlig og visualisert protokoll til overexpress lncRNAs i vitro. Som en representant eksperiment vises en lncRNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), å være overexpressed i en Jurkat T-celle modell. Dette brukes aktivering gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) teknikken til å aktivere overuttrykte på de endogene genomisk loci. Aktivere CRISPR teknikken mål en rekke transkripsjonsfaktorer til webområdet transcriptional starte med et muliggjør en robust overuttrykte flere lncRNA skjøte skjemaer. Denne fremgangsmåten vil deles inn i tre trinn, nemlig (i) guide RNA (gRNA) design og vektor konstruksjon, (ii) virus generasjon og signaltransduksjon og (iii) kolonien screening for overuttrykte. For dette representant eksperimentet, større enn 20-fold ekstrautstyr i IFNG-AS1 i Jurkat T celler ble observert.
Introduction
Mens mest biomedisinsk forskning har fokusert på protein-koding transkripsjoner, består fleste transkribert gener av noncoding RNAs (Ensembl release 93). Nåværende forskning begynner å utforske dette feltet med antallet publikasjoner om lncRNAs i sykdom prosesser øker eksponentielt mellom 2007 og 20171. Disse publikasjonene viser at mange lncRNAs er forbundet med sykdom. Molekylære mekanismer av disse lncRNAs er imidlertid vanskelig å studere på grunn av deres forskjellige funksjoner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med forståelsen av lncRNAs i sykdom, uttrykkes lncRNAs ofte på lavere nivåer enn koding RNAs2. I tillegg er lncRNAs dårlig bevart, som begrenser den funksjonelle studier i menneske-celle-linje-baserte teknikker3. En metode å studere mekanismen av disse romanen genene er å endogenously overexpress dem i kulturperler celler. Overuttrykte studier kan gi informasjon om funksjonen av bestemte gener og aktiverer forskere å dissekere nøkkel molekylær veier.
En ny metode for å aktivere Transkripsjonen til lncRNA gener er basert på CRISPR teknologi opprinnelig utviklet av Gersbach laboratorium4. Denne protokollen er tilpasset for bruk i lncRNA biologi og uttrykk for disse genene i andre modellsystemer. I CRISPR overexpressing teknikk, kan et protein som kalles CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) rettes mot en DNA sekvens via en antisense gRNA som gjenkjennes av Cas9. Normalt vil Cas9 indusere DNA cleavage; men deaktivere mutasjoner i Cas9, utviklet for det overuttrykte teknikken, denne trinn5. Når en transcriptional aktivator er sammensmeltet med en “dead” Cas9 (dCas9) og transduced i linjer, den endogene overuttrykte lncRNAs kan være oppnådd4,6. Tillegg av ytterligere modifiseringer å gRNA, slik at flere transcriptional faktorer å binde til gRNA, økte effekten av dCas9 genet aktiveringssystemet 10 ganger7. Viktigere, ble det vist at transcriptional aktivering krever nærhet (< 200 bp) den transcriptional start området gener, slik at en bestemt oppregulering i genet-rike områder7. I motsetning til CRISPR knockout teknologier må dCas9 og gRNA kassetter integreres i genomet slik at cellene å beholde en overuttrykte over flere generasjoner. Én metode for å oppnå dette er å bruke lentiviruses for å integrere dCas9 – og gRNA-inneholder kassettene. Etter integrasjon, kan lncRNA genuttrykk bestemmes.
I denne artikkelen, vil en protokoll for lncRNA overuttrykte i en Jurkat T-celle modell bli demonstrert. En fremgangsmåte vises og kan også tilpasses tilhenger celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet presenterer en protokoll for bruk aktivere CRISPR for å overexpress lncRNAs i vitro. Dette er en spesielt viktig teknikk når studere lang noncoding RNAs som transcriptomic produktet er funksjonell enhet. Etter overuttrykte, kan forskeren deretter bruke disse cellene for å øke signal-til-støy forholdet når studere bindende partnere og selv måle mobilnettet konsekvensene av økte nivåer av lncRNAs. I tillegg som lncRNAs ofte handle på cis-gener, kan denne endogene overuttrykte teknikken disse he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. støttes av RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. støttes av en Crohns og kolitt Foundation (CCFA) karriere development award, CURE: Digestive sykdommer Research Center (DDRC) DK41301, og UCLA kliniske og translasjonsforskning Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi kjernen ble finansiert av senter for AIDS Research (CFAR) gi 5P 30 AI028697. UCLA integrert molekylær teknologiene kjernen ble støttet av kur/P30 gi DK041301. Dette arbeidet ble også støttet av UCLA AIDS Institute.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
