Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie
Summary
Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.
Abstract
Exosomen und andere extrazelluläre Vesikel (EVs) sind molekulare Komplexe, die aus einem Lipidmembranvesikel, seiner Oberflächendekoration durch Membranproteine und anderen Molekülen und einem vielfältigen Luminalgehalt bestehen, der von einer übergeordneten Zelle geerbt wird, zu der RNAs, Proteine und DNAs. Die Charakterisierung der hydrodynamischen Größen von Elektrofahrzeugen, die von der Größe des Vesikels und seiner durch Oberflächendekorationen gebildeten koronalen Schicht abhängt, ist zur Routine geworden. Bei Exosomen, dem kleinsten EVs, ist der relative Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße signifikant. Die Charakterisierung von Vesikelgrößen durch die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM), eine Goldstandard-Technik, bleibt aufgrund der Kosten des Instruments, des für die Probenvorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse und eine kleine Anzahl von Partikeln, die häufig in Bildern beobachtet werden. Eine weit verbreitete und zugängliche Alternative ist die Atomkraftmikroskopie (AFM), die vielseitige Daten über dreidimensionale Geometrie, Größe und andere biophysikalische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel erzeugen kann. Das entwickelte Protokoll führt die Anwender bei der Nutzung dieses Analysetools und skizziert den Workflow für die Analyse von Elektrofahrzeugen durch den AFM, der die Probenvorbereitung für bildgebende Elektrofahrzeuge in hydratisierter oder ausgetrockneter Form, die elektrostatische Immobilisierung von Vesikel auf einem Substrat, Datenerfassung, deren Analyse und Interpretation. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Fixierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vorhersagbar und anpassbar ist und es dem Benutzer ermöglicht, Größenergebnisse für eine große Anzahl von Vesikeln zu erhalten. Die Vesikelgröße auf Basis der AFM-Daten stellte sich heraus, dass sie mit der Kryo-TEM-Bildgebung übereinstimmt.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen3, wie in Abbildung 1dargestellt.
Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.
Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung7. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.
Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer biologischen Flüssigkeit, Oberflächenscans und Bildanalysen sind die wesentlichen Schritte des entwickelten Protokolls zur AFM-Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Flüssigkeiten. Die Anzahl der Vesikel, die AFM-Bildwaagen mit der abgebildeten Oberfläche und der auf dem Substrat immobilisierten Oberflächenkonzentration der Vesikel zugänglich sind. Angesichts eines negativen Zeta-Potenzials von Elektrofahrzeugen und Exosomen18befürwort…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung der National Science Foundation (Preisnummer IGERT-0903715), der University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant und Graduate Research Fellowship Award) und des Skolkovo Institute of Science. technologie (Skoltech Fellowship).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
